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Chemistry

Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53489
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Centre for Materials Science, School of Physical Sciences and Computing, University of Central Lancashire, 2School of Food Science & Nutrition, University of Leeds

Abstract

Vi presentiamo un metodo facile per preparare particelle lipidiche nanostrutturati stabilizzati con nanotubi di carbonio (CNT). A parete singola (incontaminato) e multi-pareti (funzionalizzati) CNT sono utilizzati come stabilizzatori per la produzione di emulsioni (O / W) olio-in-acqua di tipo Pickering. I lipidi cioè, Dimodan U e Phytantriol sono usati come emulsionanti, che in acqua in eccesso di auto-assemblano in fase Pn3m cubica bicontinuous. Questa fase altamente viscoso è frammentato in particelle più piccole che utilizzano un ultrasonicatore sonda in presenza di stabilizzanti tensioattivi convenzionali o CNT come fatto qui. Inizialmente, i nanotubi di carbonio (polvere) vengono dispersi in acqua seguita da un'ulteriore ultrasuoni con il lipide fuso per formare l'emulsione finale. Durante questo processo, i nanotubi di carbonio vengono rivestiti con molecole lipidiche, che a loro volta si presume circondare le goccioline lipidiche a formare un'emulsione particellare che è stabile per mesi. La dimensione media delle particelle lipidiche nanostrutturati CNT-stabilizzati è in submicron range, che regge bene il confronto con le particelle stabilizzata con tensioattivi convenzionali. Piccola dati angolo di raggi X dispersione conferma il mantenimento della fase cubica originale Pn3m nelle dispersioni lipidi CNT-stabilizzati rispetto alla fase lipidica puro (stato bulk). spostamento Blu e abbassamento delle intensità di G caratteristico e bande di CNT osservati in spettroscopia Raman G 'caratterizzano l'interazione tra CNT superficie e lipidi molecole. Questi risultati suggeriscono che le interazioni tra i CNT e lipidi sono responsabili per la loro stabilizzazione reciproca in soluzioni acquose. Poiché le concentrazioni di CNT impiegate per la stabilizzazione sono molto bassi e molecole lipidiche sono in grado di funzionalizzare i nanotubi di carbonio, la tossicità dei CNT dovrebbe essere insignificante mentre la loro biocompatibilità è notevolmente migliorata. Pertanto la presente approccio trova un grande potenziale in varie applicazioni biomediche, per esempio, per sviluppare sistemi nanocarrier ibridi per la consegna di multiple molecole funzionali come in terapia di combinazione o politerapia.

Introduction

Nel corso degli ultimi decenni, la nanotecnologia è emerso come un potente strumento in particolare nel campo dello sviluppo preclinico della medicina per combattere le malattie noti come il cancro 1. In questo contesto, le strutture in nanoscala con dimensioni <1.000 nm sono ampiamente esplorato come veicolo di consegna di varie biomolecole attive come la droga, proteine, acidi nucleici, i geni e gli agenti di diagnostica per immagini 1-4. Queste biomolecole o sono incapsulati all'interno delle nanoparticelle o coniugati sulla superficie delle nanoparticelle e sono rilasciati al sito di azione trigger come pH o 5,6 temperatura. Anche se estremamente piccole dimensioni, l'ampia superficie di queste nanoparticelle si rivela notevolmente vantaggioso per somministrazione mirata di biomolecole attive. Il controllo della dimensione delle particelle e la biocompatibilità è della massima importanza al fine di ottimizzare l'efficacia terapeutica e quindi l'applicabilità delle nanoparticelle 7,8.Lipidi 9-13, polimeri, metalli 14,15 16,17 e 18,19 nanotubi di carbonio sono comunemente impiegati come nanovettori per varie applicazioni biomediche e farmaceutiche.

