Method Article

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

DOI:

10.3791/53732

⸱

March 3rd, 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui riportiamo protocolli per rilevare proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene nelle cellule umane e quantificare questi livelli di proteine a centromeri-cinetocori mediante colorazione immunofluorescente indiretta attraverso l'uso di fissazione (paraformaldeide, acetone o metanolo).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centromeri" e "cinetocore" si riferiscono al sito in cui i cromosomi si associano al fuso durante la divisione cellulare. La visualizzazione diretta delle proteine centromero-cinetocore durante il ciclo cellulare rimane uno strumento fondamentale per studiare i meccanismi di queste proteine. I metodi di imaging avanzati nella microscopia a fluorescenza forniscono una notevole risoluzione dei componenti centromero-cinetocoro e consentono l'osservazione diretta di specifici componenti molecolari dei centromeri e dei cinetocore. Inoltre, i metodi di colorazione con immunofluorescenza indiretta (IIF) utilizzando anticorpi specifici sono cruciali per queste osservazioni. Tuttavia, nonostante i numerosi rapporti sui protocolli IIF, pochi hanno discusso in dettaglio i problemi di specifiche proteine centromero-cinetocore. 1-4 Qui riportiamo protocolli ottimizzati per colorare le proteine centromero-cinetocore endogene nelle cellule umane utilizzando la fissazione con paraformaldeide e la colorazione IIF. Inoltre, riportiamo protocolli per rilevare le proteine esogene CENP-A Flag-taged in cellule umane sottoposte a fissazione con acetone o metanolo. Questi metodi sono utili per rilevare e quantificare le proteine centromero-cinetocore endogene e le proteine CENP-A contrassegnate con flag, comprese quelle nelle cellule umane.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"I centromeri" sono stati classicamente definiti come regioni della ricombinazione meiotica soppressa nel campo della genetica e in seguito riconosciuto come la costrizione primaria dei cromosomi mitotici, che svolge un ruolo essenziale nel accurata segregazione dei cromosomi durante la mitosi. "cinetocori" sono stati descritti come strutture multistrato che si legano ai microtubuli alla superficie di centromeri, come rivelato dalla microscopia elettronica; "cinetocori" sono stati successivamente definiti come il complesso macromolecolare che localizza al centromero dei cromosomi mitotici. Nonostante una divergenza drammatica di sequenze di DNA centromeriche tra i vertebrati, la struttura e la composizione cinetocoro sono altamente conservati. Una interazione dinamica tra microtubuli del fuso e il cinetocore è necessario per la separazione fedele dei cromosomi durante la mitosi, e difetti di centromero-cinetocore piombo funzione per aneuploidie e quindi il cancro.

Il centromero nella maggior parte dei eucariotisenza sequenza di DNA definito, ma si compone di grandi array (0,3-5 MB) di DNA ripetitivo alphoid costituito da DNA α-satellite 171-bp. Salvo il lievito, identità centromero non è raggiunto dalla sequenza di DNA, ma per la presenza di un nucleosoma speciale che contiene la variante istone H3 CenH3 (centromero Proteina A [CENP-A] nell'uomo). 5 CENP-A nucleosomi localizzare la piastra interna di cinetocori mammiferi 7 e si legano al DNA α-satellite 171 bp. centromeri attivi richiedono CENP-A-contenente nucleosomi per dirigere l'assunzione di una rete costitutiva centromero-associato (Ccan) e le proteine ​​del cinetocore, che insieme regolano l'attaccamento di cromosomi al fuso mitotico e la progressione del ciclo successivo attraverso il posto di blocco mandrino.

Alla luce degli elementi di cui sopra, CENP-A è stato proposto per essere il marchio epigenetica del centromero 8; Tuttavia, il processo con cui CENP-A è incorporato into DNA centromerico e dei fattori responsabili di questa incorporazione non sono ancora stati ben caratterizzati. Una breve dominio centromero-targeting (CATD) risiede nel istone piegare regione CENP-A, e la sostituzione della corrispondente regione H3 con il CATD è sufficiente H3 al centromero. 9 Diversi studi suggeriscono ruoli funzionali per post-traduzionale modifica (PTM) di CENP-A 12-16; Tuttavia, i meccanismi molecolari di queste PTM di CENP-A nel reclutamento di centromeri non sono ancora stati chiariti. Abbiamo precedentemente riportato che CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligasi attività è necessario per CENP-A K124 ubiquitinazione e la localizzazione di CENP-A per centromeri. 17

