Identifikation af Metal Oxide Nanopartikler i Histologiske prøver af Enhanced Darkfield mikroskopi og hyperspektral Mapping

Introduction

Som nanomateriale stigende grad benyttes i en lang række industrier og anvendelser, der er behov for nanoskala billedbehandling og karakteriseringsmetoder, der er hurtigere, overkommelige og praktisk end traditionelle fremgangsmåder, f.eks elektronmikroskopi. At visualisere nanopartikler (NP) interaktioner med celler, væv og levende systemer, mange optiske teknikker har været ansat, herunder kontrast differential interferens (DIC) mikroskopi ¹ og flygtige felt tilgange, såsom total intern refleksion (TIR), eller nær- skannings optisk mikroskopi (NSOM) ^2,3. Men disse er high-end analytiske tilgange, utilgængeligt for de fleste ikke-specialiserede laboratorier ^4. Elektronmikroskopi, herunder transmissionselektronmikroskopi (TEM), er også blevet anvendt til at undersøge NP interaktion med celler ^5,6,7,8. Høj vinkel ringformede mørkefelt (HAADF) scanning transmissionselektronmikroskopi er blevet anvendt til at undersøge interaktionen NPSmed virus ^9. Konfokal mikroskopi er en anden populær teknik, der anvendes til at studere NP-celle-interaktioner ^10.

I de senere år har mørkefelt-baserede hyperspektral imaging (HSI) teknikker blevet anvendt som et lovende analytisk redskab til at studere NP'er i biologiske matricer ^11. HSI-systemer genererer en tredimensionel repræsentation af rumlige og spektrale data, kendt som en hyperkubus eller datacube ^12. Den rumlige kort over spektral variation bruges til materiale identifikation. Spektrale signaturer for kendte materialer kan genereres og anvendes som referencebiblioteker til sammenligning med ukendte prøver. En af de store fordele med HSI systemer er dens evne til at kombinere billeddannelse med spektroskopi, hvorved der etableres placering og fordeling af ukendte NP'er in vivo eller ex vivo såvel som forbinder dem til en anden reference partikel af kendt, lignende sammensætning.

Der er flere fordele vedved hjælp af HSI systemer i forhold til konventionelle billeddannelsesteknikker: minimal prøveforberedelse er påkrævet; prøveforberedelse er typisk ikke-destruktiv i naturen; indsamling og analyse af billedet er hurtigere; teknikken er omkostningseffektiv ^13; og den rumlige fordeling og analyse af forbindelser med blandet sammensætning og / eller i komplekse matricer er lettere opnås ^14.

For nanomaterialer forskning med værdifulde prøver, en af ​​de vigtigste overvejelser er tilgængeligheden af ​​en ikke-destruktiv billeddannelse metode, som gør det muligt for den potentielle gentagne gange undersøge prøver af en eller flere metoder. Gentagen eller flere analyser kan være ønskeligt at udvikle omfattende datasæt, som ikke ville være til rådighed fra en enkelt metode. Til denne henseende studere dens optiske egenskaber er den sikreste måde at analysere prøven. Ved anvendelse af et forstærket mørkefelt mikroskop (EDFM) og HSI system til at studere den optiske respons af prøven - nemlig REFLEctance, men også absorbans og transmittans - funktionen identifikation og karakterisering kan udføres ^15. Potentielle karakterisering endpoints omfatter en vurdering af relative størrelse og form af nanopartikler eller agglomerater og distribution af nanopartikler i en prøve.

I dette papir, beskriver vi kortlægningsmetoder specifikt til metaloxid nanopartikler i post mortem væv ved hjælp af en HSI system baseret på en pixel-spektral match algoritme kaldet en spektral vinkel mapper (SAM). Vi valgte denne særlige anvendelse, fordi det har potentiale til at supplere nuværende og fremtidige in vivo nanotoksikologi forskning, hvor dyremodeller anvendes til at vurdere de sundhedsmæssige konsekvenser af udsættelse for industrielt fremstillede nanomaterialer. Anvendelse af denne metode kunne også informere nanoskala lægemiddelafgivelse forskning, der anvender væv eller dyremodeller. Især nanopartikel absorption, fordeling, metabolisme og udskillelse i hele organs og væv kunne undersøges med dette system. En bred vifte af applikationer bliver undersøgt til brug i biomedicinsk forskning ^11.

