Questo manoscritto descrive come preparare biochip fluidici con cellule epiteliali branchiali di trota iridea per l'uso in un sensore di impedenza portatile per celle elettriche. Viene inoltre descritto il protocollo per l'esecuzione di un test rapido di tossicità dell'acqua potabile con il sensore.
Articolo metodologico
Preparazione e test di impedenza a base di biochip fluidici con le cellule RTgill-W1 per valutare rapidamente campioni di acqua potabile per la tossicità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo manoscritto descrive come preparare biochip fluidici con cellule epiteliali branchiali di trota iridea (RTgill-W1) per l'uso in un sensore portatile di tossicità dell'acqua. Un monostrato di cellule RTgill-W1 si forma sugli elettrodi di rilevamento racchiusi all'interno dei biochip. I biochip vengono quindi utilizzati per i test in un dispositivo portatile di rilevamento dell'impedenza delle celle elettriche (ECIS) progettato per test rapidi di tossicità dell'acqua potabile. Il manoscritto descrive inoltre come eseguire un test di tossicità utilizzando i biochip preparati. Un campione di acqua di controllo e il campione di acqua di prova vengono miscelati con mezzi in polvere predosati e iniettati in canali separati del biochip. Le letture dell'impedenza provenienti dagli elettrodi di rilevamento in ciascuno dei canali del biochip vengono misurate e confrontate da un programma software statistico automatizzato. Lo schermo dello strumento ECIS indicherà "Contaminazione rilevata" o "Nessuna contaminazione rilevata" entro un'ora dall'iniezione del campione. I vantaggi sono la facilità d'uso e la risposta rapida a un ampio spettro di sostanze chimiche inorganiche e organiche a concentrazioni rilevanti per la salute umana, nonché la stabilità a lungo termine dei biochip conservati in uno stato pronto per i test. Le limitazioni sono la necessità di conservazione a freddo dei biochip e la limitata sensibilità ai pesticidi che inibiscono la colinesterasi. Le applicazioni di questo rilevatore di tossicità sono per test rapidi portatili sul campo di forniture di acqua potabile da parte del personale di medicina preventiva dell'esercito o per l'uso presso impianti di trattamento delle acque comunali.
Introduzione
L'obiettivo generale era quello di sviluppare un metodo per la semina delle cellule, stoccaggio e verifica dei biochip fluidici nel biosensore ECIS. L'obiettivo per lo sviluppo di questo biosensore è stato quello di soddisfare le specifiche Army per un dispositivo portatile di campo che potrebbe rilevare possibile contaminazione di acqua potabile utilizzata dai soldati. I requisiti per il sensore di tossicità erano che potrebbe rilevare un ampio spettro di composti tossici industriali rapidamente (entro un'ora) a concentrazioni rilevanti per la salute umana, che il dispositivo sia campo portatile e componenti biologiche avrebbe una shelf-life di almeno nove mesi. Refrigerazione, ma non gelida, di componenti deperibili era accettabile.
Storicamente, campo portatili tecnologie di controllo dell'acqua con una componente biologica a loro (come gli anticorpi, enzimi, o acidi nucleici) sono stati 1-3 specifico analita. Lo svantaggio di questi tipi di biosensori è che essi ONLy rilevare un tipo di sostanza chimica alla volta. I sensori multipli sono necessari se si sospetta che più di un chimico è presente. Se un sensore specifico non è nel repertorio di prova, contaminanti chimici nell'acqua potrebbe facilmente passare inosservato.
I sensori di tossicità ad ampia base, d'altra parte, hanno il potenziale per colmare questo divario tecnologico. Questi hanno solitamente un componente cellulare a loro 4-8. I vantaggi di biosensori tossicità ampia base sono che possono rilevare la presenza di una vasta gamma di contaminanti chimici, comprese miscele e incognite, in un periodo relativamente breve di tempo 5,9,10.
Il concetto di utilizzare la misura della impedenza elettrica di monostrati cellulari come possibile sensore tossicità, che è noto anche come elettrico cellula-substrato impedenza di rivelazione (ECIS), è stato descritto da Giaever e Keese 11. Negli ultimi due decenni si è dimostrato essere un indicatore sensibile di viab celluleility e citotossicità. Fondamentalmente, il monostrato cellulare che viene fatto aderire agli elettrodi sui biochip è esposto ad elevata frequenza e bassa tensione e amperaggio alternata segnale corrente. Il monostrato confluente di cellule impedisce il flusso di elettroni. Quando l'integrità del monostrato cellulare è compromessa (ad esempio quando viene introdotto un composto chimico), il sensore ECIS registra una variazione della impedenza elettrica 11-14. La figura 1 illustra il principio di ECIS rispetto al monostrato di cellule sul biochip .
