Utilizzando Ex Vivo Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

La rigenerazione di organi in vivo nell'uomo è molto limitata; di conseguenza, l'ingegneria dei tessuti, lo sviluppo di tessuti e organi da cellule individuali donati da un host, sta diventando una terapia potenziale interessante per la sostituzione degli organi. Tuttavia, per questa strategia terapeutica per avere successo, i fattori e le interazioni cellulari coinvolti nella morfogenesi dell'organo devono essere accuratamente studiati e ben compresi. A causa della incapacità di studiare lo sviluppo di organi specifici con approcci tradizionali, i ricercatori si sono rivolti a embrione intero alternativa o intere culture d'organo. Kalaskar et al. ¹ hanno dimostrato che ex vivo cultura tutto l'embriogenesi produce risultati comparabili (nel 58% degli embrioni coltivati) per lo sviluppo nell'utero, suggerendo che ex vivo metodi di coltura sono un'alternativa fattibile per gli studi dell'organogenesi.

Un sistema di coltura organo individualizzato, come questo ex vivo droplet sistema di coltura, consente intera analisi organo indipendente dagli effetti sistemici, pur consentendo manipolazione di un percorso di segnalazione specifica o interazioni cellulari tramite aggiunta di reagenti farmacologici o anticorpi. Tradizionalmente, lo studio di sviluppo degli organi fetali è stata limitata alle tecnologie transgeniche e di topi knockout, in aggiunta ai reagenti farmacologici consegnati materna. Tuttavia, ci sono questioni tecniche che coinvolgono queste tecniche e trattamenti in vivo; la maggior parte delle preoccupazioni ruotano attorno gli effetti di influenzare vari organi contemporaneamente che spesso si traduce in letalità embrionale. Un ulteriore problema degli studi di manipolare sviluppo fetale farmacologicamente è l'effetto materno di farmaci in sviluppo embrionale in utero (ad esempio, il metabolismo materno della droga prima che raggiunga l'embrione) e se tali reagenti possono passare attraverso la barriera placentare.

La tecnica di tutta la cultura organo descrittaqui è stato adattato da un primo protocollo descritto da Maatouk et al. ^2, in cui interi gonadi fetali sono incubati in ex vivo culture gocciolina verticali. Un vantaggio significativo di coltura gonadi fetali è che gli inibitori piccole molecole possono facilmente accedere tutto l'organo per semplice diffusione. . DeFalco et al hanno dimostrato che utilizzando questo metodo ex vivo gocciolina cultura in combinazione con inibitori di piccole molecole può essere usato per studiare processi e interazioni che avvengono durante lo sviluppo delle gonadi ³ segnalazione; questi processi sarebbe difficile per esaminare in vivo a causa di problemi tecnici (ad esempio, il passaggio dei farmaci attraverso la placenta o letalità di incidere più organi che utilizzano approcci genetici e farmacologici).

La cultura gocciolina non è solo un miglioramento in alcuni aspetti oltre in utero sperimentazione, ma anche che è un miglioramento rispetto in vitro ed ex visistemi vo pure. L'uso di linee cellulari per studiare morfogenesi è estremamente difficile perché mancano i tipi cellulari diversi, mancano matrice extracellulare (ECM) componenti critici che permettano la formazione di architettura organo, e può esibire effetti in cascate di segnalazione. Anche se l'ingegneria dei tessuti ha introdotto notevoli miglioramenti nella creazione di ponteggi che simulano ECM, la mancanza di conoscenza per quanto riguarda i segnali che sono richieste da ogni tipo di cellula durante l'organogenesi rende difficile costruire un sistema di organi in vitro. Altri sistemi ex vivo sono stati precedentemente stabiliti per studiare organogenesi, o più specificamente morfogenesi, e hanno avuto molto successo per l'imaging dal vivo di organi fetali in agar ^4, transwells ^5, filtri ^{6 e} altre matrici ponteggio ^7,8. Il vantaggio del sistema di coltura goccia è che permette lo studio della morfogenesi, fornendo la capacità di utilizzare meno reattivi, che sono oFten costoso, ma dando anche la tensione superficiale organo, che è importante per la crescita e di segnalazione capacità ^9.

