La coltura di goccioline verticali ex vivo è un'alternativa alle attuali tecniche sperimentali in vitro e in vivo. Questo protocollo è facile da eseguire e richiede piccole quantità di reagente, consentendo al contempo la capacità di manipolare e studiare la vascolarizzazione, la morfogenesi e l'organogenesi fetale.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Indagare organogenesis in utero è un processo tecnicamente impegnativo in mammiferi placentati a causa dell'inaccessibilità di reagenti di embrioni che si sviluppano all'interno dell'utero. Un metodo di coltura delle gocce di nuova concezione ex vivo verticale fornisce una valida alternativa a studi effettuati in utero. L'ex vivo cultura gocciolina offre la possibilità di esaminare e manipolare interazioni cellulari e vie di segnalazione diverse attraverso l'uso di vari composti di blocco e attivazione; Inoltre, gli effetti di vari reagenti farmacologiche sullo sviluppo di organi specifici possono essere studiati senza effetti collaterali indesiderati di somministrazione di farmaci sistemici in utero. Rispetto ad altri sistemi in vitro, la cultura gocciolina consente non solo la capacità di studiare le interazioni tridimensionale morfogenesi e cellula-cellula, che non può essere riprodotto in linee cellulari di mammifero, ma richiede anche molto meno reagents di altri ex vivo e in vitro. protocolli Questo documento dimostra mouse corretta fetale dissezione organo e verticali tecniche di coltura gocciolina, seguito da tutta immunofluorescenza organo per dimostrare l'efficacia del metodo. La gocciolina metodo di coltura ex vivo permette la formazione di architettura organo paragonabile a quello osservato in vivo e può essere utilizzato per studiare processi altrimenti difficili da studio causa letalità embrionale in modelli in vivo. Come sistema domanda di modello, un inibitore piccola molecola sarà utilizzato per sondare il ruolo della vascolarizzazione nella morfogenesi testicolare. Questo droplet metodo di coltura ex vivo è espandibile fino a altri organi fetali, come polmone e potenzialmente altri, anche se ogni organo deve essere ampiamente studiata per determinare eventuali modifiche organo-specifiche al protocollo. Questo sistema di coltura di organi fornisce la flessibilità nella sperimentazione con organi fetali, e risultati richiederlod utilizzando questa tecnica aiuterà i ricercatori Acquisire conoscenze in sviluppo del feto.
Introduzione
La rigenerazione di organi in vivo nell'uomo è molto limitata; di conseguenza, l'ingegneria dei tessuti, lo sviluppo di tessuti e organi da cellule individuali donati da un host, sta diventando una terapia potenziale interessante per la sostituzione degli organi. Tuttavia, per questa strategia terapeutica per avere successo, i fattori e le interazioni cellulari coinvolti nella morfogenesi dell'organo devono essere accuratamente studiati e ben compresi. A causa della incapacità di studiare lo sviluppo di organi specifici con approcci tradizionali, i ricercatori si sono rivolti a embrione intero alternativa o intere culture d'organo. Kalaskar <....
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Protocollo
Tutti i topi utilizzati in questi studi erano topi CD-1 ottenuti da Charles River Laboratories. Cultura Precedenti esperimenti sono stati eseguiti su altri ceppi, quali C57BL / 6J (dati non mostrati), ma qualsiasi ceppo può essere utilizzato. Femmine adulte in stato di gravidanza sono stati di circa 2-3 mesi di vita e sono stati sacrificati tramite CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale e toracotomia bilaterale prima della rimozione embrione. I topi sono stati alloggiati in conformità alle linee guida NIH, e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale di Hospital Medical Center di Cinc....
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Risultati
L'ex vivo cultura gocciolina permette di manipolare interi organi, come la gonade, per studiare le interazioni e le dinamiche cellulari. La Figura 1 mostra in modo graduale come preparare una cultura E11.5 gonadica goccia. I primi passi nel protocollo coltura comprendono la rimozione iniziale del utero-embrione contenente dal mouse madre (Figura 1A e 1B). Dopo la rimozione dell'utero dalla madre, la parete uterina viene tagliato e gli embrioni vengono liberati dal sacco.......