La scoperta e la caratterizzazione di proteine ​​cinetocoro hanno portato a una nuova visione per quanto riguarda la segregazione dei cromosomi. 18 Più di 100 componenti cinetocoro sono stati identificati in cellule dei vertebrati dai vari approcci. 19,20 un sottoIn piedi di come cinetocori assemblare e la funzione viene anche dalla caratterizzazione delle funzioni cellulari di ciascuna rete centromero-cinetocore proteine ​​e proteine-proteine ​​all'interno delle cellule. 19 visualizzazione diretta e di imaging avanzate metodologie di microscopia a fluorescenza forniscono notevole risoluzione di componenti centromero-cinetocore e permettono osservazione diretta di componenti molecolari specifici dei centromeri e cinetocori. Inoltre, i metodi di immunofluorescenza indiretta (IIF) colorazione utilizzando anticorpi specifici sono fondamentali per queste osservazioni. Tuttavia, nonostante le numerose segnalazioni circa i protocolli di IIF, pochi problemi discussi in dettaglio di specifiche proteine ​​centromero-cinetocore. 1-4 Così, lo sviluppo e la segnalazione metodi di IIF colorazione e un test quantitativo IIF per analizzare specificamente ogni proteina centromero-cinetocore è estremamente importante. In IIF colorazione, si deve procedere con il protocollo di colorazione per evitare la perdita della proteina di interesse oil resto della cellula. Tuttavia, la fissazione distrugge siti antigenici occasionalmente e diverse combinazioni anticorpo-antigene funziona male con un fissativo, ma molto bene con un altro, 21 e la scelta di fissativo dipende in gran parte della proteina (s) di interesse. Pertanto, diversi metodi di fissativi sono cruciali per IIF colorazione delle proteine ​​centromero-cinetocore.

sono stati sviluppati metodi qui ottimizzate di immunofluorescenza indiretta (IIF) colorazione e un test per affrontare la localizzazione delle proteine ​​centromero-cinetocore endogeni, tra cui CENP-A e esogeni proteine ​​CENP-A-Flag con tag, e la quantificazione di queste proteine ​​nelle cellule umane. Questi metodi possono essere applicati all'analisi delle proteine ​​centromero-cinetocore in altre specie.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Colture cellulari e trasfezione

  1. Mettere un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) in una lastra di polistirene 6-bene. cappotto Facoltativamente un vetro di copertura con Poli-L-lisina, 0,1% w / v, in acqua (vedi elenco dei materiali / attrezzature) per mantenere le cellule in mitosi sul vetro di copertura seguendo le istruzioni riportate di seguito:
    Nota: Le condizioni ottimali devono essere determinati per ciascuna linea cellulare ed applicazione.
    1. Asetticamente superficie cultura cappotto con poli-L-lisina, 0,1% w / v, in acqua (0,4 ml / pozzetto di una piastra da 6 pozzetti polistirene). Agitare delicatamente per garantire anche il rivestimento della superficie di cultura.
    2. Dopo 5 minuti, rimuovere la soluzione tramite aspirazione e lavare accuratamente la superficie con del tessuto acqua sterile cultura di grado.
    3. Secco, almeno 2 ore prima di introdurre cellule e mezzo.
  2. Cellule HeLa Seed 17 o cellule 17,22 su un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) mettere in una lastra di polistirene 6-ben HeLa Tet-Off. Controllare che la densità cellulare è 5,4 x 10 5 per pozzetto. cellule di colturain DMEM ad alto glucosio con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, empiricamente determinare la densità delle cellule da utilizzare in semina.
  3. Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 per 18 ore.
    Nota: Nel caso di cellule HeLa Tet-Off, la trascrizione del gene esogeno è attiva in assenza di induttore (cioè, tetraciclina / doxiciclina) quindi cellule di coltura senza tetraciclina / doxiciclina e trasfezione transiente con la sovraespressione vettoriale pTRM4 (Tabella 2 ), la cui trascrizione è regolata dal promotore TRE (vedi sotto).
  4. Diciotto ore dopo la semina delle cellule, trasfezione come segue:
    1. Fai la soluzione A mescolando 1,5 microlitri siRNA oligo (20 micron azionari ricotto; Tabella 1) e / o 2.0 mcg plasmide (Tabella 2) in 50 microlitri ridotto medio sierico (vedere elenco dei materiali / attrezzature), e incubare a temperatura ambiente per 5 min .
      Nota: In questa analisi,CA-UTR siRNA (una miscela di 5 'e 3' UTR siRNA; Tabella 1) sono state co-trasfettate per l'utilizzo in protocolli 3 e 4 (vedi la discussione).
    2. Fai la soluzione B mescolando 0,75 ml trasfezione reagente I (vedere l'elenco dei materiali / Equipment) in 50 microlitri riduzione media di siero, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      Nota: un passaggio facoltativo è l'aggiunta di 1,0 ml di reagente di trasfezione II (vedi elenco dei materiali / attrezzature).
    3. Mescolare le soluzioni A e B insieme, e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    4. Lavare le cellule coltivate una volta con PBS, e quindi aggiungere 500 microlitri ridotte medio siero in ciascun pozzetto della piastra di polistirene 6 pozzetti. Aggiungere la miscela delle soluzioni A e B (cioè, RNA e / o complesso DNA-lipide) direttamente a ciascuno dei singoli bene.
      Nota: la concentrazione finale è di 3,3 mg / ml (plasmidi); 50 Nm (siRNA).
    5. Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 per 4,5 ore. Cambiare il medio-alta-glucosio DMEM ingegnoh 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina.
    6. Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 per 48-72 ore dopo la trasfezione.
      Nota: Per ottenere risultati ottimali, il periodo di incubazione per la crescita cellulare prima della fissazione deve essere determinato empiricamente, e l'esaurimento di proteine ​​e / o di espressione deve essere confermata da analisi Western Blot (vedi Protocollo 6).
    7. Se l'analisi delle cellule mitotico è di interesse, aggiungere paclitaxel (10 nM) a cellule in coltura 24 ore prima della fissazione, o aggiungere TN16 (0,5 micron) al cellule in coltura 2,5 ore prima della fissazione.