Denne metode kunne anvendes til vurdering af forskellige biologiske prøver (såsom forskellige typer væv, bronkoalveolære udskylningsprøver, og blodudstrygninger), der har været udsat for nanopartikler af en række elementære sammensætninger ^16-19. Desuden er denne fremgangsmåde er anvendelig til undersøgelse af nanopartikel biodistribution in vivo og in vitro, som er relevant for nanoskala lægemiddelafgivelsessystemer undersøgelser ^11. Ud over biologiske prøver, kan EDFM og HSI anvendes til at vurdere nanopartikler i miljøprøver, såsom spildevand ^20. Vurdering af erhvervsmæssig eksponering kan lettes ved brug af denne teknik så godt, da det kan bruges til at evaluere effekten af ​​personlige værnemidler til forebyggelse af nanopartikel penetration. Desuden forskning team er ved at udvikle en lignende EDFM og HSI protokol for evaluering af filter medier prøver af nanopartikler indsamlet fra vurderinger erhvervsmæssig eksponering. Mens fremstillingen af ​​disse forskellige prøvetyper for EDFM og HSI kan variere, er det vigtigt, at de er forberedt på en sådan måde, at de let kan visualiseres ved det optiske system. Typisk skal prøven være forberedt, som om det ville visualiseres via traditionel brightfield mikroskopi. Der er flere hyperspektral afbildningssystemer kommercielt tilgængelige ^11.

Protocol

Animal protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på efterforskerne 'samarbejde institution, Stony Brook University. En liste over specifikke materialer og udstyr, der anvendes til dette papir kan findes i tabel 1.

1. Prøveforberedelse af væv

1. Forbered dyrevæv udsat for metal oxide nanopartikler til histologisk eller immunhistokemisk farvning som pr tidligere beskrevne fremgangsmåder ^21-23.

