L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'interferenza dei fattori di virulenza batterici con la segnalazione intracellulare. Questo viene raggiunto generando linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse. Per studiarne l'attività a livello cellulare complessivo come secondo passaggio, viene creato un sistema vettoriale ad espressione inducibile, che permette di attivare una cascata di segnalazione nella cellula ospite in un punto definito. Successivamente, verrà analizzato se la proteina di interesse può interferire con l'attivazione della cascata di segnalazione nella cellula ospite, al fine di restringere il punto di azione della proteina di interesse. I risultati mostrano che il fattore di virulenza Cozy Yellow Burnett KAB interferisce con la cascata apoptotica a valle di Backs e a monte dell'attivazione della cascata tre, sulla base di un'analisi mediante western blotting.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia infettiva, ad esempio identificando il passaggio chiave in una cascata di trasduzione del segnale in cui una specifica proteina effettrice batterica interferisce. Questo non solo ci aiuterà a comprendere meglio come i microrganismi patogeni manipolino i loro ospiti, ma anche come funzionino questi processi cellulari di base. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle strategie batteriche per prevenire la morte cellulare apoptotica, può essere applicato anche ad altri sistemi di trasduzione del segnale nel campo della morte cellulare, come l'oncitosi o la pirosi, oppure a reti di segnalazione coinvolte nella proliferazione cellulare, nella regolazione genica o nelle risposte del sistema immunitario.

La procedura sarà dimostrata da Stephanie Besler, studentessa laureata del laboratorio di Mann. Iniziare la procedura seminando cellule HEK 293 stabilmente trasfettate con GFP o GFP, ad esempio B, in una piastra a 12 pozzetti a una densità di 100.000 cellule per pozzetto.

Successivamente, preparare separatamente il DNA e il reagente di trasfezione a base di polietilene in 75 microlitri di mezzo opt, quindi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per la formazione del complesso. Incubare entrambe le miscele insieme per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere la soluzione di DNA con polietilene goccia a goccia sulle cellule e incubare a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%.

Cinque ore dopo la trasfezione, indurre l'espressione delle proteine pro-apoptotiche aggiungendo un microgrammo per millilitro di doxiciclina al mezzo di coltura. Successivamente, incubare le cellule per 18 ore a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% sotto il microscopio ottico. Ispezionare le cellule per verificare l'induzione della morte cellulare prima del prelievo.

Esaminare le cellule apoptotiche indotte, rilevabili mediante la presenza di corpi apoptotici. Successivamente, rimuovere il soprannatante e lavare le cellule aderenti. Una volta con PBS caldo, risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer campione 2x lamby.

Quindi riscaldare per cinque minuti a 95 gradi Celsius e, per un uso successivo, conservare a meno 20 gradi Celsius in seguito. Successivamente, caricare sei microlitri di un marcatore commerciale di peso molecolare (ladder proteico). Quindi caricare circa 40.000 cellule per campione su un gel SDS-PAGE al 12%.

Eseguire l'elettroforesi su gel in un sistema di elettroforesi sottovuoto a una tensione costante di 180 volt per 45-60 minuti con un x laly running buffer. Successivamente, trasferire le proteine su membrane in PVDF a una tensione costante di 16 volt per 60 minuti. Utilizzando una cella di trasferimento semisecco Trans Blot SD, bloccare quindi le membrane in 10 millilitri di MPT per un'ora a temperatura ambiente.

Diluire sette microlitri di anticorpo anti-PARP clivato in sette millilitri di MPT. Incubare la membrana in PVDF con la soluzione anticorpale tutta la notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere la soluzione anticorpale ed eseguire tre lavaggi di 10 minuti ciascuno con PBS 0,05% Tween 20; dopo l'incubazione, incubare le membrane con 1,4 microlitri di anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP), diluiti in sette millilitri di MPT, per un'ora a temperatura ambiente.

Lavare le membrane tre volte con PBS 0,05% Tween 20, rilevare l'attività della perossidasi del ravanello in base al protocollo del produttore utilizzando un kit commerciale. Utilizzare quindi l'equipaggiamento standard per lo sviluppo della pellicola al fine di visualizzare le bande proteiche. Rimuovere successivamente gli anticorpi legati incubando le membrane con sette millilitri di buffer per stripping del western blot per 30 minuti a temperatura ambiente dopo tre lavaggi con PBS 0,05% Tween 20, quindi sottoporre le membrane a sonda con quattro microlitri di anticorpo anti-actina in quattro millilitri di MPT per tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, eseguire tre passaggi di lavaggio di 10 minuti ciascuno sulle membrane con circa 10 millilitri di PBS 0,05% Tween 20, quindi incubare le membrane con 1,4 microlitri di anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) diluiti in sette millilitri di MPT per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le membrane tre volte con PBS 0,05% Tween 20, rivelare l'attività della perossidasi di rafano utilizzando un kit commerciale e applicare un'attrezzatura standard per lo sviluppo della pellicola al fine di visualizzare le bande proteiche. In questo esperimento, i lisati cellulari totali di cellule HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe sono stati sottoposti a immunoblotting per GFP per dimostrare l'espressione stabile.

L'analisi rappresentativa mediante citometria a flusso di cellule HEK 293 GFP e cellule HEK 293 GFP sabe mostra l'intensità dell'espressione di GFP. Le cellule HEK 293 GFP e le cellule HEK 293 GFP sabe sono state trattate con quattro micromolar di sporina per sei ore per indurre l'apoptosi intrinseca. L'apoptosi è stata analizzata mediante immunoblot per PARP clivata, in cui si è osservato un decremento del clivaggio di PARP nelle cellule HK 293 GFP SA B rispetto alle cellule HK 293 GFP.

CB protegge dall'apoptosi indotta da bax, ma non dall'apoptosi indotta da caspasi tre. Durante l'applicazione di questa procedura, è importante analizzare il maggior numero possibile di componenti della via di segnalazione per aiutare a identificare il passaggio di interazione. È inoltre consigliabile testare le proteine attivate sia nei loro stati basale che attivo per determinare se la proteina effettore scelta interferisce con la via stessa o piuttosto con il passaggio di attivazione successivo a questa procedura.

Altri metodi come il silenziamento genico, il knockout, il lievito two-hybrid, il pull-down, la modificazione post-traduzionale o i saggi di stabilità proteolitica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: quali sono i meccanismi molecolari esatti che questi effettori microbici utilizzano per manipolare la fisiologia normale della cellula ospite? E in che modo ciò favorisce la sopravvivenza e la disseminazione del patogeno.