Nel topo, del testicolo morfogenesi iniziale si svolge tra embrionale (E) mette in scena E11.5 e E13.5; queste fasi comprendono la finestra temporale ottimale per l'esame i fattori che influenzano la differenziazione sesso-specifici. Tra i processi critici che si verificano durante la formazione del testicolo sono la generazione dell'architettura cavo testicolo e la formazione di una rete vascolare specifico testicolo. Utilizzando questo ex vivo tutto l'organo sistema di coltura gocciolina, si è in grado di alterare vascolarizzazione maschio-specifica e inibire testicolo morfogenesi attraverso l'uso di un inibitore piccola molecola che blocca l'attività dei recettori per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF); VEGF-mediata rimodellamento vascolare è fondamentale per lo sviluppo del testicolo ^10-12. Questa tecnica può essere applicata con successo ad altri organi e può bersagliare tempo specificofinestre di sviluppo. Whole-mount di imaging organo permette la visualizzazione di strutture vitali così come i cambiamenti strutturali e cellulari conseguenti alla somministrazione di vari inibitori. È importante sottolineare che questo sistema è vantaggioso in quanto il ricercatore può ignorare i potenziali effetti confondenti di somministrazione del farmaco materna o interruzione sistemico durante vivo strategie genetiche in mirate. Quindi, tutto questo organo ex vivo sistema di coltura delle gocce può migliorare significativamente la capacità di comprendere le interazioni e le segnalazioni che si verificano in particolare all'interno di particolari organi durante lo sviluppo fetale.

Tutti i topi utilizzati in questi studi erano topi CD-1 ottenuti da Charles River Laboratories. Cultura Precedenti esperimenti sono stati eseguiti su altri ceppi, quali C57BL / 6J (dati non mostrati), ma qualsiasi ceppo può essere utilizzato. Femmine adulte in stato di gravidanza sono stati di circa 2-3 mesi di vita e sono stati sacrificati tramite CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale e toracotomia bilaterale prima della rimozione embrione. I topi sono stati alloggiati in conformità alle linee guida NIH, e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale di Hospital Medical Center di Cincinnati per bambini.

1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti

1. Preparare una soluzione di etanolo al 70%. Acqua deionizzata Autoclave (per fare camere umidificati e per rendere / soluzioni diluizione). Sterilizzare strumenti di dissezione (pinze, forbici, e 27 G siringhe ad ago) a spruzzo verso il basso con il 70% di etanolo.
2. Preparare10X tampone fosfato salino (PBS) contenente calcio e magnesio (80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na ₂ HPO _4, 2,4 g KH ₂ PO _4, 6,75 ml di 1 M CaCl _2, 3,75 ml di 1 M MgCl ₂ ). Mescolare per sciogliere in 1 l di acqua in autoclave sterile e poi filtrare con carta da filtro. Diluire 10 volte con acqua per fare PBS 1X.
3. Calore inattivare siero fetale bovino (FBS), a 55 ° C per 30 min e filtro sterilizzare con un filtro a siringa da 0,22 micron.
4. Preparare 38 ml 1X terreno di coltura completo (chiamato completo DMEM, cDMEM), costituito da Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 10% filtrato diluizione inattivato al calore FBS e 1/100 di penicillina streptomicina magazzino. Questo di solito deve essere usato fresco, ma può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
5. Ricostituire il VEGFR tirosina chinasi Inhibitor II (TKI II) in DMSO per una concentrazione scorta di 5 mg / ml, e diluire azione con cDMEM per ottenere una soluzione di lavoro. L'aria finalecentrazione per questo studio è 1.875 mg / ml in cDMEM. Secondo le raccomandazioni della società, soluzioni madre sono stabili per un massimo di 6 mesi a -20 ° C. Per quanto riguarda le soluzioni di lavoro, fare fresco e utilizzare lo stesso giorno.
   Nota: La concentrazione di questo farmaco nella soluzione di lavoro dovrebbe essere due volte superiore alla concentrazione finale desiderata (dal momento che sarà diluito duplice in droplet). Allo stesso tempo, preparare lo stesso volume di cDMEM contenente lo stesso volume di DMSO per il trattamento "controllo".
6. Preparare i reagenti coda digestione (NaOH 50 mM e 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) separatamente in acqua distillata.
7. Fare un bilancio dei primer XY PCR 25 micron (XY Forward 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'e XY Reverse 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') insieme in acqua priva di nucleasi.
8. Preparare tampone 50X TAE (242 g Trizma Base, 57,1 ml acido acetico glaciale, 100 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,5, e aggiungere acqua per 1 L fiil volume finale). Preparare 1X tampone di corsa TAE (20 ml 50X TAE diluito con acqua a 1 L volume totale).
9. Per creare una soluzione di 2,5% di agarosio (0,625 g di agarosio, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml di acqua), soluzione di agarosio calore nel forno a microonde fino a ebollizione, poi lasciate raffreddare fino a circa 55-65 ° C (in grado di toccare). Una volta fredda, aggiungere 2 ml di 1% soluzione di bromuro di etidio, e versare il gel.
   ATTENZIONE! Etidio bromuro è un agente mutageno e teratogeno; si prega di utilizzare guanti di nitrile e corretto protocollo di sicurezza durante la manipolazione. In alternativa, possono essere utilizzati altri agenti gel risolvere potenzialmente meno tossici o coloranti.
10. Preparare la soluzione di saturazione (PBS con Triton X-100, siero 0,1% 10% fetale bovino [FBS], e il 3% di albumina sierica bovina [ASC]) per immunofluorescenza.
11. Preparare la soluzione di lavaggio (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% FBS e 3% BSA) per immunofluorescenza.
12. Preparare PBTx (PBS con 0,1% Triton X-100) per immunofluorescenza.
13. Preparare le camere di incubazione per culture. Riempire grandi piatti (diametro 100 mm) di Petri con 35 ml di acqua in autoclave. Posizionare vicino a dove saranno eseguite dissezione e culture.

