I protocolli presentati descrivono due tecniche basate su enzimoimmunosaggio (ELISA) per l'indagine rapida delle interazioni ligando-recettore: Il primo dosaggio permette la determinazione della costante di dissociazione tra ligando e recettore. Il secondo dosaggio consente una rapida analisi di screening dei peptidi di bloccaggio per le interazioni ligando-recettore.
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Articolo metodologico
Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata dell'interazione ligando-recettore. Questo articolo descrive due protocolli rapidi e affidabili punto per punto di enzimoimmunoassay (ELISA) per l'indagine delle interazioni ligando-recettore: il saggio diretto di interazione ligando-recettore (LRA) e il LRA di competizione. Come caso di studio, viene presentata l'analisi basata su ELISA dell'interazione tra diversi interferoni lambda (IFNL) e la subunità alfa del loro recettore (IL28RA): il LRA diretto viene utilizzato per la determinazione delle costanti di dissociation (valori KD) tra il recettore e i ligandi IFN, e il LRA di competizione per la determinazione della capacità inibitoria di un oligopeptide, progettato per competere con gli IFNL sul loro sito di legame recettore. Vengono descritte le fasi analitiche per stimare i valori KD e la concentrazione inibitoria mediana (IC50). Infine, la discussione evidenzia i vantaggi e gli svantaggi del metodo presentato e come i risultati permettano una migliore comprensione molecolare delle interazioni ligando-recettore.
Introduzione
Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata circa l'interazione ligando-recettore. La maggior parte dei metodi per valutare l'interazione di un particolare ligando con il recettore specifico sono costosi, in termini di tempo, manodopera e richiedono attrezzature e competenze specifiche 1.
Questo articolo descrive due protocolli veloce e affidabile punto per punto per studiare l'interazione ligando-recettore sulla base di un enzima collegato immunosorbent assay (ELISA): il saggio di interazione ligando-recettore diretta (LRA) e l'LRA concorrenza. ELISA è una tecnica mol....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Per preparare un tampone di rivestimento carbonato, sciogliere 0,36 g di Na 2 CO 3 e 0,84 g NaHCO 3 in 100 ml di acqua distillata; filtro sterile il buffer utilizzando un vuoto spinto 0,22 micron polietersulfone (PES) filtro a membrana e conservare a temperatura ambiente fino a quando l'utilizzo.
- Preparare la soluzione di lavaggio con l'aggiunta di 0,05% v / v Tween 20 in tampone fosfato (PBS).
- Preparare un 5% di sieroalbumina bovina (BSA) (soluzione bloccante) in soluzione PBS sciogliendo 5 g BSA (≥98%) in 100 ml di PBS e conservare a 4 ° C.
- Ricombinante de....
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Risultati
Le costanti di dissociazione tra INFL1-3 e loro recettore subunità alfa IL28RA sono stati determinati utilizzando il LRA diretta. I risultati sono mostrati in Figura 3: La frazione dei siti di legame occupati è tracciata contro il logaritmo della rispettiva concentrazione di IFN. La trama Scatchard dei dati è mostrata nell'angolo in basso a destra. I risultati illustrano che l'Lra diretta produce una curva di legame, che può essere ulteriormente analizzati per st.......
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Discussione
ELISA è uno standard e il metodo consolidato per molti laboratori. Abbiamo ulteriormente modificato e migliorato un metodo 5,7 precedentemente pubblicato. Il protocollo passo-passo dimostrato mostra come può essere utilizzato in modo semplice per determinare i valori K D di interazioni ligando-recettore. Inoltre, la IC50 di un peptide bloccante che interferisce con l'interazione ligando-recettore può essere determinato.
I principali vantaggi sono la rapida messa a p.......
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Dichiarazioni
A.E. è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca del programma "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" dell'Università di Basilea, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel e Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. riconosce il sostegno di una borsa di studio iPhD dell'iniziativa SystemsX.ch nel programma di biologia dei sistemi (9a chiamata).
Ringraziamenti
Ringraziamo il Prof. J. Stelling (Dipartimento di Scienze e Ingegneria dei Biosistemi, ETH Zurich e Istituto Svizzero di Bioinformatica, Basilea, Svizzera) per la sua revisione critica del manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | Piastra ELISA |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | Per buffer di rivestimento della piastra ELISA |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | Per buffer di rivestimento della piastra ELISA |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS per il bloccaggio |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinative interleuchina umana-28 Ricevitore alfa |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinative interleuchina umana-29/Senza vettore/Tag 6-His in coda terminale |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinative interleuchina umana-28A/Senza vettore/Tag 6-His in coda terminale |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinative interleuchina umana-28B/Senza vettore/Tag 6-His in coda terminale |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Anticorpo primario per catturare i ligandi con tag His |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Anticorpo secondario coniugato con Perossidasi di rafano |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | Soluzione di substrato TMB per ELISA |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | H2SO4 5 N (Soluzione per arrestare la reazione enzimatica) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | Lettore di piastre ELISA |
Riferimenti
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al.
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Ristampe e permessi
