L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

Il metodo qui descritto viene utilizzato per indurre la cascata di segnalazione apoptotica a passi definiti al fine di sezionare l'attività di una proteina effettrice batterica anti-apoptotica. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'espressione inducibile di proteine pro-apoptotiche o tossiche, o per l'interferenza di dissezione con altre vie di segnalazione.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'interferenza dei fattori di virulenza batterica con la segnalazione intracellulare. Ciò si ottiene stabilendo linee cellulari stabili, esprimendo la proteina di interesse Per studiare la sua attività a livello di cellule di massa come secondo passo, viene creato un sistema di vettori di espressione inducibile, che consente di attivare una cascata di segnalazione della cellula ospite a un passo definito. Successivamente, si analizzerà se la proteina di interesse può interferire con l'attivazione della cascata di segnalazione della cellula ospite al fine di restringere il punto di attività della proteina di interesse, i risultati mostrano che il fattore di virulenza giallo di Burnett KA B interferisce con la cascata apoptotica a valle dei dorsi e a monte dell'attivazione della cascata tre sulla base dell'analisi del western blotting.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia infettiva, come l'identificazione del passaggio chiave in una cascata di trasduzione del segnale in cui una data proteina effettrice batterica interferisce. Questo non solo ci aiuterà a capire meglio come i microrganismi patogeni manipolano i loro ospiti, ma anche come funzionano questi processi cellulari di base. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle strategie batteriche per prevenire la morte cellulare apoptotica, può anche essere applicato ad altri sistemi di trasduzione del segnale nel campo della morte cellulare, come l'on o la piroptosi, o anche alle reti di segnalazione coinvolte nella proliferazione cellulare, nella regolazione genica o nelle reazioni del sistema immunitario.

A dimostrare questa procedura sarà Stephanie Besler, una studentessa laureata del laboratorio del Mann. Inizia questa procedura seminando cellule HEK 2 93 che esprimono stabilmente GFP o GFP, diciamo B in un 12. Piastra a pozzetti con una densità di 100.000 celle per pozzetto.

Successivamente, preparare separatamente il reagente di trasfezione media del DNA e del polietilene in 75 microlitri di terreno opt e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per la formazione del complesso. Incubare entrambe le miscele insieme per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere la soluzione di DNA di polietilene goccia a goccia alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Cinque ore dopo la trasfezione, indurre l'espressione delle proteine pro apoptotiche aggiungendo un microgrammo per millilitro di doxiciclina al terreno di coltura. Quindi incubare le cellule per 18 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% al microscopio ottico. Ispezionare le cellule per l'induzione della morte cellulare prima del prelievo.

Esaminare le cellule apoptotiche indotte, che sono rilevabili dalla presenza di corpi apoptotici. Quindi, rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderenti. Una volta con PBS caldo, risospendere le cellule in 100 microlitri di due tamponi per campioni lamby.

Quindi riscaldare per cinque minuti a 95 gradi Celsius e per un uso successivo conservare a meno 20 gradi Celsius in seguito. Successivamente, caricare sei microlitri di una scala proteica commerciale come marcatore di peso molecolare. Quindi caricare circa 40.000 cellule per campione su un gel di pagina SDS al 12%.

Far funzionare i gel in un sistema di elettroforesi su gel a una tensione costante di 180 volt per 45-60 minuti con un tampone in esecuzione x laly. Successivamente, BLO le proteine su membrane PVDF a una tensione costante di 16 volt per 60 minuti. Utilizzando una cella di trasferimento semi-secca trans blot SD, quindi bloccare le membrane in 10 millilitri di MPT per un'ora a temperatura ambiente.

Diluire sette microlitri di anticorpo anti PARP scisso in sette millilitri di MPT. Incubare la membrana in PVDF con la soluzione anticorpale per una notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere la soluzione anticorpale ed eseguire tre lavaggi di 10 minuti con PBS 0,05%Tween 20, incubare le membrane con 1,4 microlitri di anticorpi secondari coniugati perossidasi di rafano diluiti in sette millilitri di MPT per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Lavare le membrane tre volte con PBS 0,05%Tween 20, rilevare l'attività della perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. E applicare attrezzature standard per lo sviluppo di film per visualizzare le bande proteiche. Quindi rimuovere gli anticorpi legati incubando le membrane con sette millilitri di tampone di stripping western blot per 30 minuti a temperatura ambiente dopo tre lavaggi con PBS 0,05%Tween 20, sondare le membrane con quattro microlitri di anticorpo anti actina in quattro millilitri di MPT durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, eseguire tre fasi di lavaggio di 10 minuti sulle membrane con circa 10 millilitri di PBS 0,05%Tween 20, quindi incubare le membrane con 1,4 microlitri di anticorpi secondari coniugati perossidasi di rafano diluiti in sette millilitri di MPT Dopo un'ora di incubazione a temperatura ambiente. Lavare le membrane tre volte con PBS 0,05%Tween 20, rilevare l'attività della perossidasi di rafano con un kit commerciale e applicare apparecchiature standard per lo sviluppo di film per visualizzare i divieti proteici. In questo esperimento, i lisati di cellule intere di HEK 2 93 GFP e HEK 2 93 GFP sabe sono stati immunosangue per far sì che la GFP mostrasse un'espressione stabile.

L'analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule sabe HEK 2 93 GFP e HEK 2 93 GFP mostra l'intensità dell'espressione della GFP. Le cellule sabe HEK 2 93 GFP e HEK 2 93 GFP sono state trattate con quattro sporine micromolari per sei ore per indurre l'apoptosi intrinseca. L'apoptosi è stata analizzata mediante analisi immuno blot PARP scissa in cui è stato riscontrato che la scissione PARP diminuisce nelle cellule HK 2 9 3 GFP SA B rispetto alle cellule HK 2 93 GFP.

CB protegge dall'apoptosi indotta da bax, ma non dall'apoptosi indotta da tre caspasi. Durante l'implementazione di questa procedura, è importante sondare il maggior numero possibile di componenti della via di segnalazione per aiutare a identificare la fase di interazione. È anche utile testare le proteine che sono attivate sia nel loro stato fondamentale che in quello attivato per determinare se la proteina effettrice scelta interferisce con la via stessa, o meglio con la fase di attivazione che segue questa procedura.

Altri metodi, come il knockdown, il lievito knockout, due ibridi pull down, la modifica post-traduzionale o i saggi di stabilità proteolitica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio: quali sono gli esatti meccanismi molecolari che questi effettori microbici impiegano per manipolare la normale fisiologia della cellula ospite? E in che modo questo giova alla sopravvivenza e alla diffusione degli agenti patogeni.