Figura 1:.. Principio di ECIS Illustrazione di un monostrato di cellule su un biochip con lettore di ECIS semplificato schema elettrico Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Inizialmente, linee cellulari di mammiferi sono state seminate in biochip fluidici e sono stati utilizzati nella tecnologia dei sensori ECIS descritto qui 12. Queste cellule non erano pratici per l'uso in campo, tuttavia, perché richiedevano modifiche di supporto frequenti, aveva una shelf-life limitata, e richiesto un ambiente artificiale CO 2 ed una temperatura di incubazione C 37 °. Si è scoperto che una linea cellulare disponibile in commercio derivato da cellule epiteliali trota arcobaleno Gill (RTgill W-1 cellule) potrebbe essere testato a temperatura ambiente a CO ambiente 2, formato un monostrato confluente in biochip, potrebbero essere conservati a temperature di refrigerazione, e avuto una risposta rapida (1 ora o meno) per un ampio spettro di sostanze chimiche a concentrazioni rilevanti per la salute umana 12. Applicazioni di cellule RTgill-W1 in tossicologia, nonché nella ricerca di base, vengono esaminati da Lee et al. 15
Metodi per la semina, stoccaggio e verifica dei biochip fluidici contenentimonostrati di cellule RTgill-W1 su biochip fluidici in un biosensore ECIS sono descritte qui. I biochip fluidici possono essere conservati per un massimo di 9 mesi in uno stato refrigerato e possono essere spediti in un contenitore di stoccaggio a freddo, per la prova di acqua potabile supplies.The che accompagnano i lettori ECIS, o unità di prova, vengono spediti separatamente. I biochip hanno due componenti a loro; uno strato superiore in policarbonato con due canali fluidi separati, e uno strato inferiore elettronico che contiene quattro elettrodi per canale per il rilevamento di impedenza. Ci sono 10 elettrodi di lavoro per blocco; ogni elettrodo è di 250 micron di diametro. I biochip assemblati hanno collegamenti elettrodo d'oro per l'acquisizione di letture di impedenza quando viene inserito nell'unità di test ECIS. Ciascuno dei due canali a forma di U fluidici allegate terrà 2 ml della sospensione cellulare RTgill-W1. Figura 2 mostra un biochip fluidico nel lettore ECIS con un ingrandimento di un cellule confluenti su un singolo elettrodo di rilevamento.
Figura 2:.. Biochip Fluidic in ECIS Reader area ingrandita mostra un monostrato confluente di cellule RTgill-W1 su un singolo elettrodo di rilevamento Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Protocollo
1. Preparazione di materiali di prova
NOTA: Per preparare i biochip per il test, diversi palloni confluenti di cellule RTgill-W1 deve essere pronta. Una buona stima del numero di flaconi necessari è uno confluente pallone T175 per 16 biochip per essere seminati.
- Effettuare le seguenti operazioni in un armadietto II classe biologica di sicurezza (biohood) con tecnica asettica. Utilizzare etanolo al 70% per la disinfezione del biohood e qualunque materiale poste nel cappuccio.
- Preparare substrato fibronectina per i biochip fluidiche da scongelamento un flaconcino 1 mg di fibronectina e diluendo in 100 ml di sterili L-15 supporti per una concentrazione di 10 ug / ml. Congelare in 40 ml aliquote in 50 ml provette coniche polipropilene sterili a -20 ° C. Scongelare a temperatura ambiente diverse ore prima di semina i biochip. Una volta scongelato, non ricongelare.
- Preparare mezzi di coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di 200 mM un sup L-alanil-L-glutamminacomplemento, e 5 ml di una soluzione di penicillina / streptomicina (10.000 unità di penicillina / ml e / ml 10.000 mg di streptomicina) stock a 500 ml di L-15 media. Questo produrrà 560 ml di terreni di coltura delle cellule che contengono il 9% di siero. Refrigerare.
Nota: Questo sarà il supporto completo di coltura cellulare utilizzato per le fiasche di coltura e dei biochip.
- Polvere media Fiale
- Preparare prima del tempo fiale 0,1 dram snap-cap contenenti 60 mg ± 0,5% di polvere di L-15ex utilizzando un dosatore di polvere automatizzato. Etichettare le fiale con la data della polvere è stata erogata e fiale refrigerare (in quantità di 50) in poli sacchetti richiudibili metallizzati; ciascuno contenente tre pacchetti essiccazione di gel di silice 1 g.
Nota: le fiale L-15ex multimediali in polvere possono essere fatte e conservate per un massimo di 9 mesi di anticipo di test.