2. cellulare Fissazione e colorazione di immunofluorescenza per rilevare proteine ​​endogene centromero-cinetocore (Paraformaldeide fissazione)

  1. Preparazione di fissativo, tamponi e reagenti.
    1. Appena preparare 50 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS, pH 7,4.
      1. Aggiungere 40 ml di 1 × PBS in un becher di vetro su un piatto mescolare in una cappa ventilata. Calore mentre Stirring a circa 60 ° C. Aggiungere 2 g di polvere di paraformaldeide al PBS riscaldata.
      2. Sollevare lentamente il pH aggiungendo 1 ml di 1 N NaOH in totale, perché la polvere non sciogliere immediatamente.
        Nota: La soluzione cancella dopo l'aggiunta di NaOH.
      3. Una volta paraformaldeide si è dissolta, fresco e filtrare la soluzione.
      4. Regolare il pH con 1 N HCl a pH 7.4 e il volume della soluzione con 1 × PBS a 50 ml.
        Nota: Aliquote della soluzione possono essere congelati o conservati a 2-8 ° C per il tempo 1 settimana. La soluzione deve essere ghiacciata o conservato a 4 ° C fino a quando non deve essere utilizzato.
    2. Preparare 50 ml di tampone KB1, che consiste di 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 0,5% BSA; e 0,5% Triton X-100.
      Nota: BSA dovrebbe essere rinnovato aggiunto.
      Nota: Il buffer KB serie sono basate sul buffer KB descritto nelle precedenti relazioni 1,2,4.
    3. Preparare 50 ml di tampone KB2, che consiste di 10 mM Tris-HCl,pH 7.5; 150 mM NaCl; e 0,5% BSA.
      Nota: BSA dovrebbe essere rinnovato aggiunto.
    4. Preparare 1 ml di tampone contenente KB3 DAPI (50 ng / ml).
    5. Preparare 100 ml di mezzo di montaggio, che consiste di 1 mg / ml p-fenilendiammina; 10% PBS, e il 90% glicerolo.
      1. Regolare il pH di 1 × PBS a 9,8 con NaOH 1 N, sciogliere p-fenilendiammina nella soluzione e quindi aggiungere glicerolo.
      2. Conservare 1 ml aliquote a -80 ° C. Proteggere dalla luce.
  2. Rimuovere il terreno di coltura per aspirazione a 48-72 ore dopo la trasfezione (vedi protocollo 1) per la fissazione delle cellule. Sciacquare le cellule una volta con PBS. Applicare PBS al lato dei pozzetti di coltura per non disturbare la superficie delle cellule.
    Nota: Il punto di tempo ottimale per la fissazione delle cellule deve essere determinata empiricamente.
  3. Fissare le cellule in 4% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a 4 ° C. Lavare le cellule due volte con tampone KB2 rimuovere sufficientemente residuo 4% paraformaldeide.
  4. permeabilitàlize i campioni in tampone KB1 per 30 minuti a RT. Lavare le cellule una volta con tampone KB2, e aggiungere tampone KB2 per 5 minuti a RT per bloccare i siti supplementari di legami non specifici.
    Nota: Buffer KB1 contribuisce in modo significativo al blocco.
  5. Rimuovere un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) da una lastra di polistirene 6-bene con pinze. Utilizzando una penna barriera idrofobica (vedi elenco dei materiali / attrezzature), disegnare un quadrato o un cerchio verde pallido per formare una barriera idrofobica attorno ad ogni campione di vetro di copertura. Non toccare o avvicinarsi troppo alle cellule con la penna di barriera idrofoba. Mettere il vetro di copertura in nuova lastra di polistirene 6-bene.
  6. Diluire un anticorpo primario per centromero o proteine ​​kinetochore (rapporto di diluizione di 1: 100 a 1: 200; vedi anche elenco dei materiali / attrezzature) e sia un anticorpo anti-CENP-B (rapporto di diluizione di 1: 400) o un anti anticorpo centromero (ACA) (rapporto di diluizione di 1: 2000) come marcatore di posizione centromero in tampone KB2.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, la concentrazione finalezione dell'anticorpo primario in questa soluzione deve essere determinato empiricamente.
  7. Applicare un volume sufficiente (circa 30 ml) di anticorpo primario diluito immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 1 ora a 37 ° C. Lavare le cellule 3 volte con tampone KB2.
  8. Utilizzando tampone KB2, diluire un anticorpo secondario fluoroforo coniugato (rapporto di diluizione di 1: 100 a 1: 200) diretto contro l'anticorpo primario.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, la concentrazione finale di anticorpo secondario in questa soluzione deve essere determinato empiricamente.
  9. Applicare un volume sufficiente (una goccia di circa 30 microlitri sul vetro di protezione) dell'anticorpo secondario diluito immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 1 ora a 37 ° C. Lavare le cellule per 5 volte con tampone KB2 durante un periodo di 30 min (cinque lavaggi 6 min).
    Nota: Per risultati ottimali (ad esempio, per una minima perdita di cellule), la condizione di lavaggio ottimale deve essere determinata empirically.
  10. Applicare un volume sufficiente di KB3 tampone contenente DAPI (50 ng / ml) per immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 5 minuti a RT. Lavare le cellule 1-2 volte con tampone KB2.
  11. Montare il vetro di copertura che contiene il campione di cellule sul micro diapositiva.
    1. Mettere una goccia di mezzo di montaggio al centro del micro diapositiva.
    2. Rimuovere il liquido dal campione cellulare e, con le mani o pinze, posizionare il campione nel centro del micro diapositiva. Evitare di bolle d'aria.
    3. Rimuovere l'eccesso di mezzo di montaggio con un tovagliolo di carta.

