Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Sommario

I microRNA umani traslocano dagli eritrociti dell'ospite ai parassiti Plasmodium falciparum. Qui vengono descritte le tecniche utilizzate per trasfettare i microRNA sintetici negli eritrociti dell'ospite e isolare tutti gli RNA da P. falciparum. Inoltre, questo articolo descriverà in dettaglio un metodo di isolamento dei polisomi in P. falciparum per determinare l'occupazione ribosomiale e il potenziale traduzionale dei trascritti dei parassiti.

Abstract

La variazione genetica responsabile per l'allele falciforme (HbS) consente eritrociti di resistere alle infezioni da parte del parassita della malaria, P. falciparum. La base molecolare di tale resistenza, che è noto per essere multifattoriale, rimane completamente compresa. Recenti studi hanno trovato che l'espressione differenziale dei microRNA eritrocitari, una volta traslocati in parassiti della malaria, influenza sia regolazione genica e la crescita del parassita. Questi miRNA sono stati successivamente dimostrato di inibire la traduzione dell'mRNA formando un RNA trascritto chimerico con 5 'RNA fusione con sottoinsiemi discreti mRNA parassita. Qui, le tecniche che sono state utilizzate per studiare il ruolo funzionale e putative meccanismo sottostante microRNA eritrocitari sulla regolazione genica e il potenziale di traslazione del P. falciparum, compresa la trasfezione dei microRNA sintetici modificati negli eritrociti di accoglienza, sarà dettagliato. Infine, un metodo polysome gradiente è utilizzato per determinare il grado di Translation di queste trascrizioni. Insieme, queste tecniche hanno permesso di dimostrare che i livelli di microRNA sregolati eritrocitari contribuiscono alla cella-intrinseca resistenza della malaria di eritrociti falciformi.

Introduzione

La malaria, causata da parassiti Apicomplexa del genere Plasmodium, è la malattia parassitaria umana più comune, infettando il mondo circa 200 milioni di persone ogni anno e provocando circa 600.000 morti ^1. Delle cinque specie di Plasmodium che infettano gli esseri umani, il più rilevante per le malattie umane sono P. falciparum e P. vivax, a causa delle loro distribuzioni diffuse e il potenziale di gravi complicazioni di malaria. Il ciclo di vita del parassita della malaria richiede infezione di zanzare e gli esseri umani sia. Quando una zanzara infetta morde un essere umano, i parassiti viaggiano attraverso il flusso ....

Protocollo

1: Isolamento di RNA di piccole dimensioni da P. falciparum Durante l'IDC

1. Ottenere i parassiti della malaria nella cultura asessuata ^29.
   NOTA: La dimensione culturale necessaria varierà in base alla applicazione desiderata; tuttavia, una cultura 10 ml al 3-5% parassitemia e 5% ematocrito offre ampio RNA per PCR in tempo reale (RT-PCR). La tecnica è stata inizialmente ottimizzato per le culture asincrone, ma quando si desiderano punti temporali specifici durante il ciclo di infezione, parassiti anello-stage può essere sincronizzato da sincronizzazione sorbitolo entro e non oltre 10-12 ore dopo l'invasione. La sincronizzazi....

Risultati

Profilazione globale di microRNA umana in P. falciparum

Le tecniche qui presentate sono stati usati per estrarre microRNAs parassitari in una varietà di condizioni. Una cosa da notare è che le estrazioni di RNA per i globuli rossi infetti sono stati effettuati, come indicato ^nel 32, che spesso serviva come punto di riferimento per i dati microRNA presentati sia in questo articolo e lo studio originale ^29. Tali studi precedenti hanno anche dimostrato ch.......