2. Isolamento di fetale testicoli da Mus musculus

1. Controllare il mouse femminile per tappi vaginali ogni mattina. Mezzogiorno del giorno in cui viene rilevato il tappo vaginale è considerato E0.5. Eutanasia la femmina incinta mouse E11.5, in modo coerente con i protocolli animali approvati.
2. Spray giù addome del mouse con il 70% di etanolo.
3. Aprire la pelle del ventre e del peritoneo con un'incisione a forma di V con le forbici fini e tirare indietro lembo di tessuto per esporre gli organi interni.
4. Individuare le ovaie ad entrambe le estremità del corno uterino. Utilizzando le forbici, tagliare a dell'ovaio e del tessuto connettivo di separare l'utero contenente gli embrioni dal corpo della madre.
5. Aprire la parete uterina tagliando delicatamente il lato opposto della placenta, esponendo i sacchi di tuorlo. Essere attenti a non puncture sacco vitellino per evitare embrioni danneggiare o perdere.
6. Tagliare vicino alla placenta per rimuovere le sacche tuorlo-embrione contenente e metterli in un piatto contenente PBS con calcio e magnesio. La presenza di ioni calcio e magnesio contribuirà a molecole di adesione cellula di sostegno per mantenere l'architettura dei tessuti e prevenire il tessuto di attaccarsi agli strumenti di dissezione.
7. Con una pinza, togliere il sacco vitellino e amnion dall'embrione perforando con attenzione il sacco vitellino di creare un buco in cui l'embrione può scivolare fuori. Una volta che l'embrione è all'esterno del sacco vitellino, tagliare il cordone ombelicale.
8. Da questo punto in avanti, utilizzare un microscopio situato in una cappa coltura tissutale sterili. Togliere la testa di embrione e scartare pizzicando con una pinza su entrambi i lati del collo.
9. Rimuovere la coda e riporre in nuova provetta per l'analisi PCR XY per determinare il sesso dell'embrione.
   Nota: Mentre è ottimale per gonadi coltura più presto possibile dopo la raccolta, è anche posbile togliere DNA coda ed eseguire XX / XY genotipizzazione prima coltura, in modo che il sesso di ciascun embrione è nota e solo il sesso desiderato deve essere coltivato. Mentre la genotipizzazione è stato fatto, gli embrioni possono essere tenuti separati (in modo che possano essere seguiti) a 4 ° C o in ghiaccio fino al momento per la cultura. Un avvertimento è che questo periodo al di fuori delle condizioni di utero o di coltura può potenzialmente influenzare la vitalità della cultura o successivo sviluppo durante la coltura.
10. Fissare l'embrione in posizione supina contro il fondo del piatto cultura appuntando le ascelle di embrione con un paio di pinze (solitamente il forcipe tenuto in mano debole). Mantenere queste pinze in atto per tenere l'embrione ancora durante l'intero processo di dissezione.
11. Con altro paio di pinze, togliere la pelle che copre l'addome e rimuovere delicatamente il fegato, l'intestino e altri organi per esporre parete posteriore del corpo.
12. Come gonadi saranno situati sulla parete di fondo del corpo su entrambi i lati della aorta dorsale,un grande vaso sanguigno che corre lungo la linea mediana del corpo, paletta sotto la cresta urogenitale con una pinza chiuse e rimuovere la cresta urogenitale aprendo le pinze e sollevandolo. Come le gonadi saranno liberamente fissati alla parete, fare attenzione a non tirare troppo in fretta senza togliere queste connessioni o le gonadi possono allungare, causando danni agli organi.
13. Spostare la cresta urogenitale in cDMEM in un piatto per acclimatare il tessuto ai media.
14. Separare il complesso gonade-mesonefro dal resto della cresta urogenitale con 27 aghi G. Utilizzare un ago per tagliare premendo verso il basso, e utilizzare l'altro per guidare correttamente il tessuto per consentire la separazione ottimale. Evitare di utilizzare un movimento di taglio contro il fondo piatto, come aghi taglienti creerà schegge di plastica che possono attaccare al tessuto. Assicurarsi di mantenere le mesonefro completamente attaccato al gonade.