3. Fissazione delle cellule e la colorazione di immunofluorescenza di C-terminale Flag-tag CENP-A Proteine ​​(Acetone fissazione)

  1. Preparazione
    1. Preparare ghiacciata 75% di acetone.
    2. Appena preparare 50 ml di PBS (pH 7,4) contenente 0,5% di latte scremato e 0,5% BSA.
    3. Appena preparare 50 ml di PBS (pH 7,4) contenente 0,1% di latte scremato e 0,1% BSA.
    4. Preparare 1 ml di PBS (pH 7.4) contenente DAPI (50-100 ng / ml).
    5. Preparare 100 ml di mezzo di montaggio come descritto in 2.1.5.
  2. Rimuovere il terreno di coltura per aspirazione a 48-72 ore dopo la trasfezione (vedi protocollo 1) per la fissazione delle cellule. Sciacquare le cellule una volta con PBS. Applicare PBS al lato del bene coltura per non disturbare la superficie delle cellule.
    Nota: Il punto di tempo ottimale per la fissazione delle cellule deve essere determinata empiricamente.
  3. Fissare le cellule in ghiaccio freddo 75% di acetone, e incubare le cellule per 10 minuti a -20 ° C. pile a secco sul vetro di copertura in una cappa aspirante per 30-60 minuti a temperatura ambiente.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, il tempo necessario per la fissazione e la cella di essiccazione deve essere determinato empiricamente.
  4. Utilizzando la penna barriera idrofoba (vedi elenco dei materiali / attrezzature), disegnare un quadrato o un cerchio verde pallido per formare una barriera idrofobica attorno ad ogni campione di vetro di copertura. Non toccare o avvicinarsi troppo alle cellule con la penna di barriera idrofoba.
  5. blocco nonspecific siti di legame sulle cellule aggiungendo PBS contenente 0,5% di latte scremato e 0,5% BSA per 5 minuti a RT.
  6. Utilizzando PBS contenente 0,1% di latte scremato e 0,1% BSA, diluire un anticorpo anti-Flag (1: 1.000 rapporto di diluizione) e sia un anticorpo anti-CENP-B (rapporto di diluizione di 1: 200) o ACA (rapporto 1: 2.000 diluizione ) come un indicatore di posizione centromero.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, la concentrazione finale di anticorpo primario in questa soluzione deve essere determinato empiricamente.
  7. Applicare un volume sufficiente (circa 30 ml) di anticorpo primario diluito immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 1 ora a 37 ° C. Lavare le cellule per 5 volte con il tampone di bloccaggio per un periodo di 30 min.
    Nota: Le celle possono essere risciacquati con PBS. Per ottenere risultati ottimali (cioè, per evitare la perdita di cellule), le condizioni di lavaggio ottimali devono essere determinati empiricamente.
  8. Diluire un anticorpo secondario fluoroforo coniugato (rapporto di diluizione di 1: 100 a 1: 200) diretto controla ogni anticorpo primario in PBS contenente 0,1% di latte scremato e 0,1% BSA.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, la concentrazione finale di anticorpo secondario in questa soluzione deve essere determinato empiricamente.