- Preparare prima del tempo fiale 0,1 dram snap-cap contenenti 60 mg ± 0,5% di polvere di L-15ex utilizzando un dosatore di polvere automatizzato. Etichettare le fiale con la data della polvere è stata erogata e fiale refrigerare (in quantità di 50) in poli sacchetti richiudibili metallizzati; ciascuno contenente tre pacchetti essiccazione di gel di silice 1 g.
- Fare una soluzione di 100 ml di 20% di candeggina diluendo candeggina con acqua deionizzata (DI). Stima che saranno necessari 5 ml di soluzione di candeggina per ogni biochip.
- Fare assemblee tubi biochip tagliando 27 sezioni di tubo mm biocompatibile autoclavabile (2 sezioni per ogni biochip per essere seminati) e montare entrambe le estremità del tubo con raccordi luer policarbonato antiscivolo. Mettere assemblaggi di tubi in un sacchetto autoclavabile e autoclave per 8 minuti a 134 ° C. Anche i tappi autoclave biochip (2 per biochip) in un sacchetto a parte con le stesse impostazioni.
- acqua deionizzata Autoclave per 30 minuti at121 ° C.
Nota: Questa acqua verrà utilizzata per il risciacquo biochip dopo la semina. Stimano che saranno necessari 10 ml per ogni biochip.
Nota: Il volume effettivo di ciascun canale biochip è di 2 ml, ma 5 ml di acqua sterile viene risciacquato attraverso ciascun canale dopo la rimozione della soluzione di candeggina. - Fare assemblee tubi iniezione siringa tagliando 27 sezioni mm di tubi biocompatibile e allegando maschi raccordi slittamento luer ad entrambe le estremità del tubo. Posizionare assiemi tubi in un sacchetto di sterilizzazione carta termosaldabile ed autoclave per 8 minuti a 134 &# 176; C.
2. Procedura Biochip Semina Fluidic
Nota: Eseguire tutte le procedure in cui le biochip o dei media è gestito in un armadio di sicurezza biologica di classe II con tecnica asettica.
- Ventiquattro ore prima della semina in programma, rimuovere i biochip da imballaggio produttore al biohood e mettere in custodie di plastica sterilizzati.
- Sterilizzare i biochip utilizzando una soluzione di candeggina al 20% come segue
Nota: Storicamente, questa procedura di sbiancamento ha impedito la crescita di funghi nei biochip durante la conservazione a lungo termine nel caso in cui la sterilizzazione al plasma dei biochip fatte dal produttore non è stato efficace.- Utilizzando a 20 ml siringa sterile con un tubo di iniezione la siringa attaccata e lavorare nella biohood, iniettare 2 ml della soluzione di candeggina 20% in ciascun canale del biochip. Lasciare i biochip a sedere per 1 ora con la soluzione di candeggina.
- Dopo un'ora, asp vuotoirato la soluzione di candeggina da entrambi i canali utilizzando un montaggio slittamento luer maschio sterile attaccato al tubo di aspirazione a vuoto. Utilizzare uno dei gruppi di tubi biochip come uno scarico quando il risciacquo i biochip.
- Usando una siringa sterile 20 ml collegata ad un gruppo di iniezione siringa sterile, lavare ogni canale del chip con 5 ml di acqua sterile, permettendo all'acqua in eccesso di defluire in un contenitore in biohood. Poi il vuoto-aspirato l'acqua come appena descritto per la candeggina e posizionare i biochip nuovamente dentro le custodie in plastica e lasciare nel biohood fino seminati con cellule il giorno seguente.
- Sessanta minuti prima semina i biochip, iniettare 2 ml della / soluzione fibronectina ml 10 mg in ciascun canale del biochip. Lasciare i biochip nella biohood per 60 minuti, e poi aspirare aspirare al largo della fibronectina (come descritto al punto 2.2.3) prima della semina il biochip con le cellule. Mettere due sezioni delle assemblee tubi biochip sterili (vedisezione 1.4) sulle porte dei biochip.
- Trypsinize un confluenti RTgill-W1 pallone T175 per ogni 16 biochip utilizzando procedure descritte nella American Type Culture Collection (ATCC) prodotto descrizione foglio 16.
- Aspirare fuori il supporto dal pallone confluenti (s) di cellule.
- Risciacquare lo strato di cellule con 15 ml di PBS e quindi aspirare via.
- Aggiungere 6 ml di tripsina / EDTA per lo strato di cellule in ogni contenitore T175 e consentono alle cellule di trypsinize per ~ 5 min.