3. Coltura di gonadi con un inibitore della piccola molecola

1. Impostare due 20 μl pipette a 15 microlitri ciascuno. Tagliare a 1-2 mm fuori da una delle punte barriera pipetta usando una, lametta sterilizzata pulita per il trasferimento delle gonadi e l'aggiunta di controllo cDMEM, mentre l'altra pipetta saranno utilizzati esclusivamente per la droga trattati cDMEM.
2. Allineare gonadi con il loro asse lungo parallelo alla punta della pipetta in modo che possano facilmente essere pipettati usando la punta di cut-off. Fare attenzione di gonadi che attaccano all'interno del puntale.
3. Etichettare un lato come la goccia di controllo e l'altro come droplet-contenente il farmaco. Solo due gocce possono stare su un coperchio piatto da 35 mm. Assicurarsi che le etichette sui coperchi corrispondono le etichette sulle provette da microcentrifuga-tail-tessuto contenente.
4. Pipettare 15 ml di cDMEM contenenti una singola gonade in una goccia nel coperchio di una piccola (35 mm) piatto di coltura (utilizzare solo le palpebre, come i fondi sono troppo alti per adattarsi all'interno di una camera umidificata capsula di Petri). Mettere due gocce-gonadi contenente separati su entrambi i lati del piatto, fr ben separati,uno om un'altra. Controllare al microscopio per garantire che le gonadi sono state trasferite le goccioline.
5. Per la goccia designato come il controllo, aggiungere altri 15 ml di cDMEM contenenti DMSO (made in fase 1.5) per fare una goccia con un volume totale di 30 microlitri. Utilizzare solo la pipetta "di controllo", che non si metterà in contatto il farmaco.
6. All'altro droplet (droga campione trattato), aggiungere 15 ml di TKI-II contenente cDMEM fare una gocciolina con un volume totale di 30 microlitri. Usare solo la pipetta designato per i campioni trattati con farmaci.
7. Utilizzando la pipetta, sparsi le goccioline in un modello circolare in espansione fino a circa 15-18 mm di diametro e gonade si trova all'incirca a metà. Orientare gonade modo che si trova su un lato e gonade e mesonefro sono facilmente distinguibili. Orientare il polmone in modo che i due lobi distesi.
   1. Anche se il diametro delle gocce può variare leggermente, in modo che le gonadi non sono floating e sono tenuti in posizione da tensione superficiale. Assicurarsi che le goccioline non si tocchino tra loro o il lato del coperchio. Senza la tensione superficiale, gli organi cresceranno sul coperchio durante la cultura e appiattire distorcendo organo morfologia.
8. Posizionare accuratamente il coperchio piatto di coltura contenente goccioline verticalmente sulla superficie dell'acqua nel grande (100 mm) piatto umidificatore. Assicurarsi che non ci siano bolle intrappolate sotto il fondo del coperchio e che sia ben distesi sulla superficie dell'acqua. Non invertire il coperchio e fare attenzione a non lasciare che l'acqua tocca la parte superiore del coperchio dove si trovano le goccioline.
9. Per creare una piccola camera umidificata, coprire immediatamente con il coperchio del piatto dell'umidificatore più grande per racchiudere le culture gonade. Agire il più rapidamente possibile per minimizzare l'evaporazione dei media. Assicurarsi che il piatto più piccola ha spazio tra essa e il coperchio del piatto più grande per muoversi liberamente; in caso contrario, condensa può fare un sigillo e bricambio d'aria serratura al tessuto.
10. Una volta due piccoli coperchi sono poste nella camera, inserire immediatamente la camera nell'incubatrice. Incubare le culture delle gocce per 48 ore in un umidificata _incubatore CO 2 a 37 ° C.