2. Imaging

1. Initialisering af mikroskop
   BEMÆRK: denne undersøgelse blev et forsknings kvalitet mikroskop bruges, udstyret med en højtydende mørkefelt lyskilde, motoriseret XY scenen controller, 14-bit dybde hyperspektral kamera, og flere objektivlinser (10X luft, 40X luft, 100X olieimmersion) . Systemet anvendes her har en 64 nm rumlig opløsning på 100X (olie i vand) forstørrelse. Kondensatoren anvendes til dette study har både Köhler og kritiske belysning funktioner og fokuserer en yderst kollimeret lys på skæve vinkler på prøven.
   1. Sæt stikket i og tænd for lyskilden, XY scenen controller, optisk kamera (til mørkefelt billeddannelse), hyperspektral kamera, og computersystem. Indstil lyskilden til 75% strøm; hæve scenen til maksimal højde; tilslutte lyslederen til kondensatoren for øget mørkefelt billeddannelse eller kollimatoren på bagsiden af ​​mikroskopet for reflekteret lysfelt billeddannelse.
      BEMÆRK: Ved at sætte lyskilden til 75% effekt, der er tilstrækkelig, ensartet belysning af alle pixels i hele synsfeltet, der forbedrer mattere pixels mens det stadig tillader for kontrast mellem matte og lyse pixels.
   2. Hæv kondensatoren til arbejdsstedet. Påfør 3-5 dråber af type-A fordybelse olie på kondensatoren linsen forsigtigt, undgå dannelsen af ​​eventuelle bobler. Tør væk olie og genanvende det, hvis boblerne skulle danne.
   3. Placer slide on scenen. Langsomt hæve kondensatoren indtil immersionsolie får kontakt med dias. Dette vil være mærkbar gennem hurtigt lysere ring af belysning, hvor olien kommer i kontakt med objektglasset.
2. Sæt 10X-objektivet på plads. Fokus og tilpasse kondensatoren ved at undersøge gennem okularer.
   1. Flyt scenen op og ned via den grove objektive fokus knop, indtil lysstyrken er maksimeret.
   2. Flyt kondensatoren fokusere op og ned via kondensator justeringsknappen, indtil maksimal lysstyrke er fundet. Forsøg på at skabe den lyseste centrale stedet muligt i synsfeltet.
   3. Juster kondensatoren tilpasning knopper som nødvendigt for at centrere lyspunkt, hvis det er nødvendigt.
   4. Brug den fine målsætning fokus knop for at bringe lyspunkt i fokus. Ved skift mål at opnå en anden forstørrelse, justere fokus flyet. Ved at udnytte den 100X mål, anvende en dråbe fordybelse olie over dækglasset at øge the image og undgå skader på objektivlinsen.
3. Optagelse af billeder
   1. Brug fase controller til at finde et område af interesse. Denne region vil blive bestemt af behovene i eksperimentet. En typisk indikator vil være høj kontrast med omgivende regioner, som områder gennemtrængt af metaloxid nanopartikler ofte synes lysere end områder uden dem.
   2. Bring regionen i fokus ved hjælp af den fine objektive fokus knop, justering af kondensatoren fokus som nødvendigt for at udligne belysning. Opnå en høj kontrast, veldefineret område inden for synsfeltet.
   3. Bestemme, hvad billederne (for optiske kamera) eller datacubes (for hyperspektral kamera) blive fanget, og i hvilken rækkefølge. Typisk er optiske billeder opnås med en 10X luft mål, 40X luft objektive, og 100X olie nedsænkning objektiv og en tilsvarende HSI datacube med en 100X olie nedsænkning mål.
      1. Åbn den optiske imaging software. Klik på "Indstillinger &# 8221; i menulinjen. Vælg "Billedoverførsel Knap til fange begivenhed". Vælg det lagrede billede format (TIFF blev anvendt til dette eksperiment); tildele et filnavn; gennemse og vælge en gemt billedmappen; holde standard timelapse; klik på "OK".
      2. Vælg indstillingerne for eksponering, der skaber den højeste kontrast billede i "Exposure" menuen (til denne undersøgelse, et niveau på 0,0%, forstærkning på 3,0 dB, og udløseren i 35 ms blev anvendt).
      3. Tage billedet ved at klikke på "Image" knappen i menulinjen. Fange flere lavforstørrende mørkefelt billeder i tillæg til dem ved stor forstørrelse ved at ændre mikroskop mål, med henblik på at tilvejebringe sammenhæng.
         BEMÆRK: Capture optiske billeder på samme forstørrelse som enhver datacubes, der vil blive taget med hyperspektral kamera, da disse optiske billeder tendens til at have et større synsfelt og bedre æstetisk udseende til senere visuel inspektion. Det er vigtigt, at enhver DATACUBE'er der senere vil blive spektralanalyseres anvendelse i overensstemmelse forstørrelse, da det er muligt at ændre målet vil ændre transmissionsspektre mikroskopets optik, ændre fanget spektre, og dermed reducere nøjagtigheden af ​​den spektrale vinkel mapper (SAM). Hvis en datacube er i forhold til en anden datacube opnået med et andet mål, kan SAM-funktionen ikke.
   4. Vælg hyperspektral kamera imaging detektor ved at omdirigere lyskilden knop på mikroskopet til hyperspektral kamera. Hvis lyset er rettet mod hyperspektral kameraet, vil intet billede blive vist i det optiske kamera software. Minimer, men luk ikke det optiske imaging software vindue, som man kan have brug for det, som angivet i trin 2.4.4.
4. Optagelse Datacubes
   1. Åbn hyperspektral imaging software til erhvervelse af HSI datacubes. Sørg lyset vejledning er rettet mod hyperspektral kamera.
   2. Åbn "Hyperspectral mikroskop "i menulinjen, og vælg" HSI Mikroskop Controls ".
   3. Indstil objektivforstørrelse og gem stien. Sørg for at nævne alle billeder og filer markant så ingen overskrivning forekommer. Skift capture område ved at justere synsfeltet eller antal linier (bruge 720 linier til denne undersøgelse), med en betydelig mængde ekstra tid, der kræves til at opfange større områder. Endelig indstille eksponeringen tid (0,25 sek til denne undersøgelse). Lad alt andet til standard, og klik på "Preview HSI" for at se billedet.
      Bemærk: Intensiteten graf, der vises viser HSI datacube der vil blive optaget i den vandrette akse. Den lodrette akse repræsenterer bølgelængderne af spektrene, der vil blive fanget i HSI datacube. Placere markøren ved enhver position på intensiteten grafen svarende til en spektral bølgelængde forårsager intensiteterne af alle de punkter i hele billedet, på det bølgelængde, der skal vises.
   4. Justere intensiteten fra denne forhåndsvisning ved at justere kilde lysstyrke, kondensator fokus, eller ved at annullere preview for at justere eksponeringen tid. Sidstnævnte giver de bedste resultater, men steg eksponeringstid kan tage længere tid at billedet. Målet er, at de mere betydende toppe til at være tilstrækkelig stor, men ikke over for detektoren den maksimale intensitet; her, den ideelle sortiment er mellem 1.000 og 16.000 enheder.
   5. Klik på "capture". Mikroskopet vil bede om at tage et mørkt aktuelle billede. Omdiriger den øverste slide bar eller blænde (forsigtigt, så for ikke at forstyrre tilpasningenog fokus for nogen af ​​de andre optik), og klik på "OK". Gendan skyderen eller blænden til den korrekte position, og klik på "OK" igen, når bedt om at billedet vises. Imaging kan tage op til 30 minutter, selvom tider på ca. 5 min er mere typisk. Længere eksponeringstider føre til længere imaging gange. Et fremskridt indikator er til stede. Pas på ikke at fysisk at forstyrre rækkevidden før statusindikatoren fuldender.
   6. Overhold fire nye vinduer med navnene: "Tilgængelige bands liste", "# 1zoom", "# 1scroll" og "# 1 RGB band". Maksimere "# 1RGB band" vinduet, da dette er datacube for alle fremtidige referencer.
   7. Højreklik på datacube og gemme det som en TIFF og klik på "OK". Hvis færdige billeddannelse; lægge alle prøver væk; rengøre alle olie-eksponerede overflader med 70% isopropanol i vand; hæve etape til maksimal højde; lavere kondensator til minimumshøjde og tryk til ikke-operationelle position; lukkened eller tag lyskilden, scene controller, og kameraer.