- Aggiungere 15 ml di completo supporto L-15 coltura cellulare per ogni pallone per fermare tripsinizzazione.
- Combinare le sospensioni cellulari in un contenitore sterile monouso.
Nota: le dimensioni del contenitore può variare da 150-500 ml, a seconda del numero di biochip essere testa di serie. Stima che saranno necessari 5 ml di sospensione cellulare per biochip.
- Rimuovere ~ 1 ml di sospensione cellulare e posto in una provetta per il conteggio. Utilizzando un microscopio campo chiaro con una oggettivazione 10Xve e un emocitometro, conteggio un'aliquota 10 microlitri di cellule e calcolare il volume di completa mezzi di coltura delle cellule L-15 necessario per raggiungere una sospensione cellulare di 2,5 x 10 5 cellule / ml.
Nota: Se si utilizza la sospensione cellulare alle sementi fiaschi di continuare la cultura, questo sarebbe il punto di farlo. Regolare la concentrazione di sospensione cellulare utilizzando completo supporto L-15 coltura cellulare. - Utilizzando una sterile 20 ml syringeattached ad un complesso di tubo di iniezione siringa sterile (vedi paragrafo 1.6), iniettare 2,5 ml di sospensione cellulare nella porta esterna di ciascun canale del biochip (cioè, le porte che non hanno il tubo allegato), permettendo alcuni di sospensione cellulare in più per defluire dal tubo in un contenitore per rifiuti nel biohood.
Nota: Questo farà sì che l'intero canale e il tubo attaccato sarà pieno di sospensione cellulare.- Creare un ciclo chiuso per ogni canale biochip inserendo l'estremità libera del tubo con le rac luerng nelle porte esterne per ogni canale.
- Pulire tutti i supporti in eccesso fuori dei circuiti chiusi con un tovagliolo di carta inumidito con etanolo al 70% e posizionare i biochip nella scatola di plastica in un incubatore a 20 °. Dare ad ogni biochip un numero di identificazione univoco.
- Nei giorni 4 e 7, rimuovere i biochip dalla C incubatore 20 ° e ricostituire i mezzi di comunicazione in tutti i biochip con completa mezzi di coltura cellulare L-15 a temperatura equilibrata. Seguire la stessa procedura descritta nella fase 2.6, tranne l'uso solo L-15 coltura cellulare multimediale, invece (senza sospensione cellulare). Mettere i biochip di nuovo in C incubatore 20 ° dopo l'alimentazione giorno 4.
- Dopo l'alimentazione giorno 7, rimuovere ed eliminare i tubi dai chip e inserire i tappi di scarico autoclave nei biochip.
- Mettere i biochip in una scatola in un incubatore a 6 ° fino a quando utilizzato per il test.
Nota: I chip possono essere conservati a temperature di refrigerazione per un massimo di 9 mesi e sono ancora vitali per il test in i lettori ICE.
3. Test ECIS con Biochips
- Preparare i prodotti chimici di test se si utilizza. (Vedere Brennan, et al. 2012 7 per la preparazione di prodotti chimici di prova).
- Rimuovere il lettore ECIS e forniture di test dalla custodia. Rimuovere un biochip preparata dalla C incubatore 6 °. Posizionare il biochip su un tovagliolo di carta. Accendere il lettore ECIS.
- Utilizzando 10 ml siringhe, erogare 10 ml di acqua di controllo in un 0,5 once barattolo di controllo di plastica trasparente con etichetta e 10 ml di campione in esame in un 0,5 once barattolo di prova di plastica trasparente con etichetta.
Nota: 1) Assicurarsi di rimuovere le bolle per una misurazione accurata. 2) Le siringhe e barattoli sono codificati a colori; blu per il controllo e rosso per test. - Rimuovere due fiale di media in polvere dai sacchetti di alluminio. Aprire una delle fiale di media in polvere (strumento multiuso uso, se necessario) e versare tutto il contenuto di una fiala dentro il barattolo con l'acqua di controllo, lasciando cadere l'intero flacone insoluzione pure. Ripetere questa procedura con il vaso di prova. Cap e agitare i vasi per assicurare che la polvere è sciolta.
- Riempire ciascuno dei colori da 10 ml siringhe con 9 ml di uno di controllo (blu siringa) o il test (siringa rossa) soluzioni di rispettive fiale. Rimuovere le bolle d'aria dalle siringhe.
- Rimuovere i tappi dai porti biochip e collegare lo scarico.
- Posizionare il biochip nel vassoio di plastica estraibile nel lettore ECIS e chiudere il coperchio.
- Fissare riempite alle porte biochip esterni e collegare lo stantuffo della siringa.