4. Polymerase Chain Reaction per la determinazione del sesso degli embrioni

1. Aggiungere le code embrionali di fondo di un tubo da microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Aggiungere a ciascuna provetta 200 ml di NaOH 50 mM.
3. Posizionare a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando il tessuto è completamente sciolto.
4. Aggiungere 50 ml di 1 M Tris-HCl e vortice leggermente e brevemente.
5. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, fare un nuovo master mix PCR moltiplicando ogni volume per il numero totale di campioni: 0.5 ml 25 micron soluzione Primer, 2,5 microlitri 10X Taq Buffer, 0,5 microlitri dNTP 10 mm (nucleotidi), 19.3 ml nuclease- acqua gratuita, 0,2 microlitri DNA polimerasi Taq. Mescolare bene.
6. Aggiungere 23ml di PCR master mix PCR tubi contenenti 3 ml lisato di code digerito.
7. Tubi Flick mescolarli, quindi eseguire una breve centrifuga per portare i campioni al fondo della provetta.
8. Eseguire il programma XY (Short) PCR (Tabella 1).
9. Caricare i campioni (con 5x colorante) e scala in un gel di agarosio 2,5% in tampone TAE 1X.
10. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio fino bande XX e XY possono essere risolti.
11. Immagine il gel con l'immagine cattura la luce UV e.
12. Analizzare il vs bande specifiche del cromosoma Y X-specifico cromosoma (cromosoma X = 331 paia di basi [bp] e XY = 302 bp) ^13; XY campioni (maschi) avranno due bande di 331 e di 302 bp, mentre i campioni XX (femmina) apparirà come una singola banda 331 bp.

5. Tutta immunofluorescenza Monte Organo

Giorno 1:

1. Rimuovere le gonadi della cultura con una pipetta 1000 ml con una punta di cut-off. Se lo si desidera, possono esserecollocato in un piatto di PBS per lavare media e di reagenti. Mettere in PBS in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. Il tubo di dimensioni inferiori conserverà reagenti e rendere più facile per tenere traccia dei campioni nel tubo.
   1. Essere sicuri di mantenere il controllo e campioni trattati, così come campioni XX e XY, in tubi separati e rimuoverli dalla cultura con gruppi separati di pipette per evitare la contaminazione potenziale farmaco.
2. Lavare le gonadi due volte con PBS. Da questo punto in poi, questo protocollo può utilizzare 1X PBS privo di calcio e magnesio. Lavarli, consentono gonadi a depositarsi sul fondo della provetta (per gravità) e quindi rimuovere il liquido sopra. Fare attenzione a non perdere gonadi pipettando troppo vicino a loro.
3. Rimuovere il più possibile PBS dal tubo. Aggiungere 250 ml di 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,1% Triton X-100, e lasciate incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico. In alternativa, questa fissazione può essere fatto per 2 ore a 4 ° C su un agitatore meccanico. ATTENZIONE! Paraforformaldeide è una sostanza tossica, in modo da seguire il protocollo di sicurezza durante la manipolazione.

2 ° giorno:

4. Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx a temperatura ambiente.
5. Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
6. Bloccare le gonadi almeno 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
7. Macchiare le gonadi O / N a 4 ° C su una sedia a dondolo in 250 microlitri anticorpo primario diluito in Blocking Solution.

3 ° giorno:

8. Sciacquare le gonadi due volte in 250 ml Soluzione di Lavaggio.
9. Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri soluzione di lavaggio per 10 minuti ciascuno a RT su una sedia a dondolo.
10. Bloccare le gonadi 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
11. Coprire il provetta con un foglio di alluminio per proteggere anticorpi secondari fluorescenti dalla luce.
12. Incubare le gonadi 2-4 ore a temperatura ambiente su arocker in 250 microlitri anticorpo secondario diluito in Blocking Solution contenente Hoechst 33342. In alternativa, eseguire anticorpo secondario e Hoechst 33342 incubazione O / N a 4 ° C sull'attuatore.
13. Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx.
14. Lavare le gonadi 3 volte in 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
15. Usando un puntale di cut-off, il trasferimento gonadi su un vetrino con liquido minimo. Rimuovere il liquido in eccesso con la pipetta, ma fare in modo che il tessuto non si asciughi.
16. Orientare le gonadi in modo desiderato con una pinza, e aggiungere rapidamente una goccia di supporti di montaggio per montare le gonadi sulla diapositiva. Assicurarsi che le mani di montaggio dei media tutti i campioni completamente; è fondamentale per evitare di lasciare i campioni asciugarsi.
17. Utilizzare i coprioggetti (numero 1,5 stile) di dimensioni adeguate per coprire delicatamente i campioni. Lasciate che il montaggio dei media diffusione di contattare l'intera superficie del vetrino. Se necessario, premere molto leggermente sugli angoli del coprioggetto in modo chenon ci sono grosse bolle d'aria.
18. Sigillare i vetrini con smalto trasparente intorno ai bordi per ridurre l'evaporazione del mezzo di montaggio. Conservare diapositive montate al buio a 4 ° C.