3. Etablering af reference Spectral Biblioteker

1. Udvælgelse af referencespektrer
   1. Vælg en positiv kontrol, der vides at indeholde materiale af interesse indeholdt i den samme matrix som de eksperimentelle prøver, idet HSI spektrale profiler matrix-afhængig.
      1. Til denne undersøgelse, bruge svinehud injiceret med høje doser af metal oxide nanopartikler som positive kontroller til sammenligning med eksperimentelle svinehud væv fra en lokal eksponering undersøgelse. De spektrale profiler af metal oxide nanopartikler i suspension blev dannet og undersøgt og fundet at være en uhensigtsmæssig positiv kontrol for de histologiske eksperimentelle prøver på grund af de forskellige matrixer.
   2. Opnå en datacube fra den positive kontrol som beskrevet i trin 2.4., Ved hjælp af hyperspektral kameraet.
      1. Vær særlig forsigtig, når selvrg ø ring intensiteten, da dette er den primære måling, hvorved det indre partikelfilter vil identificere materialerne. Eventuelle intensiteter over mætningspunktet for detektoren (her, 16.000 enheder) vil resultere i ugyldige data (se trin 2.4.5.).
   3. Højreklik på billedet vinduet, og venstre klik på "Z-profil spektrum". Et pop-up Spectral Profile vindue vises. Venstre klik på pixels af interesse på datacube, især de lyseste dem eller dem, der kan trygt identificeres som repræsenterer materiale af interesse. Overhold Spectral Profile vindue, der viser den tilhørende spektrum. Vær opmærksom på især deres laveste og højeste værdi, og som bølgelængde svarer til det.
      1. Ved opmåling den positive kontrolprøve, undersøgelse ved at klikke på områder af interesse, der er meget lyse i forhold til det omgivende væv, især dem med let identificerbare partikler. Disse partikler er mest sandsynligt at være materIALS af interesse, især i tilfælde af metaller.
   4. Brug "Partikelfilter" værktøj under "Particle Analysis" menuen for at identificere partikler til stede i datacube. I den nye pop-up vindue, observere "Spectral Max må overstige". Dette vil blive bestemt af observationer i trin 3.1.3. Indstil denne værdi, så det er højere end baggrunden pixels, men lavere end de materialer, af interesse. Den "Gyldig data Max" er den maksimale intensitet (her, 16.000 enheder).
      1. Lad andre parametre til standard, men udelukke objekter baseret på størrelse ved at justere "Størrelse Threshold" boksen. Gem disse data enten på dette tidspunkt, eller efter at have kørt analysen. Til dette eksperiment, bruge følgende parametre: Spectral Max skal overstige: 5.000; Gyldig data Max: 16.000; Størrelse Threshold (pixel): 400. Når alle parametre er blevet indstillet, skal du klikke på "OK".
   5. Overhold den resulterende graf med detaljerne ipartikler opdaget inden for den angivne intensitet tærskel; disse data kan eksporteres. Hvis karakteristisk maksimal reflektans bølgelængde af materialet af interesse er kendt, vælge de partikler, der har en lignende "Max WL" værdi; ellers skal du klikke på "vælg alle". Klik derefter på "Export"; "At Spectral Library". Vælg et filnavn og klik på "OK".
2. Fjern Falsk-positive Spectra
   1. Vælg en prøve, der vil tjene som en negativ kontrol. En sådan prøve burde have været forberedt og behandlet på samme måde som alle eksperimentelle prøver spare, at fraværet af nanopartikler lignende eller identiske til materialet af interesse er garanteret.
      BEMÆRK: Det er vigtigt, at matrix af den negative kontrol er den samme som den matrix af de eksperimentelle prøver, som HSI spektrale profiler er matrix afhængige. Til denne undersøgelse anvendte vi svinehud, der ikke var udsat for metaloxid nanomaterialer som negativkontroller.
   2. Opnå flere datacubes fra den negative kontrol som beskrevet i trin 2.4.7, under anvendelse af hyperspektral kameraet. Mindst én er påkrævet, men mere kan opfanges at øge selektiviteten (dette er især vigtigt i tilfælde af, at nogle forurenende kan være i referencespektrer).
   3. Brug hyperspektral imaging software til at filtrere den spektrale biblioteket indsamlet i trin 3.1 (positiv kontrol) over hver datacube fanget i trin 3.2.2 (negative kontroller) serielt, som anvist i følgende trin:
      BEMÆRK: Gem den resulterende, filtreret spektral biblioteket til en separat fil, og bruge som reference spektrale biblioteket for materiale af interesse.
      1. Klik på "Filter Spectral Library" under Analysis menuen, som ligger på hovedværktøjslinjen programmet. Klik på "Åbn"; "Ny File" og vælg den spektrale bibliotek oprettet i trin 3.1. for den positive kontrol som den input-fil. Klik på "OK".
      2. Til eKSTERN kilde, skal du vælge "Image" under spektrale data kassen. Hold standardindstillinger under Processing Parametre kassen. Vælg et Output Navn Til filtreret Library (dette skulle være anderledes end originalen, eller den rå spektrale biblioteket indsamlet vil gå tabt). Klik på "OK".
      3. Klik på "Åbn"; "Ny File" og vælg den første datacube fanget i trin 3.2.2 til den negative kontrol, når bedt om at vælge en kilde billede.
         BEMÆRK: Softwaren vil analysere spektrale bibliotek og fjerne hvert spektrum, der matcher enhver spektrum af den negative kontrol datacube. Fjernelse af baggrund fra udvælgelseskriterierne reducerer dermed risikoen for falske-positive. Et resumé vil være tilgængelige, når dette er gjort (bemærk, at dette resumé ikke gemmes automatisk).
      4. Hvis der ønskes yderligere filtrering, gentag fra trin 3.2.3.1, undtagen: trin 3.2.3.2, skal du vælge den sidste filtreret spektrale bibliotek oprettet (resulterer efter trin 3.2.3.3 co.mpletes); i trin 3.2.3.3, skal du vælge det næste datacube fra trin 3.2.2.
         BEMÆRK: Korrektion og normalisering for lampen spektrum kan være nødvendig, hvis prøverne sprede en betydelig mængde lys (f.eks kulstof-nanorør) og / eller hvis nul spektre tilbage, når filtrering af en positiv kontrol spektral bibliotek mod en negativ kontrol. Disse forhold har ikke opstå for vores undersøgelse og så denne korrektion ikke blev udført.