- Dalla schermata principale, selezionare "NEXT" per avviare pre-test.
Nota: il software Reader controllerà impedenze. Se impedenze sono nel raggio d'azione impostata dall'utente (in genere tra 1.000 e 3.000 ohm) lo schermo registrerà "Cartuccia Passed" come indicato nella figura 3, e richiedere all'utente di selezionare "Avanti" e il software procedere al punto 3.10). Se le impedenze non rientranola gamma insieme a causa di un biochip difettoso o collegamento difettoso del biochip al lettore (di solito a causa di un disallineamento degli elettrodi), poi lo schermo registrerà "Cartuccia non riuscita" e l'utente avrà la possibilità di uno "Abort" o "Verifica" il test.- Selezionare "Abort" per tornare al punto 3.9). Selezionare "Verifica" per passare al punto 3.10) dopo aver ricevuto un messaggio "Cartuccia Passed" e selezionando "Avanti".
Nota: Si consiglia di prendere il biochip fuori ed esaminarlo per difetti o perdite se un "Cartuccia non riuscita" messaggio viene ricevuto prima di procedere con un nuovo biochip visivamente.
- Selezionare "Abort" per tornare al punto 3.9). Selezionare "Verifica" per passare al punto 3.10) dopo aver ricevuto un messaggio "Cartuccia Passed" e selezionando "Avanti".
Figura 3:. ECIS Reader Schermata di un biochip con letture di impedenza accettabili La schermata mostra le letture dell'impedenza iniziali in ohm di ciascuno dei 4 coelettrodi ntrol (CE) e 4 elettrodi campione (SE) all'interno del biochip fluidica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Quando viene richiesto da parte del lettore, inserire informazioni campione utilizzando una tastiera virtuale e quindi selezionare "Accetto" quando hai finito.
Nota: il software di lettura ECIS si stampare automaticamente ogni insieme di dati con la data, l'ora e altre informazioni inserite dall'utente; quali il numero biochip, e il tipo di chimica e concentrazione. Due minuti di dati di impedenza saranno raccolti dal biochip inserito e il tempo di un timer sullo schermo conterà verso il basso. - Dopo due minuti, quando richiesto da istruzioni su schermo che vengono a lampeggiare entro una scatola rossa, premere "Next". Quando viene richiesto da una casella verde lampeggiante a "iniettare campioni ora", iniettare il controllo e mezzi di prova dalle siringhe attaccate contemporaneamente nella chann biochipEls. Lasciare le siringhe in atto sui biochip una volta terminato.
Nota: valori di impedenza saranno raccolti una volta al minuto per 60 min. Se il software di lettura ECIS determina che il canale di trattamento è statisticamente diverso dal canale di controllo in qualsiasi punto tra 10 e 60 minuti dopo l'inizio della prova, quindi la visualizzazione su schermo indica che il campione è "contaminato". Se il trattamento non è diverso dal canale di controllo, lo schermo indicherà "No Contaminazione Detected" alla fine della prova. - Registra i risultati dei test come contaminati o meno contaminati per ogni campione.
- Alla fine del test, rimuovere ed eliminare il biochip. Risciacquare e aria asciugare le siringhe, fiale di prova e vassoio di plastica estraibile che ospitava il biochip durante le prove.
Nota: Il lettore ECIS dispone di 4 GB di memoria integrata per il software operativo, modelli di controllo ei file di test generati da esecuzione di un test. Ciò consente vari thfile di test ousand per essere memorizzati sul lettore. I file possono essere recuperati con un salto di unità USB e trasferiti a un computer per ulteriori analisi a scopo di ricerca, se desiderato.
Risultati
La tecnologia ECIS descritto in questo documento sottoposto ai test presso la US Environmental Protection Agency (EPA) -sponsored tecnologia di test e Evaluation Program (TTEP). Tredici prodotti chimici sono stati selezionati per testare come rappresentanti di un ampio spettro di composti industriali tossici che potrebbero essere possibili contaminanti di acqua potabile. Durante il test, 9 dei 13 sono stati rilevati da ECIS all'interno di un ora a concentrazioni che sono rilevanti per la salute umana 8. La tabella 1 illustra i risultati di questo test contaminante. Figura 4 è rappresentativo di ciò che un risultato "contaminato" sarà simile a lo schermo del lettore ECIS. Per la maggior parte, impedenze cellulari diminuiti per campioni contaminati rispetto ai controlli. Occasionalmente, alcuni composti possono causare un aumento di impedenza.