L'ex vivo cultura gocciolina permette di manipolare interi organi, come la gonade, per studiare le interazioni e le dinamiche cellulari. La Figura 1 mostra in modo graduale come preparare una cultura E11.5 gonadica goccia. I primi passi nel protocollo coltura comprendono la rimozione iniziale del utero-embrione contenente dal mouse madre (Figura 1A e 1B). Dopo la rimozione dell'utero dalla madre, la parete uterina viene tagliato e gli embrioni vengono liberati dal sacco vitellino in PBS per ulteriori dissezione (Figura 1C-E). Dopo la rimozione di organi viscerali, la cresta urogenitale è chiaramente visibile lungo la parete del corpo posteriore dell'embrione (Figura 1F) ed è isolato (Figura 1G). Il complesso gonade-mesonefro viene poi sezionato dalla cresta urogenitale (Figura 1 H), e si trova nella cultura gocciolina con inibitore della piccola molecola (Figura 1I,a sinistra: "T" per trattare) e senza inibitore piccola molecola (Figura 1I, a destra: "C" per il controllo). I piccoli piatti contenenti le goccioline sono racchiuse in un make-shift camera umidificata (Figura 1J) e incubate a 37 ° C e 5% CO 2 per 48 ore.

Dopo 48 ore di incubazione, gli organi coltivate vengono rimossi, lavati con PBS, e sono sottoposti a un intero protocollo immunofluorescenza montaggio per valutare l'efficacia della coltura e il trattamento farmacologico; in alternativa, possono essere trattati per l'estrazione di RNA per analisi di espressione genica. Fetal intere gonade-mesonefro complessi (E11.5 e più vecchi) hanno un elevato tasso di sopravvivenza quando vengono trasferiti alla cultura dei media subito dopo una dissezione pulito e colta in condizioni normali (37 ° C e 5% di CO 2) per 48 ore (ma possono potenzialmente coltura a lungo se necessario). Confronti di gonadi E11.5 sotto campo chiaro Microscopioaa incubazione iniziale contro dopo 24 o 48 ore di cultura rivela un drastico cambiamento di forma gonade e la comparsa di strutture del midollo banda-come nel gonade di controllo XY (Figura 2). Pertanto, dopo coltura per 48 ore, lo sviluppo è paragonabile a quella di E13.5 in gonadi utero (Figura 2). Inoltre, il E11.5 polmone fetale cresce e visualizza aumentato ramificazione che si verifica normalmente durante questa fase di sviluppo (figura 2). Il processo di cultura in genere provoca organi più piccoli rispetto a in utero, molto probabilmente a causa fatto che le condizioni di coltura non sono ottimali per la crescita rispetto al in utero ambiente (vedi Discussione).

Anche se la dimensione degli organi risultanti dalla coltura di 48 ore differisce da quella in utero -developed organi, ex vivo organi coltivate mostrano architettura tissutale simili e possono servire come surrogati ragionevoli (Figures 3 e 4). A caratterizzare l'architettura organo e morfogenesi, marcatori che specificamente etichettano tipi di cellule di organi critici sono stati utilizzati, come SOX9 per le cellule dei testicoli Sertoli e cellule polmonari ramificazione, E-caderina per le cellule epiteliali del polmone, PECAM1 per le cellule germinali e vascolare, e spaccati Caspase 3 per cellule apoptotiche (figure 3 e 4). SOX9, codificante un fattore di trascrizione, svolge un ruolo importante nella proliferazione fetale organo, differenziazione, e la formazione della matrice extracellulare. Pertanto, in entrambi gli organi, SOX9 viene utilizzato come marcatore architettonica comune che etichette cellule di Sertoli situate all'interno delle corde testicolo 14-16 e strutture ramificate all'interno dei polmoni 17.

