Qui riportiamo protocolli per rilevare proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene nelle cellule umane e quantificare questi livelli di proteine a centromeri-cinetocori mediante colorazione immunofluorescente indiretta attraverso l'uso di fissazione (paraformaldeide, acetone o metanolo).
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Articolo metodologico
Le proteine immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro
In questo articolo
Sommario
Abstract
"Centromeri" e "cinetocore" si riferiscono al sito in cui i cromosomi si associano al fuso durante la divisione cellulare. La visualizzazione diretta delle proteine centromero-cinetocore durante il ciclo cellulare rimane uno strumento fondamentale per studiare i meccanismi di queste proteine. I metodi di imaging avanzati nella microscopia a fluorescenza forniscono una notevole risoluzione dei componenti centromero-cinetocoro e consentono l'osservazione diretta di specifici componenti molecolari dei centromeri e dei cinetocore. Inoltre, i metodi di colorazione con immunofluorescenza indiretta (IIF) utilizzando anticorpi specifici sono cruciali per queste osservazioni. Tuttavia, nonostante i numerosi rapporti sui protocolli IIF, pochi hanno discusso in dettaglio i problemi di specifiche proteine centromero-cinetocore. 1-4 Qui riportiamo protocolli ottimizzati per colorare le proteine centromero-cinetocore endogene nelle cellule umane utilizzando la fissazione con paraformaldeide e la colorazione IIF. Inoltre, riportiamo protocolli per rilevare le proteine esogene CENP-A Flag-taged in cellule umane sottoposte a fissazione con acetone o metanolo. Questi metodi sono utili per rilevare e quantificare le proteine centromero-cinetocore endogene e le proteine CENP-A contrassegnate con flag, comprese quelle nelle cellule umane.
Introduzione
"I centromeri" sono stati classicamente definiti come regioni della ricombinazione meiotica soppressa nel campo della genetica e in seguito riconosciuto come la costrizione primaria dei cromosomi mitotici, che svolge un ruolo essenziale nel accurata segregazione dei cromosomi durante la mitosi. "cinetocori" sono stati descritti come strutture multistrato che si legano ai microtubuli alla superficie di centromeri, come rivelato dalla microscopia elettronica; "cinetocori" sono stati successivamente definiti come il complesso macromolecolare che localizza al centromero dei cromosomi mitotici. Nonostante una divergenza drammatica di sequenze di DNA centromeriche tra i ve....
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Protocollo
1. Colture cellulari e trasfezione
- Mettere un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) in una lastra di polistirene 6-bene. cappotto Facoltativamente un vetro di copertura con Poli-L-lisina, 0,1% w / v, in acqua (vedi elenco dei materiali / attrezzature) per mantenere le cellule in mitosi sul vetro di copertura seguendo le istruzioni riportate di seguito:
Nota: Le condizioni ottimali devono essere determinati per ciascuna linea cellulare ed applicazione.- Asetticamente superficie cultura cappotto con poli-L-lisina, 0,1% w / v, in acqua (0,4 ml / pozzetto di una piastra da 6 pozzetti polistirene). Agitare delicatamente per garantire anche il rivest....
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Risultati
Immunofluorescenza di endogena CENP-A supporta l'ipotesi che CUL4A-E3 ligasi è richiesto per la localizzazione di CENP-A per centromeri
I nostri studi recenti hanno dimostrato che CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligasi attività è necessario per ubiquitylation di lisina 124 (K124) sulla CENP-A e la localizzazione di CENP-A per centromeri. 17 Inizialmente, il complesso interfase-centromero (ICEN) è stato isolato da anti-CENP-a: nativo immunoprecipitazione della c.......