Anche riassunti nella Tabella 1 è il test di acqua pulita. Quaranta campioni di acqua pulita sono stati eseguiti e nessuna contaminazione è stata rilevata in nessuno dei campioni (vedi figura 5) per una schermata rappresentante di "nessuna contaminazione rilevata".
Figura 4: ECIS Reader Schermata di un "contaminati" Campione d'acqua Un esempio di grafica impedenza normalizzati e risultati da un campione d'acqua che è stata contaminata.. Le linee blu rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi di controllo; linee rosse rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi campione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: ECIS Reader Schermata di una "contaminazione rilevata" Campione d'acqua Un esempio di grafica impedenza normalizzati e risultati da un campione d'acqua che non è stato contaminato.. Le linee blu rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi di controllo; linee rosse rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi campione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Categoria | contaminante | Concentrazione testata (mg / L) 1 | Rilevato ≤1 ora n = 4/4 chip | |||
| pesticidi | aldicarb | 0,17 | no | |||
| Arsen ic (arsenite di sodio) | 4.5 | sì | ||||
| Azide (sodio azide) | 46.7 | sì | ||||
| fenamifos | 0.56 | no | ||||
| metamidofos | 1.4 | no | ||||
| metil parathion | 33.6 | sì | ||||
| Il paraquat (dicloruro) | 4.6 | no | ||||
| Pentaclorofenato (sodio) | 71,9 | sì | ||||
| Prodotti chimici industriali | Ammoniaca | 924 | sì | |||
| Rame (rame II solfato) | 103 | sì | ||||
| Cyanide (sodio) | sì | |||||
| Mercurio (cloruro) | 24.7 | sì | ||||
| toluene | 444 | sì | ||||
| Clean Water 2 | nessuna | N / A | no | |||
| 1 concentrazioni testate sono gli stessi come nel manoscritto di Widder, et al. (2014). | ||||||
| 2 40 campioni di acqua pulita sono stati eseguiti senza contaminazione. | ||||||
Tabella 1: contaminanti nei campioni di acqua rilevati da ECIS.
Discussione
La tecnologia ECIS eseguito bene in un ambiente di laboratorio ed è stato in grado di rilevare potenziali contaminanti in concentrazioni che sono rilevanti per la salute umana. La portabilità e il confezionamento della tecnologia rende favorevole per l'uso sul campo.
passaggi critici nel protocollo per il successo della tecnologia sono i seguenti: 1) mantenere condizioni asettiche durante la coltura, la semina, e l'alimentazione dei biochip, 2) Tenere i biochip seminati in condizioni refrigerate fino pronto per il test in quanto le cellule RTgill-W1 non sopravviverà molto lungo una volta che sono sottoposti a temperature superiori ai 25 ° C, 3) pesare la L-15ex nelle fiale multimediali polvere e misurare accuratamente i campioni di acqua per evitare di produrre falsi positivi, che possono essere causati da un cambiamento nella osmolalità dei media piuttosto che la tossicità del campione, 4) Seguire le istruzioni utente sullo schermo ECIS per eseguire i test. Il software nel lettore avvisa l'utente se un biochip è inaccettabile per il test (basato su letture dell'impedenza iniziali) quando il biochip viene dapprima inserita nel lettore. Se i livelli di impedenza sono inaccettabili per il test, il software non consente all'utente di procedere con il test fino a quando si utilizza un nuovo biochip. Motivi per letture dell'impedenza inaccettabili solito a causa di un leggero disallineamento degli elettrodi biochip con piedini del lettore ECIS o perdite di liquido lungo uno dei bordi di incollaggio del biochip.
Ci sono alcuni limiti di questa tecnologia, perché il sensore ECIS è stato testato solo con acqua potabile e non con le acque di superficie. Le cellule RTgill-W1 che si trovano sul biochip non possono tollerare il congelamento o temperature molto al di sopra di 25 ° C per lunghi periodi di tempo (periodo di tempo può essere da ore a giorni dipende dalla temperatura. I biochip funzionano meglio in un range di temperatura da frigorifero a temperatura 7. sono pronti per l'uso immediato, tuttavia, subito dopo essere rdell'uso e rimossi dalle celle frigorifere. contenitori freddo portatili sono attualmente utilizzati da personale dell'esercito nel campo delle forniture sensibili alla temperatura. Questi stessi contenitori possono essere utilizzati per il trasporto biochip seminata.
Un altro limite di questa tecnologia è che anche se è un sensore di tossicità a larga banda, non risponde bene, se non del tutto, a composti di inibizione della colinesterasi, come alcuni pesticidi. Per colmare questa lacuna capacità, il sensore ECIS è progettato per essere utilizzato in combinazione con un saggio test rapido pesticidi disponibile in commercio quando il test campioni di acqua al fine di fornire all'utente una gamma più ampia di prove di tossicità. Il kit è un test enzimatico rapida progettato per rilevare organofosfati e carbammati pesticidi entro 30 min.