Inoltre, le applicazioni nanocarrier basate su nanostrutture auto-assemblate lipidi hanno una grande importanza in molte altre discipline, tra cui industrie alimentari e cosmetiche 20,21. Per esempio, sono usati in proteine ​​di cristallizzazione 22, la separazione di biomolecole 23, come stabilizzanti alimentari esempio, in dolci 24, e nella fornitura di molecole attive come nutrienti, aromi e profumi 25-31. Autoassemblati nanostrutture lipidi non solo hanno la capacità di rilasciare molecole bioattive in modo controllato e mirato 32-38 ma sono anche in grado di proteggere le molecole funzionali dalla chimica ed enzimatica degradazione 39,40. Anche se planare doppio strato fluido è la più commsulla nanostruttura formata da molecole lipidiche anfifiliche in presenza di acqua, altre strutture quali esagonale e cubico sono anche comunemente osservati 20,41,42. Il tipo di nanostruttura formata dipende struttura forma molecolare lipidi ', la composizione lipidica in acqua, nonché dalle condizioni fisico-chimiche impiegate come temperatura e pressione 43. L'applicabilità di nanostrutture lipidi non planari soprattutto quella di fasi cubiche, è limitato a causa della loro elevata viscosità e consistenza dominio non omogenea. Questi problemi vengono superati disperdendo le nanostrutture lipidi in grande quantità di acqua per formare emulsioni contenenti micron o particelle micronizzate lipidi olio-in-acqua (O / W). In questo modo, un prodotto adatto a bassa viscosità può essere preparato mantenendo la struttura auto-assemblati lipidico originale all'interno delle particelle disperse. La formazione di queste particelle internamente autoassemblati (abbreviato come ISAsomes 44 > Eg, cubosomes da fasi cubiche e hexosomes da fasi esagonali) richiede generalmente una combinazione di una fase di ingresso ad alta energia e l'aggiunta di stabilizzanti quali tensioattivi o polimeri. Recenti ricerche in questa direzione dimostra l'applicazione di varie particelle solide 45 compresi nanoparticelle di silice 46, argilla 47-49 e nanotubi di carbonio 50 per la stabilizzazione delle emulsioni suddetti, opportunamente definito come Pickering 51 o emulsioni Ramsden-Pickering 52.

Negli ultimi anni, a base di carbonio nanostrutture, come i nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNTs), nanotubi a parete multipla carbonio (MWCNT) e fullereni hanno ricevuto una grande attenzione come nuovi biomateriali 53,54. Le preoccupazioni principali sono la loro tossicità 55-58, insolubilità in acqua 59 e quindi la loro biocompatibilità 56. Un modo efficace per affrontare questi problemi è la funzione di superficielizzazione utilizzando molecole non tossici e biocompatibili come lipidi. In presenza di acqua, lipidi interagiscono con CNT in modo che la superficie idrofobica del CNT è schermata dalla parte acquosa polare che i gruppi di testa idrofili lipidici aiuto loro solubilità o dispersione in acqua 60,61. I lipidi sono componenti integranti organelli cellulari così come alcuni materiali alimentari, quindi la loro decorazione dovrebbe idealmente diminuire la tossicità in vivo di CNT. Applicazioni biomediche basate su nanotubi di carbonio in modo indipendente 18,19 e nanostrutture lipidi 9-13 sono in fase di sviluppo estensivo ma le applicazioni che combinano le proprietà dei due non sono ancora ben esplorati-.

In questo lavoro, ci avvaliamo di due diversi tipi di lipidi e tre tipi di nanotubi di carbonio, di cui SWCNTs sono nella forma originaria, mentre MWCNT vengono funzionalizzati con idrossile e gruppi carbossilici. Abbiamo usato concentrazioni molto basse di CNT per preparare le dispersioni cuistabilità dipende da diversi fattori ad esempio, il tipo di lipidi, tipo di CNT, rapporto di lipidi per CNT utilizzato, nonché sui parametri sonicazione impiegate come potenza e durata. Questo protocollo video fornisce dettagli tecnici di un metodo di stabilizzazione cineticamente nanoparticelle lipidiche utilizzando vari CNT-stabilizzatori.

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Protocol

Attenzione: CNT utilizzati in questo lavoro sono sotto forma di nanoparticelle che possono avere rischi aggiuntivi rispetto ai loro omologhi di massa. L'inalazione di grafite, sia naturali che sintetici, può causare pneumoconiosi 62 simile a pneumoconiosi dei lavoratori del carbone. Inoltre, vi sono preoccupazioni relative alla tossicità di nanostrutture a base di carbonio e alcuni dei precedenti studi suggeriscono tossicità acuta e cronica associata con l'inalazione di CNT 63-68. Quindi, evitare l'inalazione di polvere fine CNT e gestire con grande cura. Se inalato, portare all'aria aperta. Se la respirazione è difficile, utilizzare l'ossigeno puro al posto e cercare di consultazione medica. formulazioni in soluzione / dispersione dei CNT sono piuttosto sicuro da maneggiare.

Attenzione: I lipidi e tensioattivi utilizzati in questo studio sono materiali per alimenti, e quindi non pericolosi in generale, ma sono irritanti per gli occhi e la pelle, e anche altamente infiammabile. Quindi, si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguate, come l'uso di itcontrolli gineering (cappa) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse), durante la manipolazione o la preparazione dei campioni di nanoparticelle. In caso di contatto con la pelle o con gli occhi, lavare immediatamente la pelle o con gli occhi con abbondante acqua per almeno 15 minuti. Consultare un medico se necessario.