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Discussione
Negli ultimi anni molti studi hanno sviluppato diversi saggi di microscopia quantitativa per le cellule fisse. 42 I progressi nel campo della biologia centromero-cinetocore spesso richiede una comprensione della funzione centromero-specifica o specifiche cinetocoro delle proteine di cui subcellulare regolazione spazio-temporale riflette le funzioni mutevoli queste proteine durante il ciclo cellulare. Quindi, qui abbiamo sviluppato metodi di IIF colorazione e un test quantitativo IIF per analizzare specifi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM68418.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | reagente di trasfezione I |
| Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | reagente di trasfezione II |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Terreno di sierino ridotto, caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| DMEM ad alto contenuto di glucosio (Dulbecco' s Eagle modificato' Life | Technologies/BioWhittaker | 12-604 | DMEM ad alto contenuto di glucosio, caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso |
| Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, origine statunitense | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (siero fetale bovino) |
| Poli-L-lisina SOLUZIONE | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poli-L-lisina, 0,1% p/v, in acqua |
| Acqua distillata ultrapura | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Acqua sterile per colture tissutali |
| Vetro Micro Cover (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Vetro di copertura (22 mm x 22 mm) |
| Cluster di colture cellulari a 6 pozzetti | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | Piastra in polistirene a 6 pozzetti |
| Penicillina, Streptomicina; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillina-streptomicina |
| PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Penna barriera idrofobica (per una barriera idrorepellente nella colorazione immunofluorescente) |
| Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol per analisi di cellule mitotiche |
| TN-16, inibitore dei microtubuli (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 per analisi di cellule mitotiche |
| BSA (albumina sierica bovina) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Reagente bloccante |
| Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergente per permeabilizzazione |
| Paraformaldeide | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Reagante di fissazione |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | Per colorazione nucleare |
| p-fenilendiammina | SIGMA-SLDRICH | P6001 | Per il montaggio di terreni VWR |
| Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro scivoli |
| Anticorpo anti-CENP-A | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anticorpo anti-CENP-B | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF, fissazione metanolo/acetone)-1:400 (IIF, fissazione paraformaldeide) |
| Anticorpo anti-CENP-B | abcam | ab25734 | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF, fissazione metanolo/acetone)-1:400 (IIF, fissazione con paraformaldeide) |
| Anticorpo anti-centromero (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Antisiero centromero umano; rapporto di diluizione di 1:2000 (IIF) |
| Anticorpo anti-CENP-H | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF) |
| Anticorpo anti-CENP-H | BD | 612142 | Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF) |
| Anticorpo anti-CENP-I | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
| Anticorpo anti-KNL1 | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF) |
| Anticorpo anti-Hec1 | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF) |
| Anticorpo anti-Hec1 Anticorpo | GeneTex | GTX110735 | di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF) |
| Anticorpo anti-Ska1 | abcam | ab46826 | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF) |
| Anticorpo anti-Flag | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anticorpo anti-Flag | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-CUL4A anticorpo | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
| Anticorpo anti-RBX1 | Segnalazione cellulare | 4397 | Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:2000 (WB) |
| Anticorpo anti-GAPDH | Chemicon | MAB374 | Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:5000 (WB) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | IgG Life Technologies/Invitrogen | A11008 | anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato per affinità) |
| Latte in polvere scremato (sostituto approvato del latte in polvere di garofano) | Fisher Scientific | NC9255871 (riordino n. 190915; Lot# 90629) | Microscopio |
| a fluorescenza motorizzato Leica DM IRE2 per latte scremato | Microscopio a fluorescenza motorizzato | Leica | |
| Lente ad immersione in olio HCX PL APO 63x | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OLIO PH 3 CS | 63X Lente ad immersione in olio |
| HCX PL APO 100x Lente ad immersione in olio | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OLIO PHE | 100X Lente ad immersione |
| in olio Leica EL6000 Sorgente luminosa compatta | Leica | Sorgente luminosa compatta esterna per eccitazione fluorescente | |
| Fotocamera CCD digitale ORCA-R2 | Hamamatsu | C10600-10B | |
| Openlab versione 5.5.2 Software per l'imaging scientifico | Perkin Elmer/Improvision | Per l'osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi | |
| delle immagini Velocity versione 6.1.1 Software di analisi delle immagini 3D | Perkin Elmer/Improvision | Per l'osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi delle immagini | |
| Cocktail completo di inibitori della proteasi privi di EDTA | Roche | 11873580001/11836170001 | Compresse da cocktail di inibitori della proteasi |
| PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine I per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con SDS |
| al 2%)Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine II per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con SDS allo 0,1%) |
| Immobilon-FL | EMD Millipore IPFL00010 | membrana PVDF per il trasferimento | |
| di IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF) |
| IRDye 680 IgG anti-coniglio di capra | LI-COR Biosciences | 926-32221 | Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF) |
| IgG di capra anti-topo DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF) |
| DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF) |
| anti-topo di capra | Santa Cruz | SC-2005 | anticorpo secondario coniugato con HRPPanticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (Secondario purificato per affinità anticorpale); rapporto di diluizione di 1:10000 (IIF) |
| anti-coniglio di capra | Santa Cruz | SC-2004Anticorpo | secondario coniugato con HRPanticorpo secondario coniugato con luce DyLightAnticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:10000 (IIF) |
| Openlab versione 5.5.2. Software di imaging scientifico | Software Improvision/PerkinElmer | A | |
| Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
| Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicatore | ||
| Branson Ultrasonics Microtip Step, Solido, Filettato 9,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Tromba disgregatrice per sonicazione |
| Sonicatore a ultrasuoni Branson Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip per la sonicazione |
| Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx | LI-COR Biosciences Sistema di | imaging a infrarossi per la rilevazione di | |
| Software di analisi Image Studio Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software | |
| C Imager molecolare Versadoc MP4000 Sistema | Bio-Rad | Imager a chemiluminescenza per la rilevazione di immunoblot | |
| Quantità Un software di analisi 1-D | Bio-Rad | Software D | |
| SuperSignal West Femto Substrato di massima sensibilità | Thermo | 34095 | Substrato chemiluminescente avanzato (ECL) ultrasensibile |
Riferimenti
- DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
- Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N.
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Ristampe e permessi