4. Image Analysis

1. Spectral Vinkel Mapping
   1. Åbn "Spectral Angle Mapper" (SAM) fra Spectral menuen kortlægningsmetoder undermenu, ved hjælp af den hyperspektral imaging software, når alle de eksperimentelle datacubes er erhvervet efter trin 2.4. Den spektrale vinkel mapper sammenligner spektre af geometrisk analyse af ændringer i intensitet som funktion af bølgelængde (dvs. det sammenligner to spektre ved at normalisere deres intensitet og sammenligne vinklerne reves at spore grafen for hver ^spektre) 24.
   2. Med datacube åbent, skal du vælge navnet på den eksperimentelle datacube i pop-up-vinduet, og klik på "OK". Hvis der ikke filnavne er angivet, skal du klikke på "åben"; "Ny fil", vælg den eksperimentelle datacube, og klik derefter på "OK".
      1. Observere en ny pop-up vindue kaldet endmember Kollektion: SAM. Klik på "Import" i menulinjen, og vælg derefter "fra Spectral Library fil". Et pop-up vindue med navnet Spectral Bibliotek Input File vises. Åbn Spectral Library of reference, der blev oprettet i trin 3.2.3. og klik på "OK". Observere en ny pop-up vindue med navnet "Input Spectral Library".
      2. Klik på "Vælg alle varer"; klik på "OK" højre klik på "Color" og vælg "Anvend standardfarverne for alle." Klik på "Vælg alle" efterfulgt af "Anvend" og derefter vælge output filnavnet etD Klik på "OK". Den Spectral Angle Mapper vil tage et par sekunder til at analysere og gemme dataene.
   3. Åbn datacube i hyperspektral imaging software. Vælg "Klassifikation" i overlay menuen i billedet vinduet, derefter navigere til filnavnet, og klik på "OK". Brugeren kan nu overlay nogen spektret fra biblioteket for at se, hvor de kort i billedet.
   4. Vælg "Flet Klasser" fra menuen i "Interaktiv klasse værktøj" åbnede gennem Overlay menuen i billedet vinduet, hvis en samlet farveskema er ønsket, såsom lettere analyse af anden software (som beskrevet i trin 4.2 .).
   5. Fremhæv alle klassifikationer for at kombinere (typisk, alt undtagen "uklassificerede" i "klasser til at flette ind i bunden" liste), og vælg en enkelt spektrum fra "basisklassen" liste, og klik derefter på "OK". At farve vil nu repræsenent alle valgte spektre.
   6. Klik på den valgte farve og alle matchende spektre vil blive vist i denne farve.
   7. For at opnå en dikromatiske billede, der vil vise den matchende spektre over en sort baggrund, cIick på "uklassificerede" farver kasse, som er sort som standard. Observere en dikromatiske billede. Dette trin kan vendes ved at klikke igen på "uklassificerede" farver feltet.
   8. Højreklik for at gemme billedet som en TIFF, herunder eventuelle overlejringer aktuelt aktive.
      BEMÆRK: Til fremtidig imaging behandling, vil en dikromatiske billede bruges.
   9. Vælg "Klasse Distribution" fra menuen i "Interaktiv Class Tool" vinduet for at erhverve statistikken kortlægning. Disse data repræsenterer, hvor mange pixels var unmapped (uklassificerede), og hvor mange blev identificeret som materiale af interesse. Bemærk, at antallet af pixels ikke svarer til antallet af partikler kortlagt. Disse oplysninger er ikke automatisk recorded.
2. Partikel Analyse i hyperspektral Tilknyttede billeder
   1. Åbn billederne i NIH ImageJ software.
   2. Brug menuen Billede, Juster undermenu, "Threshold" funktion. Vælg parametre, der adskiller partikler af interesse fra alle andre materialer. Brug følgende tærskelværdier parametre til denne undersøgelse: standard tærskel metode, farven rød, farverum HSB, tjekket mørk baggrund afkrydsningsfeltet, kontrolleret pass afkrydsningsfelterne for nuance, mætning og lysstyrke.
      BEMÆRK: Dette kan variere betydeligt fra sag til sag. Ved analyse en kortlagt datacube kan dette forenkles ved at forene alle relevante klasser til en enkelt farve, og overlejring denne farve med alle uklassificerede farver før generering af billedet (trin 4.1.4 til 4.1.8).
   3. Brug menuen Analyser, "Analyze partikler" funktion, som vil hente oplysninger om området, mener, minimum og maksimum værdier. Til denne undersøgelse, skal du bruge parametrene her: størrelse 0-uendelig, cirkularitet0-1, viser intet, tjekket vise resultater afkrydsningsfelt.
   4. Til statistisk analyse, eksportere disse data til et andet program der gør det muligt statistisk sammenligning med antallet og størrelsen af ​​partikler ligger i lignende kontrolprøver. Vi foreslår at bruge et regneark til analyse af ImageJ data. Data, der vises i resultaterne tabellen efter trin 4.2.4 skal kopieres til et regneark. MAX funktion kan anvendes på den første (unavngivne) kolonne for at bestemme antallet af partikler, mens den gennemsnitlige funktion kan anvendes på området kolonnen for at bestemme middelstørrelse af en partikel. I fremtiden vil eksperimentel validering skal forfølges for at undersøge denne funktion i fastlæggelsen gennemsnitlig størrelse mod en etableret standard for dimensionering (fx TEM).