1. Preparazione di lipidi / massa d'acqua Fasi

Attenzione: Conservare i lipidi in frigorifero a 4 ° C. lipidi Pure grado devono essere conservati in congelatore (-20 ° C). li aliquota in piccole fiale di vetro per evitare la contaminazione di tutto il magazzino e la comodità di gestione. Altri prodotti chimici tra CNT e tensioattivi possono essere conservati a temperatura ambiente, ma tenerli lontano dalla luce diretta del sole.

  1. Mantenere lipidi, cioè, Dimodan U (DU) e Phytantriol (PT) a temperatura ambiente per 15-20 minuti prima di aprire il coperchio della bottiglia / flacone per evitare la formazione di condensa.
    (Nota: DU è un gliceridi distillato composto da 96% monogliceridi e laresto sono digliceridi e acidi grassi liberi. Due componenti principali di monogliceridi a DU sono linoleate (62%) e oleato (25%). Da qui la parte idrofoba di DU contiene principalmente catene di C18 (91%), l'esatta composizione delle quali è il seguente; C18: 2 (61,9%), C18: 1 (24,9%), e C18: 0 (4,2%), dove C18 indica 18C-catena e il numero dopo i due punti indica il numero di legami C = C. PT è una miscela di isomeri ottici 3,7,11,15-tetrametil-1,2,3-hexadecanetriol. Esso non contiene un gruppo funzionale di estere, ma si compone di coda phytanyl molto ramificato con un headgroup tri-idrossi. Entrambi DU e PT formano fasi cubiche in presenza di acqua in eccesso, che è anche il caso per i nuclei di particelle lipidiche stabilizzati 13, 45).
  2. Sciogliere i lipidi mettendo fiale in un bagno di acqua calda o acqua bicchiere contenente mantenuto al di sopra di 60 ° C (riscaldamento agitatore magnetico: 230 V, 50 Hz, 630 W o simili da essere usato per riscaldare l'acqua in un becher).
  3. In alternativa fiale di calore con generatori di calore collettivi. Non riscaldare il lipide contenente flaconi direttamente sulla piastra calda per evitare gradiente di temperatura e successiva decomposizione dei lipidi.
  4. Pesare 500 mg di lipide fuso, in provetta precedentemente pesato (con tappo a scatto conica, 1,5 ml), con una pipetta Pasteur di vetro con un bulbo in lattice.
  5. Aggiungere 500 ml di acqua ultrapura (acqua resistività = 18,2 MW · cm) alla provetta sopra.
  6. Miscelare i componenti manualmente per 15 minuti con piccolo (su misura) spatola. Fare una tale spatola appiattendo la punta di un ago della siringa (0,9 mm x 40 millimetri di lunghezza cannula) utilizzando una pinza.
  7. Centrifugare la miscela di lipidi / acqua per 10 minuti ad una velocità di 2.000 x g. Ancora mescolare manualmente per 10 min, quindi equilibrare per 24 ore. Prima che caratterizza gli esempi, agitare per 5 minuti e poi lasciare a RT.
  8. Per garantire la formazione di una fase di equilibrio lipidico durante l'intero tubo, effettuare circa 10 cicli di gelo-disgelo e inte rmittently effettuare una fase di centrifugazione come sopra definito. Sia la forma altamente viscosi fasi lipidiche bulk DU e PT rendendo difficile gestire manualmente (Figura 1).
    Nota: il protocollo di cui sopra (sezione 1) è necessaria solo se si vorrebbe confrontare il comportamento nanostrutturale (tipo reticolare e le dimensioni di auto-assemblaggio) di particelle disperse con la fase lipidica sfuso e / o usarlo come un controllo per confermare la mantenimento di nanostruttura originale.

Figura 1
Figura 1. Preparazione di O / W emulsione particolato con consistenza fluida dalla fase lipidica altamente viscosi utilizzando il metodo di alta energia (ultrasuoni) e utilizzando diversi CNT-stabilizzanti, vale a dire SWCNT, MWCNT-OH, MWCNT-COOH (figura riprodotto da riferimento [50] con il permesso della Royal Society of Chemistry)._upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione di tensioattivi stabilizzata lipidi Particelle