Discussione

HBS è una delle varianti di emoglobina più comuni in aree endemiche malaria, principalmente perché fornisce protezione contro la malaria causata da P. grave falciparum. Le tecniche necessarie per caratterizzare il ruolo di microRNA umano nella regolazione genica di P. falciparum sono dettagliate nel corso di questo manoscritto. Estraendo RNA totale in modo tale da includere tutti i piccoli RNA, ed eseguendo una procedura parassita lisi relativamente semplice, questi RNA fusione potevano essere.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTI-Tutti i reagenti devono essere privi di RNAsi.
Pirocarbonato di dietil	Sigma	D5758	DEPC
Acqua trattata con DEPC (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
Yoyo-1 Colorante fluorescente DNA	Thermo Fisher
Gene Pulser II elettroporatore	Bio-Rad
0,2 cm Cuvette
4 M acetato di potassio	Mallinckrodt	6700
2 M potassio HEPES	Sigma	H0527	pH 7,2
1 M acetato di magnesio	Sigma	M-2545
1 M ditiotreitolo	Research Products International	D11000	DTT
100 mM fenilmetilsolfonato fluoruro	Sigma	P7626	PMSF, disciolto in isopropanolo
10% (v/v) Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
10% (p/v) sodio desossicolato	Sigma	D-6750	DOC
Cicloesimide	Sigma	C-7698	CHX
Saccarosio	Mallinckrodt	8360-04
RNAseOUT (Invitrogen, cat. n. 100000840)	Invitrogen
RPMI-1640 con L-glutammina	Cellgro	10-040-CV
10% AlbuMAX I	Invitrogen	11020-039	p/v in acqua sterile
Gentamicina	Gibco	15750-060
HT integratore (100x) (Invitrogen, cat. n. 11067030)
45% (p/v) saccarosio (Sigma, cat. n. G8769)
1 tampone HEPES M (Gibco, n. cat. 15630-080)
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; Cellgro, cat. n. 2109310CV)
Pallone filtrante sottovuoto Corning 500 ml (VWR, n. cat. 430769)
Vetrini (VWR, n. cat. 48311-702)
Colorazione Giemsa (50X) (VWR, n. cat. m708-01)
Kit di isolamento miRNA mirVana (Ambion, ThermoFisher Scientific).
5' MiRNA maturo coniugato con biotina (la sequenza varia in base al miRNA di interesse) (Dharmacon)
Biotina in polvere (Sigma-Aldrich)
1 M Cloruro
Streptavidina Sefarosio High Performance Beads (GE Healthcare)
Tampone di risospensione ribosomiale (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
Tampone di lisi (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)Soluzione
a gradiente di saccarosio al 15% (p/v) (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
a gradiente di saccarosio al 50% (p/v) (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
Cuscino di saccarosio 0,5 M (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)Soluzione
di inseguimento di saccarosio al 60% (p/v) (vedi CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
Terreni di coltura cellulare di plasmodio (vedere CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
Buffer di lavaggio per cattura dell'RNA (vedere CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI)
Buffer di eluizione dell'RNA (vedere CONFIGURAZIONE DEI REAGENTI
CONFIGURAZIONE REAGENTI
Solutions
Plasmodium terreni di coltura cellulare
500 ml RPMI-1640 con L-glutammina
0,5 ml gentamicina
5 ml integratore
2,5 ml 45% glucosio
25 ml 10% AlbuMAX I
12,5 ml 1 M HEPES
Filtro sterile con pallone filtrante sottovuoto da 0,2 mm.
Terreni di coltura cellulare di Plasmodium contenenti 10x CHX
Stessa ricetta dei terreni di coltura cellulare Plasmodium sopra, con l'aggiunta di:
2 mM cicloesimide
Il terreno viene preparato normalmente, quindi aggiungere CHX a una concentrazione finale di 2 mM e filtrare.
1x PBS contenente cicloesimide
La cicloesimide viene aggiunta fresca a 1x PBS fino a una concentrazione finale di 200 mM e mantenuta a 4 OC fino all'uso.
Tampone di risospensione ribosoma
400 mM acetato
25 mM HEPES di potassio, pH 7,2
15 mM acetato
200 mM cicloesimide (aggiungere fresco)
1 mM DTT (aggiungere fresco)
1 mM PMSF (aggiungere fresco)
40 U/ml RNaseOUT (aggiungere fresco)
Tampone di lisi
Stessa ricetta del tampone di risospensione ribosomiale sopra, con l'aggiunta di:
1% (v/v) Igepal CA-630
0,5% (p/v) DOC
forte>Soluzioni di saccarosio
Stessa ricetta del tampone di risospensione ribosomiale sopra, con l'aggiunta di quantità variabili di saccarosio:
15% (p/v) di saccarosio per ottenere una soluzione
gradiente di saccarosio al 15%50% (p/v) di saccarosio per ottenere una soluzione
saccarosio 0,5 M per creare un cuscino
Come sopra, è necessario aggiungere fresco cicloesimide, DTT, PMSF e RNaseOUT.
La soluzione di inseguimento del saccarosio al 60% richiede solo saccarosio e acqua, nessun altro componente
60% (p/v) di saccarosio in acqua trattata con DEPC per produrre il 60% di soluzione
RNA Capture Wash Buffer
20 mM  KCl
5 unità/ml Rnase Out (Invitrogen)
RNA Capture Elution Buffer
Stessa ricetta del RNA Capture Wash Buffer, con l'aggiunta di:
2 mM Biotina
EQUIPMENT
SW55 Rotore per ultracentrifuga Ti (Beckman, n. cat. 342194)
Rotore per ultracentrifuga SW41 Ti (Beckman, n. cat. 331362)Ultra-Clear
TM ½ x 2 pollici (13 x 51 mm) per ultracentrifuga SW55 (Beckman, n. cat. 344057)
Poliallomero 9/16 x 3 ½ in provette per ultracentrifuga (14 x 89 mm) per SW41 (Beckman, cat. n. 331372)
Ultracentrifuga L8-80M (Beckman)
Ago per siringa smussato in acciaio, 4 pollici, 16 G (Aldrich, cat. n. Z261378)Siringa
da 1 ml con 27 G½ ago (Becton Dickinson, cat. n. 309623)
Siringa da 5 ml (Becton Dickinson, cat. n. 309646)
Parafilm
Rotatore di provette, microcentrifuga end-over-end
, refrigerata
Sistema di frazionamento a gradiente di densità (Teledyne Isco, n. cat. 69-3873-179)
TracerDAQ (Measurement Computing)
Centrifuga Eppendorf 5810R
Rotore Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, n. cat. 022638807)

per elettroporazione100000840di potassioSoluzione )HTdi potassiodi magnesio<di gradiente di saccarosio al 50%di saccarosio 0,5 M di inseguimento di saccarosio