Representative Results

Hyperspektrale mikroskopi er nyttig for sin evne til at identificere materialer på en måde svarende til spektrofotometri. Som angivet i figur 1, hvert materiale har flere karakteristiske spektre og en samlet form af dens reflektans, som er unik. Endvidere Figur 1 illustrerer matrix-afhængige karakter af de spektrale profiler: de spektrale profiler for hver af de tre metaloxider i histologiske vævsprøver (øverste panel) er forskellige fra de spektrale profiler for hver af de tre metaloxider i vandig suspension ( bundpanel). Ved at kortlægge de karakteristiske spektrale profiler til ukendte prøver i samme matrix, teknikken er egnede til bestemmelse af nærvær eller fravær af et materiale og kan også semikvantitativt sammenligne relative mængder af materiale i prøver.

De henvisning spektrale biblioteker oprettet fra positive kontrolprøver hudprøver er passende for kortlægning til eksperimentelhudprøver. Som det ses i figur 2, hvis referencenumre spektrale biblioteker kort godt til de tilsvarende positive kontroller og ikke kort til de tilsvarende negative kontroller.

Den vigtigste fordel ved teknikken er dens evne til at detektere lave niveauer af materialer af interesse i prøver, samt at adskille dem fra forureninger. . For eksempel kan de enkelte nanorør observeres i lungerne under inhalation af doser så lave som 40 pg i en 20-30 g rotte ²⁵ Figur 3 viser det i histologiske hudprøver: mens nogle partikler er let indlysende i mørkefelt optisk billede (kolonne 2), andre påvises ved hjælp hyperspektral imaging (kolonne 3), der kunne have været savnet hjælp brightfield mikroskopi (kolonne 1) eller andre metoder. Brugen af ​​mørkefelt HSI også tjener til at forbedre specificitet i enkle brightfield mikroskopi. Disse billeder kan derefter gøres til genstand for flere kvantitative former for analyse, notably partikel analyse via ImageJ.

Forbedret mørkefelt mikroskopi har flere forskellige anvendelser, selv i fravær af hyperspektrale billeddannelse. Den første er dets evne til at generere høj kvalitet, høj kontrast billeder. Dette illustreres bedst af figur 3, hvor partiklerne af interesse er let identificerbare i sammenligning med deres modstykker lysfelt. Disse billeder kan også være underlagt kvantitative partikel analyse, men i mangel af hyperspektrale kortlægning, er nødvendig forsigtighed for at undgå forvirrende en forurening partikel fra en partikel af interesse.

Figur 1. Reference- spektrale biblioteker (væv matrix) sammenlignet med spektrale biblioteker (nanopartikler i suspension). Denne figur viser betydningen af ​​at skabe en reference spektral bibliotek fra nanomaterials af interesse i samme matrix som eksperimentelle prøver. Den første række viser henvisningen spektrale bibliotek (RSL) for hvert materiale i denne undersøgelse (aluminiumoxid, silica og ceriumoxid). Klik her for at se en større version af dette tal.

Denne RSL blev oprettet ved den i denne protokol, hvor positiv kontrol vævsprøver blev filtreret mod negative kontrol vævsprøver metode. Den anden række viser spektrale biblioteker (SL) oprettet fra nanopartiklerne af interesse i flydende suspension på en glasplade. For aluminiumoxid, blev en bimodal spids ved bølgelængder på 500 og 650 findes i RSL, mens en mere buet og mindre markante højdepunkt blev set i alumina NP suspension SL på omkring 600. For silica, en top ved en bølgelængde på omkring 650 var stede i RSL, mens en mere buet og mindre markante højdepunkt blev set i silica NP suspension SL på around 600. For ceriumoxid, blev en bimodal spids findes ved bølgelængder på 520 og 620 i RSL, mens en mindre markant højdepunkt blev set i ceria NP suspension SL på omkring 560. Dette antyder, at matricen, hvor nationale parlamenter er indlejret skaber et skift i spektre, der kan være betydelige, når du vælger den kontrol til at skabe SL for så specifik eksperiment.