  1. Preparare un 0,2% (w / w) tensioattivo (F127 Pluronic) in acqua.
    1. Sciogliere 200 mg di tensioattivo (bianco soffice polvere) in 100 ml di acqua ultrapura per agitazione per 20-30 min (su una piastra magnetica utilizzando una barra agitatore magnetico). F127 Pluronic è un tensioattivo non ionico ed è comunemente utilizzato per stabilizzare emulsioni. Si tratta di un copolimero a tre blocchi di PEO 99 -PPO 67 -PEO 99, e, quindi, richiede molto tempo per sciogliere in acqua.
  2. Aggiungere 500 mg di DU fuso o PT (utilizzando una pipetta Pasteur di vetro) ad un flacone di vetro (scintillazione sodico-calcico dotato di un foglio di tappo urea foderato, 20 ml).
  3. Aggiungere 9,5 g della soluzione F127 0,2%.
  4. Sulla macchina ultrasuoni della sonda, strettamente morsetto la fiala per la storta stare mascella (Storta Montaggio Stand conbasamento, morsetto, base, stelo, in gomma 3 mascella e Morsetto doppio), in modo che possa sopportare le vibrazioni generate mediante sonicazione.
  5. Inserire la sonda lega di titanio solido 13 mm (lunghezza del diametro x 139 mm) attaccato alla cella di sonicatore. Regolare l'altezza e la posizione del flacone per garantire che i suoi lati e sul fondo non toccano alla sonda. Una distanza di 0,5 cm tra la punta della sonda e il fondo del flacone di vetro dà buoni risultati.
  6. Sonicare la miscela per 10 minuti in un modo pulsato con impulsi 1 sec mediata da 1 sec tempo di ritardo al 35% (del massimo). La fiala diventa molto caldo a causa del calore generato durante sonicazione. Pertanto, lasciarlo raffreddare fino a RT, mette fuori il morsetto.
  7. Conservare la dispersione lattiginosa formata a temperatura ambiente per almeno 24 ore, prima di riutilizzare. Questo per garantire la stabilità contro la separazione di fase.
    Nota: prima e dopo l'utilizzo della sonda, pulirla con acetone, asciugare con un tovagliolo di carta, poi sciacquare con acqua ultrapura und asciugare una volta di più.

3. Preparazione di dispersioni di CNT Pure in acqua

  1. In due bicchieri separati, pesare in 4 mg polvere MWCNT-OH e MWCNT-COOH, che sono entrambi di colore nero.
  2. Aggiungere 500 ml di acqua ultrapura per ogni bicchiere. Utilizzando una sonda ultrasonicatore Sonicare miscela per 2 minuti in una modalità impulso continuo a 40% (del massimo). La conseguente concentrazione della dispersione MWCNT è di 8 mg / ml (soluzione madre).
  3. Diluire la soluzione madre MWCNT con adeguate quantità di acqua ultrapura per raggiungere 6,25, 5, 4, 2 mg / ml dispersioni MWCNT.
  4. Sonicare queste dispersioni come descritto in precedenza (vedi 3.2).
  5. Allo stesso modo, disperdere 3 mg di SWCNT in polvere (anche di colore nero) in 500 ml di acqua ultrapura per fare un / dispersione SWCNT ml 6 mg (soluzione).
  6. Diluire la soluzione SWCNT magazzino e sonicare loro come descritto in precedenza (vedi 3.2) per ottenere 0.5, 0.4, 0,3125, 0,2 mg / ml Vernice SWCNTrsions.
    Nota: Tutte le dispersioni sono chiari per circa 30 minuti, dopo di che i nanotubi di carbonio cominciano a depositarsi sul fondo.

4. Preparazione di CNT-stabilizzato nanostrutturati Lipid Particles (Figura 1)

  1. Pesare in 500 mg del fuso DU in una fiala di vetro.
  2. Aggiungere 9,5 ml di 6 mg / ml SWCNT dispersione al flaconcino.
  3. Sonicare la miscela CNT-DU utilizzando gli stessi parametri usati per la fabbricazione dispersioni CNT puri (vedi 3.2). Al raffreddamento a RT, le particelle lipidiche CNT-stabilizzato con conservato nanostruttura internamente auto-assemblati saranno pronti.
  4. In modo simile, preparare le particelle lipidiche utilizzando le dispersioni SWCNT 0,4 mg / ml e 0,2 mg / ml.
  5. Seguire i protocolli da 4.1 a 4.4 per rendere le particelle lipidiche utilizzando MWCNT-OH e MWCNT-COOH ma con concentrazioni diverse, vale a dire 8, 4 e 2 mg / ml di CNT.
  6. Allo stesso modo, preparare tre diversi dispersioni CNT-PT con 4 mg / ml MWCNT-OH e MWCNT-COOH E 0,4 ug / ml SWCNT. Si noti che le dispersioni CNT-PT richiedono meno potenza (35% del massimo) ma il tempo più lungo (15 min) in una modalità impulso continuo. Raffreddare le dispersioni di RT e lasciarli per 24 ore prima che li caratterizza.
    Nota: i parametri sonicazione possono essere diverse per i diversi lipidi (come per DU e PT qui) e per le diverse composizioni; hanno bisogno di essere ottimizzato per ottenere dispersioni ben stabilizzati-.