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Discussione
Questo studio dimostra un intero metodo gocciolina organo ex vivo che ha molte potenziali applicazioni per lo studio dello sviluppo del feto. Questa tecnica può essere utilizzata per più organi, e permette al ricercatore di affrontare questioni biologiche che sono difficili da valutare in vivo utilizzando approcci a causa dell'inaccessibilità di embrioni e potenziale letalità embrionale. Questo metodo di coltura ha ulteriori vantaggi rispetto ad altri approcci in vitro come linee cellulari.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori sono stati supportati da: un CancerFree KIDS Research Grant, un March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), un Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award, un CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; e fondi per lo sviluppo CCHMC. Gli autori riconoscono anche il laboratorio Capel per l'ottimizzazione iniziale di questa tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini per microscopio Superfrost Plus Fisherbrand | 12-550-15 | ||
| Occhiali di copertura: quadrati (22 mm x 22 mm, n. 1,5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Smalto per unghie, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0,2 ml Provette PCR e Cappucci piatti staccati | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1.000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Pinze | FST | 91150-20 | |
| Forbici fini | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click Provette per microcentrifuga da 1,7 ml | Denville | C2170 | |
| Posi-Click Provette per microcentrifuga da 0,6 ml | Denville | C2176 | |
| 10 μ l Punte barriera di precisione SHARP | Denville | P1096FR | |
| 20 μ l Punte barriera di precisione SHARP | Denville | P1121 | |
| 200 μ l Punte barriera di precisione SHARP | Denville | P1122 | |
| 1.000 μ l Punte barriera di precisione SHARP | Denville | P1126 | |
| Siringa da 1 ml con aghi calibro 27 | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| Siringa da 10 ml | BD | 305559 | |
| 0,2 μ Filtro per siringa M PES | VWR | 28145-501 | |
| Carta da filtro qualitativa di grado 3 Grado standard, cerchio, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Piastra per colture cellulari | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dish, sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubatore | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Cabina di biosicurezza | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuga | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler con pannello di controllo | Eppendorf | 950040015 | |
| Stereomicroscopio SMZ445 | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet con software AlphaEase | Alpha Innotech Corporation | Fuori produzione | |
| Absolute 200 proof Etanolo | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Fosfato di sodio (bibasico MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Fosfato di potassio (monobasico MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Tecnologie per la vita dell'acqua senza nucleasi | AM9938 | ||
| Primer PCR XY | IDT | N/A | |
| Acido acetico glaciale | Fisher | A38-500 | |
| Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| Soluzione di bromuro di etidio all'1% | Fisher | BP1302-10 | |
| Agarosio | GeneMate | E-3120-500 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Soluzioni | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polimerasi con 10x tampone | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldeide | Fisher | O4042-500 | |
| Tossico FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Acido cloridrico ( HCl) | Fisher | A144212 | |
| Albumina sierica bovina (BSA), polvere, Frazione V, Isolamento da shock termico | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Siero fetale bovino (FBS), triplo filtro da 100 nm | Fisher | 03-600-511 | Inattivare a caldo prima dell'uso di |
| penicillina-streptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Utilizzare a 1:100 |
| Dimetil solfossido (DMSO), Hybri-max, filtro sterile | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Inibitore della tirosin-chinasi II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Coniglio Anticorpo Anti-Sox9 | Millipore | AB5535 | Uso alla diluizione: 1:4.000 |
| Anticorpo PECAM1 (CD31) Anticorpo di ratto | BD Pharmingen | 553370 | Uso alla diluizione: 1:250 |
| Caspasi-3 (Asp175) di coniglio | Segnalazione cellulare | 9661S | Uso alla diluizione: 1:250 |
| Anticorpo E-caderina di ratto / CDH1 (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Utilizzo alla diluizione: 1:500 |
| Hoechst 3342, tricloridrato, triidrato | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Utilizzare a 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Utilizzare alla diluizione: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Utilizzare a diluizione: 1:500 |
| Anticorpo secondario anti-coniglio d'asino IgG (H+L), Alexa Fluor 555 coniugato | Life Technologies | A31572 | Uso alla diluizione: 1:500 |
| Anticorpo secondario anti-coniglio d'asino IgG (H+L), Alexa Fluor 488 coniugato | Life Technologies | A21206 | Uso alla diluizione: 1:500 |
| Anticorpo secondario anti-Rat IgG (H+L) d'asino, Alexa Fluor 488 coniugato | Life Technologies | A21208 | Utilizzare a diluizione: 1:500 |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio d'asino, Alexa Fluor 647 coniugato | Life Technologies | A31573 | Utilizzo a diluizione: 1:500 |
Riferimenti
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
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Ristampe e permessi