Culture gonade in particolare ricreare in utero morfogenesi efficacemente. La gonade mouse è specificato a embrionale (E) stadio E10.0 ed è inizialmente morfologicamente identiche a XY (maschio) e XX (female) embrioni. L'espressione della (regione che determina il sesso del cromosoma Y) Sry gene in XY gonadi a partire da E10.5 spinge grandi cambiamenti molecolari e morfologici che si verificano rapidamente tra E11.5 e E13.5 nel testicolo fetale 19, tra cui: le specifiche di cellule di Sertoli, la linea cellulare di sostegno del testicolo; la formazione di cordoni testicolo, che sono composti da cellule di Sertoli e germinali e sono i precursori fetali a tubuli seminiferi adulti; e maggiore rimodellamento vascolare. In rimodellamento vascolare maschio-specifica, cellule endoteliali rilasciate da un plesso vascolare nei mesonefro vicini migrano nella gonade per formare un sistema arterioso 4,20 specifici testicolo. Immunofluorescenza analisi rivelano strutture del midollo testicolo ben sviluppate e vascolarizzazione in E13.5 in testicoli utero relativi a E11.5 testicoli (Figura 3). Come le immagini nella figura 3 mostra, il sistema di coltura delle gocce può ricreare testicolo differenziazione evEnt ex vivo, in quanto è possibile visualizzare le cellule del Sertoli SOX9-positivo in gonadi XY formano in cavi tubulo-simili e vascolarizzazione che formano tutto l'organo. Rispetto ai polmoni, 48-hr risultati colturali in aumento di ramificazione SOX9 / E-caderina rami epiteliali doppio positivi nel corso di 2 giorni (Figura 4). Inoltre, vediamo livelli simili di apoptosi nel controllo colto e in gonadi utero, mentre c'è un certo aumento delle cellule apoptotiche nei polmoni nelle stesse condizioni di coltura (figure 3 e 4), suggerendo che gonade particolarmente suscettibili alle condizioni di coltura.

Inibitori piccola molecola possono essere utilizzati per studiare sviluppo organo interessando localizzazione cellulare, proliferazione, e lo stato del ciclo cellulare, così come l'architettura organo e diverse cascate di segnalazione. L'intero metodo ex vivo organo gocciolina consente al ricercatore di amministrare i reagenti farmacologiche facilmente a feorgani Tal in un volume molto piccolo di coltura. Per esaminare gli effetti della vascolarizzazione e rimodellamento vascolare sulla differenziazione del testicolo e morfogenesi, abbiamo usato la piccola molecola inibitore TKI II, un reagente che sconvolge testicolo sviluppo vascolare 3 bloccando l'attività dei recettori del VEGF; la formazione di architettura testicoli del feto avviene in modo vascolare-dipendente, che agisce attraverso vascular endothelial growth factor A (VEGFA) 11,12. Mentre vascolarizzazione del testicolo è fondamentale per l'esportazione di testosterone che guida virilizzazione dell'embrione, è anche uno dei principali motori di cavo testicolo morfogenesi: lavoro precedente ha dimostrato che quando la segnalazione VEGFA è bloccato in corrispondenza o prima di E11.5, cellule del Sertoli non riescono a partizionare dal circostante cellule interstiziali e nessuna struttura del midollo formare 3,12. I risultati mostrati qui dimostrano che distruzione del rimodellamento vascolare nel testicolo fetale è efficace nel sistema di coltura gocciolina, e subsequent difetti di testicolo morfogenesi (cioè, anormale formazione delle cordicelle testis) possono essere visualizzate (Figura 3). Va notato che PECAM1, un marker per le cellule endoteliali, è espressa anche da cellule germinali (Figura 3); questa colorazione della cellula germinale è un controllo interno che mostra che la mancanza di colorazione vascolare in gonadi trattato non è per ragioni tecniche, e dimostra che anche altri tipi di cellule, come le cellule germinali non sono influenzati dal trattamento farmacologico. Dato che la maggior parte del testicolo morfogenesi iniziale si svolge tra E11.5 e E13.5, queste fasi sono la finestra ottimale per determinare i fattori che influenzano la differenziazione sesso-specifici, in particolare il ruolo di VEGF e rimodellamento vascolare nella gonade.

L'uso di TKI II durante lo sviluppo del polmone tra E11.5 e E13.5 dimostra che l'inibizione piccola molecola di vascolarizzazione può essere riprodotto in un altro organo (Figura 4). Questi risultati mostrano l'efficacia di tlui ex vivo fetale organo gocciolina sistema modello la cultura e la capacità di utilizzare gli inibitori piccole molecole di modificare percorsi di segnalazione all'interno di organi. Data la facilità, la flessibilità e l'efficacia di questo protocollo, la cultura delle gocce fornisce una valida alternativa per le domande sperimentali riguardanti lo sviluppo di organi che non può essere affrontata in vivo.