5. Controllo della Stabilità del lipide Dispersioni CNT-stabilizzati

  1. Monitorare la stabilità delle dispersioni mediante osservazione visiva: controllare se le dispersioni vengono destabilizzate o grumi sono formati nelle dispersioni.
  2. Scatta foto (con la macchina fotografica digitale) ad intervalli regolari. Per esempio, fotografare dispersioni ogni giorno nella prima settimana, poi ogni altro giorno per una settimana seguita da una volta a settimana per le prossime due settimane, e infine una volta al mese secondo il requisito.

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Representative Results

I seguenti risultati rappresentano a) la stabilità di dispersioni, b) la distribuzione delle dimensioni delle particelle lipidiche, c) il tipo di auto-assemblaggio e d) la prova per il rivestimento lipidico del CNT. La stabilità delle dispersioni (figura 2) è stato monitorato utilizzando una fotocamera da 5 MP con auto-focus e flash LED.

figura 2
Figura 2. Schema di tipi di CNT (A) MWCNT-OH, (b) MWCNT-COOH, e (C) SWCNT e le immagini dei corrispondenti emulsioni. Emulsioni stabili sono stati ottenuti solo in una determinata regione (ombreggiato) in cui il CNT di lipidi rapporto era ottimale; sotto e sopra emulsione stabile non formano a causa di una quantità troppo poco o troppo grande di nanotubi di carbonio, rispettivamente. Una freccia indica una tipica grumo CNT in un'emulsione instabile. Queste misurazioni sono state eseguite per una gamma di dispersioni DU-CNT; rappresequelli entative sono mostrati qui (figura riprodotta da riferimento [50] con il permesso della Royal Society of Chemistry). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Piccolo angolo di raggi X Scattering (SAXS) modelli sono stati registrati per determinare il tipo reticolare della nanostruttura interna delle isasomes stabilizzati (Figura 3A). La fotocamera SAXSpace è collegata ad un apparato generatore analitica a raggi X (ISO-DEBYEFLEX3003) con un tubo sigillato Cu-anodo operante a 40 kV e 50 mA. Il tubo a raggi X viene raffreddato con un circuito idraulico chiuso. L'unità SAXSpace blocco collimazione trasforma il fascio di raggi X policromatica divergente in una linea a forma di fascio verticale concentrato di radiazioni α Cu-K con una lunghezza d'onda, λ, di 0,154 nm. Per gli esperimenti SAXS stata scelta la modalità ad alta risoluzione, che permits per rilevare un vettore minima dispersione, q min, di 0,04 nm -1 (q = (4π / λ) sinθ, dove 2θ è l'angolo di scattering). Una fermata fascio semi-trasparente, permette di registrare il profilo attenuato fascio primario per l'esatta determinazione del vettore nullo dispersione e correzione trasmissione. Ciascuno dei campioni studiati è racchiuso nella stessa tenuta di vuoto, riutilizzabile capillare in quarzo da 1 mm a garantire esattamente lo stesso volume di scattering. Il capillare è stato posto nella fase del campione a temperatura controllata dotato di elementi Peltier, che è collegato ad un termostato di raffreddamento ad acqua per eliminare il calore in eccesso. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a 25 ° C con una stabilità alla temperatura di 0,1 ° C. Una pompa a vuoto è stato usato per evacuare la camera campione assicurare una pressione minima di circa 1 mbar. I modelli di scattering 1D sono stati registrati con un rivelatore di raggi X micro-strip. Questo rivelatore è unico conteggio di fotoni e ha un Sensitzona ive di 64 × 8 mm 2 che comprende 1.280 canali ciascuno con una dimensione di canale di 0,05 × 8 mm (v × h). La distanza del campione-detector era 317.09 mm. Ogni campione è stato esposto per tre volte per 300 sec, e loro profili di scattering integrati sono stati mediati.

Il software SAXStreat è stato impiegato per correggere i modelli di scattering rispetto alla posizione del fascio primario. I dati SAXS è stata ulteriormente la trasmissione-corretto impostando l'intensità di scattering attenuata a q = 0 per l'unità e lo sfondo è stato sottratto utilizzando il software SAXSQuant. La dispersione vettoriale q è stato calibrato con argento-behenato, che ha una distanza reticolare noto di 5,84 nm 69. Tutti i modelli di diffrazione registrati possono essere indicizzati con gruppo spaziale Pn3m (diamante fase cubica bicontinuous), in cui le riflessioni 110, 111, 200, 211, 220 e 221 sono stati identificati (Figura 3A). il lAparametro ttice, una per la fase Pn3m stata determinata mediante regressione lineare applicando l'equazione seguente lattice

a = 2 π / q hkl × √ (h 2 + k 2 + l 2) (1)

dove h, k e l sono gli indici di Miller.

La dimensione e la distribuzione delle dimensioni delle particelle lipidiche disperse (Figura 3B) sono stati determinati usando un analyer granulometria laser.