Figur 2. reference spektrale biblioteker (væv matrix) kortlagt på positiv kontrol og negativ kontrol svinehud væv. Dette tal fungerer som bekræftelse af RSLS som passende for kortlægning til eksperimentelle prøver, ved at hver RSL (venstre kolonne) kortlægger godt til dens tilsvarende positiv kontrol (midterste kolonne), og ikke kort til dens tilsvarende negativ kontrol (højre kolonne). Venligst klik hførend at se en større version af dette tal.

Figur 3. Hyperspektrale kortlægning af eksperimentel svinehud væv udsættes for metaloxid nanopartikler. Rækker fra top til bund svarer til forskellige lag af huden, fra overfladiske til dybeste lag: epidermis, dermis og det subkutane væv, henholdsvis. Den første række viser stratum corneum af overhuden fra en hud prøve, som var udsat for aluminiumoxid NP'er i suspension; den anden række blev udsat for silicagel NP'er i suspension; og den tredje række til Ceria NP'er i suspension. Hver søjle viser det samme område af huden afbildes med forskellige teknikker. Den første kolonne svarer til brightfield mikroskopi (40X mag .; skala bar = 50 um), hvor arealet indesluttet i en rød firkant blev forstørret (100X mag, skala bar = 10 um) med forbedret mørkefelt mikroskopi (EDFM) i den anden kolonne, hvor hvide pile peger på den høje kontrast NP'er. Den tredje kolonne blev opnået med en hyperspektral kamera (HSI), der viser de samme høje kontrast NP'er (hvide pile). EDFM og HSI billeder blev taget ved 100X forstørrelse; Målestokken = 10 um. Den fjerde kolonne viser HSI billedet kortlagt mod den respektive RSL for hver eksponering gruppe, hvor aluminiumoxid NP'er vises i grøn, silica NP'er i rødt, og ceria nationale parlamenter i gul, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

For kan opnås vævsprøver, der har undergået konventionelle histologiske farvning, identifikation og analyse af metal oxid nanopartikler gennem en kombination af EDFM, HSI kortlægning, og image analyseteknikker. Mens der er fleksibilitet ved prøvefremstilling til histologi eller immunohistokemi (f.eks ved hjælp af faste eller frosne væv; plettype), er det vigtigt, at prøverne snit til en tykkelse på 5-10 um for optimal visualisering. Prøver bruges her var formalin-fikseret og paraffin-indstøbt før sektionering med en roterende mikrotom til 6 um tykkelse, monteret på objektglas, farvet med hematoxylin og eosin og dækglas. Svinehud væv fra en ex vivo kutan penetration toksikologi samarbejde blev anvendt til denne undersøgelse. Vævene blev udsat for metaloxid nanopartikler (aluminiumoxid, siliciumdioxid, ceria) i vandige suspensioner. Påvisning af regionen (r) af interesse (høj kontrast elemeNTS) med EDFM er et kritisk første skridt, der letter senere HSI kortlægning og analyse. Positive og negative kontrolprøver skal afbildes og analyseret først for at skabe en spektral bibliotek til reference. Den indsamlede spektre fra den positive kontrol udføres til en positiv kontrol spektral bibliotek. Derefter er alle spektrene fra den negative kontrol billeder subtraheres fra den positive kontrol spektrale bibliotek for at forbedre specificiteten (reducere falske positiver). Den resulterende filtrerede spektrale bibliotek anses RSL der tjener til analyse af materialer af interesse. Alle vævsprøver gennemgå den samme billeddannende proces, og er kortlagt mod RSL. Det resulterende billede vil kun indeholde områder med elementer af interesse over en sort baggrund. Dette billede kan derefter analyseres med ImageJ ved hjælp af sine tærskel- og partikel analyse funktioner for at opnå området med kortlagte partikler pr synsfelt. Numeriske data fra ImageJ kan være eksported til et regneark til videre analyse.

Det er vigtigt at overveje, at så biologiske prøver er i sagens natur forskellige fra hinanden, og farvningsmetoder kan påvirke visualisering gennem EDFM og HSI, bør indstillingerne for eksponering bestemmes i overensstemmelse med, hvad der giver den bedste høj kontrast billede til en bestemt type prøve. Selvom der kan opnås reduktion af falske positiver gennem filtrering af spektrale biblioteker, er det afgørende at få pålidelige negative kontroller, der har undgået forurening med det element af interesse, da spektre, der svarer til denne forurening potentielt kunne filtreres fra den positive kontrol er spektrale bibliotek stigende falsk negative. Desuden kan spektret intensitet område, der er påviseligt med den hyperspektral imaging software ikke overstige grænsen for den særlige software (til denne undersøgelse, der er 16.000 enheder): områder med et højt antal akkumulerede partikler, der producerer spectral intensiteter over intensiteten grænse er udeladt af den spektrale biblioteket, på grund af risikoen for at øge antallet af falsk negative resultater.