Il sensore ECIS integra la wqas-PM (Analisi dell'acqua Sistema di Qualità - Medicina Preventiva) sistema di test d'acqua campo, attualmente utilizzato da personale militare medicina preventiva per rilevare, Arsenic, piombo, o cianuro in un campione di acqua potabile. Anche se il sensore ECIS non identificare ciò che il contaminante è, indicherà se sono presenti alcuni metalli o composti organici, che indica che l'acqua non può essere adatto per il consumo umano. I risultati del test ECIS sono disponibili all'interno di un ora. I campioni di acqua possono essere inviati per ulteriori analisi per l'identificazione del contaminante se vi è un risultato positivo.
Come descritto sopra, il lettore ECIS è progettato per essere parte di un sistema che include un kit ACE enzimatica separata per coprire un ampio spettro di rilevamento contaminanti. Entrambi questi lettori vengono confezionati in una robusta valigetta per il trasporto di campo per l'uso sul campo da parte dei soldati.
Dichiarazioni
Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito degli Stati Uniti. Le citazioni di organizzazioni commerciali o nomi commerciali in questo rapporto non costituiscono un'approvazione ufficiale del Dipartimento dell'Esercito dei prodotti o dei servizi di queste organizzazioni. Gli autori Linda M. Brennan e Mark W. Widder, entrambi del Centro per la Ricerca sulla Salute Ambientale dell'Esercito degli Stati Uniti, dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Michael Mayo, Michael McAleer e Alex Greis sono dipendenti di Nanohmics che produce i biochip e gli strumenti usa e getta utilizzati in questo articolo.10251980
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Comando di Ricerca Medica e Materiale dell'Esercito degli Stati Uniti e dal programma di Ricerca per l'Innovazione delle Piccole Imprese e dal Programma di Trasferimento Tecnologico per le Piccole Imprese; Contratto n. W81XWH-13-C-0093. Ringraziamo la Dott.ssa Lucy Lee dell'Università di Fraser per essere stata la nostra mentore per la coltura cellulare RTgill-W1 e ringraziamo il Dott. Niels Bols dell'Università di Waterloo per lo sviluppo della linea cellulare RTgill-W1.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siero fetale bovino | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Conservare @ -20 °C. Scongelare @ temperatura ambiente prima dell'uso. Ingrediente per terreni di coltura cellulare L-15 completi (10%). |
| Fibronectina, plasma bovino | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Conservare @ -20 °C. Scongelare @ temperatura ambiente prima dell'uso. Miscelare con terreno L-15 per una concentrazione di 10 μ g/ml e congelare @ -20 ° C in aliquote. Utilizzo come substrato per biochip. |
| Terreni L-15 senza L-glutammina | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Terreni basali per colture cellulari e biochip per l'alimentazione. Conservare a 6 °C. |
| Terreno in polvere L-15ex con rosso fenolo | US Biological www.usbio.net | L1501 | viene pesato in aliquote da 60 mg in fiale da 0,1 dram e conservato a 6 gradi; C in buste di alluminio con confezioni essiccanti. Durata di conservazione di nove mesi. Miscelato con 10 ml di campione d'acqua per l'analisi in biochip. |
| PBS, senza Ca2+ o Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Conservare a temperatura ambiente. Utilizzato per il risciacquo dei terreni durante la tripsinizzazione dei matracci per colture cellulari. |
| Tripsina, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Scongelare a temperatura ambiente e utilizzare per tripsinizzare i palloni di coltura cellulare. |
| Palloni di coltura T175 | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-30 | Utilizzato per la coltura di cellule RTgill-W1. |
| Candeggina | Chlorox | Diluito al 20% con millique o acqua distillata per la pulizia dei chip ECIS. Qualsiasi candeggina domestica è accettabile. | |
| etilico al 70% | Per la disinfezione delle superfici della biocappa e di tutti i materiali inseriti nella biocappa. | ||
| Celle branchiali della trota iridea (RTgill-W1) | Collezione di colture tissutali di tipo americano www.atcc.org | CRL-2523 | Cellule coltivate e utilizzate per biosensori (biochip di semina). |
| GlutaMAX-1 Supplemento, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Conservare a temperatura ambiente. Ingrediente per terreni di coltura cellulare L-15 completi (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Scongelare @ temperatura ambiente prima dell'uso. Ingrediente per terreni di coltura cellulare L-15 completi (1%). |