Figura 3
Figura 3. (A) SAXS modelli della fase Pn3m osservata per phytantriol bulk (PT) e dispersioni preparate con 5% in peso PT in acqua in eccesso con F127 e diversi stabilizzanti CNT corrispondente. Lo schema 3-D mostrata su destra visualizza parte della cella elementare della fase Pn3m, che è una fase cubica bicontinuous cui struttura è basata su doppia diamante (D) tipo di superficie minima. Le frecce blu indicano acquosa incontro canali ad angolo tetraedro, mentre le regioni idrofobiche e acquose sono colorati giallo e blu, rispettivamente. Picchi caratteristici per la fase Pn3m sono indicizzati come √2, √3, √4, √6, √8, √9 e corrispondenti indici di Miller sono indicati tra parentesi. Tutte le cime sopra sono visibili in PT rinfusa, mentre i primi quattro riflessioni sono visibili le dispersioni; comunque questo è sufficiente per identificare le nanostrutture Pn3m e valutare i loro parametri reticolari. Picchi evidenziati Basterischi y indicano la coesistenza di tipo Ia3d fase cubica, che di solito forma con contenuti di acqua inferiori, e quindi non si vede per dispersioni. particelle lipidiche con 'nanostruttura cubica' al loro interno sono comunemente chiamati come "cubosomes. (B) distribuzione dimensionale delle cubosomes preparato utilizzando vari stabilizzatori come misurato dalla diffusione di luce statica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Le interazioni tra i nanotubi di carbonio e particelle lipidiche sono stati studiati usando la spettroscopia Raman (Figura 4). I campioni: CNT, lipidi e particelle lipidiche CNT-stabilizzati sono stati disidratati, prima con azoto e poi tenerli in un essiccatore a vuoto per circa 20 min. Gli spettri sono stati registrati con uno spettrometro Horiba Jobin-Yvon Labram HR800 dotata di un Andor elettromagnete Charged Coupled Device (CCD) per la rilevazione della luce e una videocamera per guidare la raccolta spettrale. Una linea di eccitazione 532 nm di Nd: YAG è stato utilizzato per raccogliere spettri nell'intervallo 100-4,000 cm - 1 utilizzando un reticolo di 600 g mm - 1 divampò a 750 nm.. Obiettivo distanza di lavoro 50X con una apertura numerica di 0,50 è stato utilizzato per acquisire gli spettri e il foro confocale è stato fissato a 100 micron. Prima le misure, lo strumento è stato calibrato per i 520,8 cm - 1 riga spettrale di silicio. Tutti gli spettri sono stati raccolti a RT (25 ° C) ponendo il campione su vetrini fluoruro di calcio. Spectra stati acquisiti utilizzando il laser 532 nm e accumulato 5 volte con esposizione 1% per 10 sec. LabSpec suite di software 6 spettroscopia utilizzato per la pre-elaborazione dei dati grezzi e di interrogazione dei dati immediato.

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Figura 4. spettri Raman per disidratato (A) lipide pura, MWCNT-COOH e CNT-stabilizzato nanoparticelle lipidiche contenenti 5,0 mg / ml MWCNT-COOH, (B) lipidi pura, MWCNT-OH e nanoparticelle lipidiche contenenti 5,0 mg / ml MWCNT- OH, e (C) puro lipidi, SWCNT e lipidi nanoparticelle contenenti 0,3125 mg / ml SWCNT. Tutte le curve rappresentano una media di dieci spettri cui intensità, in unità arbitrarie vengono tracciati rispetto a lunghezza d'onda. Le linee verticali sono usati per guidare l'occhio, e per facilitare il rilevamento dei cambiamenti blu nella G e bande G '. Questi esperimenti sono stati eseguiti per DU. (D) Schema di possibili decorazione lipidi (auto-assemblaggio) sulla superficie CNT (figura riprodotto da riferimento [50] con il permesso della Royal Society of Chemistry). Clicca qui a view una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Stabilizzazione delle particelle lipidiche
Tre differenti CNT vengono utilizzati per stabilizzare le dispersioni lipidi; due dei quali sono multi-murata e funzionalizzati con -OH e gruppi -COOH, e uno è unico murato e non funzionalizzati (incontaminata). Il CNT variato in formato come segue (diametro x lunghezza): MWCNT-COOH: 9.5 nm x 1,5 micron; MWCNT-OH: 8-15 nm x 50 micron; SWCNT: 1-2 nm x 1-3 micron. I nanotubi di carbonio in polvere sono stati dispersi in acqua dalla sonda ultra-sonicazione. dimensioni di cui sopra dei CNT rischiano di diminuire ulteriormente a causa di ultra-sonicazione, anche se in modo non uniforme. Dispersioni CNT in acqua pura iniziato separando dopo circa 20 minuti, quindi un ulteriore lavoro è stato eseguito entro questo tempo vale a dire, l'aggiunta di lipidi e secondo sonicazione. Quest'ultimo (ultrasuoni eseguita sulle miscele lipide-CNT) assiste in fusione e abbattere grandi e incoerenti domini lipidici formati durante l'idratazione in porzioni sub-micron. Disperdendo l'i lipidi di massan questo modo facilita la formazione di equilibrio di nanostrutture auto-assemblate, che non richieda una diversa rigorosi cicli di gelo-disgelo e / o lungo periodo di tempo (giorni o settimane). La maggior parte si rompe fase lipidica in nanoparticelle, mentre i nanotubi di carbonio rivestiti di lipidi presumibilmente formano conchiglie intorno a loro. Ultra-sonicazione migliora le interazioni idrofobiche tra i nanotubi di carbonio e le catene alchiliche di molecole lipidiche che decorano così CNT di catene di lipidi alchil. Così CNT rivestiti stabilizzare la fase lipidica frammentato portando ad una emulsione particolato. Questa stabilizzazione reciproca evita l'aggregazione di CNT e disperde le particelle lipidiche. Tali dispersioni vengono anche chiamati Pickering (dovute all'uso di particelle solide) tipo emulsioni olio-in-acqua (O / W), dove i lipidi formano 'fase oleosa' mentre 'acqua in eccesso' costituisce il mezzo di emulsione continuo (Figura 1 ). parametri di ultrasuoni (lunghezza dell'impulso, tempo di ritardo e di potenza), i parametri fisico-chimici di uno stabilizzatore(Ad esempio, dimensioni, funzionalizzazione), concentrazione della fase dispersa e la composizione della dispersione (ad esempio, CNT rapporto lipidi) sono essenziali per garantire la stabilità finale delle dispersioni e quindi devono essere ottimizzati per diversi sistemi (lipidi).