Mens HSI systemet giver mange fordele i forhold til traditionelle metoder, der er nogle ulemper og begrænsninger at overveje. Den ene er, at den store mængde af optiske data indsamlet kan kræve en betydelig computerkraft. En anden er, at HSI kan være tidskrævende, især i begyndelsen stadier, når reference- spektrale biblioteker bliver skabt. Ligeledes kan imaging tid kræve flere minutter pr billedoptagelse, hvilket gør det langsommere end simpel mørkefelt billeddannelse; dog er det stadig hurtigere end at udføre fremstilling og visualisering prøvetagning ved elektronmikroskopi. Derudover kan komplekse systemer resultere i flere karakteristiske spektre, som kræver udvikling af højt specialiserede kontroller og gøre etablering af standardiserede, universelle referencebiblioteker vanskelige ^26. Endelig technique resultater i lavere opløsning end probe- eller elektron-mikroskopi teknikker, såsom atomic force mikroskopi eller transmissionselektronmikroskopi, som kan løse enkelte atomer. Denne teknik beslutning er begrænset på grund af sin fotoniske natur, der forhindrer den fra at være en høj præcision værktøj til måling partikelstørrelser på nanometer-niveau eller for præcist at lokalisere materialer på en sub-micron niveau. Mens teknikken kan være i stand til at lokalisere partikler inden for visse vævsrum eller cellulære organeller større end 1 um (såsom cellekerner), er mindre organeller eller funktioner udfordrende at visualisere nøjagtigt med denne metode. Også at bemærke, givet sin rumlig opløsning, kan denne metode ikke skelne mellem enkelte nanopartikler og agglomerater ^11.

Andre overvejelser omfatter: visse materialer (såsom ædle metaller) har meget højere reflektans og adskilte spektrale profiler, som kan gøre dem lettere at ANALYze og kort spektralt med dette værktøj. Andre, såsom de semi-metaloxider undersøgt i dette studie og carbon-baserede nanomaterialer ^{24, 27,} kan være mere udfordrende på grund af deres grundstofsammensætning, form, og afhængigt af matrixen. I to murine inhalationsstudier af Mercer et al., Blev et lignende system til den anvendt i denne undersøgelse anvendes til at lokalisere kulstof-nanorør i lungerne og i de sekundære organer baseret på deres bemærkelsesværdigt høj kontrast med omgivende væv. Imidlertid blev hyperspektral kortlægning ikke påvist i nogen af ​​studierne, sandsynligvis fordi unikke form af kulfibre var en tilstrækkelig træk til identifikation. En anden overvejelse vedrører specifikt til væv: siden deponering nanopartikler af interesse for specifikke organer gennem normale biofysiske processer er uforudsigelig (og ofte selv er genstand for undersøgelsen), kan bestemmelse af en gældende positiv kontrol være svært og kræver overvejelse af, hvordan generation af kontrol might påvirke tilstanden af ​​et materiale af interesse. For eksempel, hvis en spektral bibliotek skabt ud fra uberørte nanopartikler af interesse, kan det være vanskeligt at kortlægge biblioteket til de samme nanopartikler i væv eller celler på grund af ændringer i spektrene som følge af ændring af partikel (f.eks, som følge af ændring i pH, opløsning, agglomerering, proteinbinding) og den samlede mikromiljø eller matrix. Endelig er teknikken begrænset i sin semikvantitativ karakter: Det kan kun være så kvantitativt som andre todimensionale mikroskopiteknikker af lignende opløsning, hvilket betyder, at det ikke let kan anvendes til at udføre opgaver såsom at karakterisere samlede organ belastning af et materiale.

Samlet, EDFM og HSI giver flere fordele i forhold til konventionelle nanomateriale billed- og karakterisering teknikker, såsom TEM, HAADF og DIC. EDFM / HSI giver mulighed for erhvervelse hurtigere image og analyse, hvilket sparer tid og omkostninger i forhold til en mere intensiv konventionnale teknikker. Derudover prøveforberedelse for EDFM / HSI er typisk både minimal og ikke-destruktiv, hvilket sparer tid og giver også mulighed for en mere fleksibel analyse af en given prøve, da det så kan anvendes til andre teknikker. Endvidere HSI er alsidig, giver mulighed for analyse af nanoskala materialer mange præparater og i en række matricer. Forskerholdet arbejder på at forfine beskrives her for andre materialer og prøvetyper, herunder en grundig vurdering af specificitet af teknologien metoden. Et kritisk næste skridt under efterforskning af forskergruppen er validering af disse teknikker mod traditionelle guld standarder (fx Raman, TEM, SEM) for de materialer og vævstyper af interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.