Figura 1. Passi nella vitro tutto l'organo protocollo cultura droplet. (A) sacrificati topo incinta con apertura cavità peritoneale. (B) uterino corno con embrioni chiusi. (C) Primo piano vista della parete uterina aperta con esposto-embrione contenente sacco vitellino. (D) Un singolo embrione (e) è collegato alla placenta (p) racchiusa all'interno del sacco vitellino (y). (E) Embrione f separato rom placenta e sacco vitellino. (F) embrione Dissected con gli organi viscerali rimossi e cresta urogenitale esposti (gonadi all'interno cresta urogenitale delineato in nero). (G) Primo piano di isolato di cresta urogenitale (-mesonefro gonade complessi delineati in nero). Asterisco indica aorta dorsale in G e H. (H) Separazione del complesso gonade-mesonefro dalla cresta urogenitale (dissezione descritto da nero linea tratteggiata). g, gonade; m, mesonefro. (I) Allestimento di colture goccioline entro 35 mm coperchio piatto di coltura. Frecce nere indicano gonadi all'interno delle goccioline. T, trattati; C, di controllo. (J) cultura della gocciolina Due coperchi piatto collocati all'interno di una camera umidificata aperto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ig2.jpg "/>
Figura 2. Sviluppo di ex vivo droplet organi coltivate relativi agli organi utero immagini Brightfield di:. E11.5 in-utero- sviluppato organi (gonadi e polmoni) (prima colonna); Organi E11.5 dopo 24 ore (seconda colonna) e 48 ore cultura del controllo delle gocce (terza colonna); Organi in coltura per 48 ore con l'inibitore TKI II VEGFR (quarta colonna) E11.5; e E13.5 in-utero- sviluppato organi (quinta colonna). Gonadi sono orientate con gonadi (struttura chiara) sopra le mesonefro (struttura opaca). Gonadi E11.5 sono bipotente e appaiono morfologicamente identiche a XY (maschio) e XX campioni (femmina). Barra della scala, 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Src =" / files / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
Figura 3. ex vivo testicoli cultura gocciolina sono paragonabili in architettura tissutale e la morte cellulare a controparti sviluppate in-utero- immagini immunofluorescenza di:. E11.5 in utero -developed testicoli fetali (prima colonna); testicoli controllo E11.5 dopo 48 ore di controllo ex vivo cultura gocciolina (seconda colonna); E11.5 testicoli dopo 48 ore di coltura ex vivo gocciolina con TKI II inibitore VEGFR (terza colonna); e E13.5 in-utero- sviluppato testicoli (quarta colonna). Le linee tratteggiate indicano confine gonade-mesonefro (gonade è orientata in alto). SOX9 è un marker di cellule di Sertoli e viene utilizzato per visualizzare architettura cavo testis; PECAM1 è espresso in germe e cellule endoteliali vascolari (di conseguenza, rimanendo PECAM1 colorazione in gonadi trattata è cellule germinali quasi esclusivamente); e cleaved caspasi 3 è un marcatore di cellule apoptotiche. Gonadi di controllo in coltura hanno mostrato simile formazione cordone testicolo, vascolarizzazione specifici testicolo (frecce in tutta la figura), e livelli di apoptosi relativi a controparti sviluppate in-utero-, mentre gonadi TKI-II-coltura esposti interrotto vascolare e anormale morfogenesi cavo testicolo. Parentesi indicano dominio superficie della gonade in cui è normalmente vascolare presente ma non viene rilevato nei campioni trattati. Punte di freccia indicano morire grumi di cellule vascolari testicoli TKI-II-trattati. Barra della scala, 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Altri organi fetali (polmone) coltivate ex vivo in gocce sono paragonabili a > In- utero- organi sviluppati immagini immunofluorescenza di:. E11.5 in utero polmoni -developed (prima colonna); E11.5 polmoni dopo 48 ore di controllo ex vivo cultura gocciolina (seconda colonna); E11.5 polmoni dopo 48 ore di coltura ex vivo gocciolina con TKI II inibitore VEGFR (terza colonna); e E13.5 in-utero- sviluppato polmoni (quarta colonna). Etichette SOX9 ramificazione delle cellule; Marchi E-caderina epiteliale strutture tubolari; PECAM1 etichette endotelio vascolare; e spaccati Caspase 3 punti cellule apoptotiche. ex vivo di controllo degli organi di coltura mostrano un'architettura simile e l'espressione di SOX9, E-caderina, e PECAM1 negli organi coltura rispetto a in-utero- organi sviluppati, ma quantità variabili di morte cellulare. In seguito al trattamento con TKI II, sviluppo vascolare è significativamente ridotta nei polmoni (come rivelato da PECAM1 colorazione). Barra della scala, 100 micron.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: XY PCR Analysis Program Parametri ciclo per "XY (Short)" programma PCR utilizzato per XX / XY genotipizzazione di embrioni..

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.