Ottimizzazione del CNT al rapporto di lipidi per emulsioni stabili
Una vasta gamma di concentrazioni per ciascun CNT-type (Figura 2) è stato impiegato per stabilizzare i nanostrutture auto-assemblate ottenuti da due differenti lipidi. Tuttavia, emulsioni omogenei e stabili si formano in un particolare intervallo di CNT rapporto lipidi; troppo elevati rapporti causano l'aggregazione di nanotubi di carbonio, mentre troppo bassi rapporti portano a emulsioni instabili, perché non ci sono abbastanza CNT per realizzare una copertura delle particelle superficie sufficiente. Migliori condizioni di stabilizzazione sono stati trovati con concentrazioni tra 3-5 mg / ml per MWCNT-COOH e MWCNT-OH, mentre per SWCNT nella gamma di 0,3-,45ug / ml.

Caratterizzazione morfologica delle particelle lipidiche
Le misure SAXS verificare che le particelle lipidiche del PT mantengono la nanostruttura originale cubica fase (indicato dalla fase di massa) (Figura 3A). Si presume che la fase cubica è anche trattenuto in caso di particelle di uranio impoverito, tuttavia questo ha bisogno di ulteriori conferme in quanto non è stato studiato nei lavori in corso. Il parametro reticolare osservata per massa fase Pn3m di PT è 6.84 nm, che su di dispersione aumenta a 7,1 nm. Il parametro reticolare inferiore per fase bulk è attribuita alla mancanza di acqua in eccesso, che può essere confermato anche dalla coesistenza di fasi Ia3d (picchi indicati con * nella Figura 3A). La fase Ia3d si trova di solito in condizioni idriche limitate. I parametri di reticolo di fase Pn3m osservato per tutte le particelle lipidiche disperse (cioè, stabilizzata da tensioattivi come anche per tutti i tipi CNT) sono practically le stesse che indicano condizioni di acqua in eccesso. Ciò esclude anche la possibilità di disturbi CNT-driven a livello molecolare che, altrimenti, potrebbe aver innescato un cambiamento della fase lipidica.

Le distribuzioni dimensionali delle cubosomes sono dati dalle distribuzioni di volume ponderato come mostrato nella Figura 3B. Sebbene le particelle CNT-stabilizzati mostrano una distribuzione di dimensione di larghezza, la maggioranza della mostra particelle di dimensioni tra 532-760 nm, che sono paragonabili alle dimensioni del tensioattivo stabilizzato particelle lipidiche (674 nm).