| Tubi BPT armati | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Taglio in sezioni da 27 mm e sterilizzazione in autoclave. Utilizzato per la semina di biochip con cellule e come circuito chiuso tra i cambi di fluido. |
| Raccordi luer in policarbonato per assemblaggi di tubi Pharmed | Value Plastics | MTLS210-9 | Fissato a ciascuna estremità del tubo Pharmed tagliato per l'inserimento nei bichip. |
| Siringhe da 20 ml, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Utilizzato per l'iniezione di sospensioni cellulari per la semina di chip ECIS, nonché per l'alimentazione di chip. |
| 0.1 dram microfiale in polipropilene con tappo a scatto | Bottiglie Barattoli e Tubi, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Utilizzato per conservare aliquote da 60 mg di terreno in polvere L-15ex. |
| 60 mil Lexan fluidico ECIS biochip | Nanohmics, Inc. | Realizzato su misura da Nanohmics, Inc., le cellule RTgill-W1 saranno iniettate nei biochip e i chip seminati saranno inseriti nel lettore ECIS per i test. | |
| Scatola per strumenti in plastica autoclavabile 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" | Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Utilizzato per conservare quanto segue: tappi autoclavati, biochip che sono stati puliti, biochip seminati. |
| Buste di sterilizzazione termosaldate in carta, 7 ½ ” x 13 pollici | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Utilizzato per la sterilizzazione in autoclave di tubi, raccordi e tappi. |
| Distributore automatico di polvere Quantos | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Riduzione automatica di 60 mg di aliquote di L-15ex in polvere in fiale da 0,1 dram. |
| Lettore ECIS | Nanohmics, Inc. | Realizzato su misura da Nanohmics, Inc. Il biochip seminato viene inserito nel lettore per condurre test di tossicità dell'acqua. | |
| 3 x 5 sacchetti richiudibili in polipropilene metallizzato da 2,5 mil | Uline www.uline.com | S-16893 | Imballaggio e stoccaggio sia per biochip seminati che per fiale di terreni L-15ex in polvere. |
| Leatherman schizzo ps4 | Amazon | Utilizzato per aprire fiale di terreno in polvere. | |
| 1 g di bustine di gel di silice essiccante | Uline www.uline.com | S-3902 | Mettere in sacchetti di polipropilene con fiale di terreno in polvere L-15ex per evitare che la polvere raccolga umidità. |
| Flaconi sterili Nalgene da 250 o 500 ml | Fisher Scientific | > www.fishersci.com 09-740-25C o E | Hold sospensioni cellulari per la semina di chip ECIS in biohood. |
| Tappi per biochip | Nanohmics, Inc. | Realizzato su misura da Nanohmics, Inc. Utilizzato per sigillare le porte sui biochip prima dello stoccaggio a 6 °C. | |
| Scarichi per biochip ECIS | Nanohmics, Inc. | Realizzato su misura da Nanohmics, Inc. Posizionato su 2 porte interne su biochip prima dell'inserimento nel lettore ECIS. Consente il drenaggio del fluido in eccesso dai canali durante le iniezioni di prova. | |
| Emocitometro | Fisher Scientific www.fishersci.com | S17040 | Necessario per contare le cellule prima di regolare la sospensione cellulare per l'iniezione nei biochip. |
| Microscopio a campo chiaro con obiettivo 10X | Leitz Labovert | Qualsiasi microscopio a campo chiaro è accettabile. | |
| sicurezza biologica di classe II | Qualsiasi cappa di sicurezza biologica di classe II in cui la coltura cellulare può essere eseguita in condizioni sterili è accettabile. | ||
| Provette per microcentrifuga, 0,6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 02-681-311 | Contiene 1 ml di sospensione cellulare prima del conteggio delle cellule. |
| Slip 10 cc siringhe rosse | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Preleva 9 ml di campione di acqua di prova e lo utilizza per iniettare il campione nel biochip. |
| Slip 10 cc siringhe blu | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Preleva 9 ml di campione di acqua di controllo e lo utilizza per iniettare il campione nel biochip. |
| ½ oz. barattolo di plastica per animali domestici trasparente con tappi foderati a coste bianche SKS | Bottiglia & Imballaggio, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Fiale per campioni utilizzate per miscelare la polvere di L-15ex e 10 ml di campione d'acqua per il test. |
| Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Utilizzato per contenere aliquote da 40 ml di 10 μ g/ml di fibronectina a -20 °C. |
| Test di rilevamento dell'inibitore dell'acetilcolinesterasi NIDS ACE | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com | Sensore ACE-400 | progettato per il rilevamento rapido di pesticidi nell'acqua potabile |
Riferimenti
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- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
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