Rivestimento dei lipidi del CNT
Per CNT puri, bande di grafite tipico Raman sono visti negli spettri Raman. La banda G corrispondente alla vibrazione nel piano di 'legame CC', il gruppo D (non mostrato) che è dovuto alla presenza di disordine sistemi carbonio e banda G 'che è attribuito alla connotazione del gruppo D 70 sono chiaramente osservato. Su interactisu CNT con lipidico e sulla formazione di particelle lipidiche CNT-stabilizzati (confrontare curve verde e blu in figura 4), ​​si osserva uno spostamento di numeri d'onda superiori (blu shift). Lo spostamento blu osservato, potrebbe essere dovuta a: i) ad alta pressione esercitata su nanotubi di carbonio durante ultrasuoni con conseguente loro dispersione in contrapposizione a uno stato in bundle quando puro 70,71, e / o ii) interazioni tra CNT e molecole lipidiche tramite rivestimento di nanotubi di carbonio da lipidi (ad esempio spostamento verso il blu è stato riportato in precedenza da Douroumis et al. 72 per lipidici SWCNTs rivestiti).

La diminuzione delle intensità relative dei picchi CNT e l'aspetto dei segnali lipidici (da curve rosse di lipidi pura (figura 4) conferma ulteriormente il rivestimento di nanotubi di molecole lipidiche. Questo suggerisce che le interazioni idrofobiche tra CNT e catene alchiliche di molecole lipidiche decorare l' superficie CNT in modo tale che gruppi di testa idrofili faccia regioni acquosa così Stabilizing O / W emulsione, come mostrato dallo schema in figura 4D.

Abbiamo dimostrato un metodo intelligente e semplice della cineticamente stabilizzazione del tipo O / W emulsione di particelle lipidiche nanostrutturati utilizzando vari CNT. Concentrazioni molto basse (<10 mg / ml) di CNT sono adeguate per stabilizzare la dispersione lipidica nanoparticelle, che è promettente specificamente per applicazioni in vivo. Decorazione dei CNT da molecole lipidiche si prevede di ridurre al minimo la loro tossicità, migliorando la biocompatibilità. La prospettiva di caricamento di molecole funzionali all'interno del lipidico auto-assemblaggio, nonché sulla superficie CNT fornire un potenziale illimitato alle particelle lipidiche CNT-stabilizzati nel settore delle scienze biomediche in particolare nel contesto di terapie combinate contro le principali malattie 73.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il Dott Matthew J. Baker, ora presso l'Università di Strathclyde, Glasgow per il supporto con esperimenti Raman e Mr. Nick Gaunt per la sua prima opera di questo progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimodan U Danisco 15312 Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Phytantriol (> 95%, GC) TCI Europe N.V. P1674 Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Single walled Carbon Nanotubes (90%) Nanostructured & Amorphous Materials, Inc.  1246YJS Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Multi-walled carboxylic acid functionalized Carbon Nanotubes (> 80% Caron basis, > 8% carboxylic acid functionalized) Sigma-Aldrich Co. LLC  755125 Store at room temperature. Away from direct light. Causes serious eye irritation. May cause respiratory irritation.
Graphitized Multi-walled hydroxy functionalized Carbon Nanotubes (99.9%) Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. (NanoAmor)  1224YJF Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Pluronic F127 Sigma-Aldrich Co. LLC  P2443 BioReagent, suitable for cell culture. Not a hazardous substance or mixture. Store at room temperature.
Acetone (99.5%) Fisher Scientific  10134100 Highly flammable liquid. Causes serious eye irritation. May cause drowsiness or dizziness.
Jars with loose, enfolding lids (375 ml) VWR International Ltd 216-3308
Beaker, 1,000 ml Fisher Scientific  12942161 heavy duty, low form, with spout and graduations
Pasteur glass pipette (150 mm length) with latex bulb Fisher Scientific  10006021
Microcentrifuge tube conical snap cap 1.5 ml Fisher Scientific  11558232
Spatula Fisher Scientific  11352204
Heating magnetic stirrer Fisher Scientific  11715704
Magnetic stirrer bars (cylindrical, opaque PTFE, 30 mm x 7 mm (l x diameter)) Fisher Scientific  10011792
Needle (0.9 mm x 40 mm cannula length) Terumo UK Ltd MN-2038MQ
Retort Stand Set - With stand, clamp, base, rod, rubber 3 jaw and bosshead Camlab Ltd, UK 1177157
Millipore water equipment Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D Digital Microcentrifuge Progen Scientific C-2400
Probe ultra-sonicator, with 13 mm  SONICS, Vibracell,  USA
5 MP camera with auto-focus and LED flash Samsung Galaxy Fame Mobile camera
Raman Spectrometer Horiba Jobin-Yvon LabRAM HR800 spectrometer
Mastersizer 3000  Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
Small angle X-ray scattering (SAXS) SAXSpace camera (Anton Paar, Graz, Austria), X-ray generating equipment (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), closed water circuit (Chilly 35, HYFRA, Germany). 

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Patil-Sen, Y., Sadeghpour, A., Rappolt, M., Kulkarni, C. V. Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes. J. Vis. Exp. (108), e53489, doi:10.3791/53489 (2016).

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