  9. Applicare un volume sufficiente (circa 30 ml) di anticorpo secondario diluito immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 1 ora a 37 ° C. Lavare le cellule 2 volte con PBS contenente 0,1% di latte scremato e 0,1% BSA.
    Nota: PBS solo può anche essere utilizzato per lavare le cellule.
  10. Applicare un sufficiente volume di PBS contenente DAPI (50-100 ng / ml) per immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 5 minuti a RT. Lavare le cellule 1-2 volte con PBS.
  11. Montare il vetro di copertura contenente il campione cellulare sul micro diapositiva come descritto in 2.11.

4. cellulare Fissazione e colorazione di immunofluorescenza di N-terminale Flag-tag CENP-A Proteine ​​(Metanolo fissazione)

  1. Preparazione
    1. Preparare metanolo ghiacciata.
    2. Preparare TBS (pH 7.4) contenente 4% siero di capra.
    3. Preparare 1 ml di TBS (pH 7,4) contenente DAPI (50-100 ng / ml).
    4. Preparare 100 ml di mezzo di montaggio come descritto in 2.1.5.
  2. Rimuovere il terreno di coltura per aspirazione a 48-72 ore dopo la trasfezione (vedi protocollo 1) per la fissazione delle cellule. Sciacquare le cellule una volta con TBS. Applicare TBS al lato dei pozzetti di coltura per non disturbare la superficie delle cellule.
    Nota: Il punto di tempo ottimale per la fissazione delle cellule deve essere determinata empiricamente.
  3. Fissare le cellule in metanolo ghiacciato, e incubare le cellule per 6 minuti a -20 ° C. Lavare le cellule due volte con TBS per rimuovere sufficientemente metanolo residuo.
  4. Utilizzando una penna barriera idrofobica (vedi elenco dei materiali / attrezzature), disegnare un quadrato o un cerchio verde pallido per creare una barriera idrofobica attorno ad ogni campione di vetro di copertura. Non toccare o avvicinarsi troppo alle cellule con la penna di barriera idrofoba.
  5. Bloccare non specifici siti di legame sul celLS di TBS aggiungendo contenente 4% di siero di capra. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  6. Diluire un anticorpo anti-Flag (1: 1.000 diluizione) e sia un anticorpo anti-CENP-B (rapporto di diluizione di 1: 200) o ACA (1: 2.000 rapporto di diluizione) come marcatore di posizione centromero in TBS contenente 4% di siero di capra .
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, la concentrazione finale di anticorpo primario in questa soluzione deve essere determinato empiricamente.
  7. Applicare un volume sufficiente (circa 30 ml) di anticorpo primario diluito immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 1 ora a 37 ° C. Lavare le cellule per 5 volte con il tampone di bloccaggio per un periodo di 30 min. Per ottenere risultati ottimali (cioè, la perdita minima di cellule), la condizione di lavaggio ottimale deve essere determinata empiricamente.
  8. Diluire un anticorpo secondario fluoroforo coniugato (rapporto di diluizione di 1: 100 a 1: 200) diretto contro l'anticorpo primario in TBS contenente 4% siero di capra.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, la Final concentrazione dell'anticorpo secondario in questa soluzione deve essere determinato empiricamente.
  9. Applicare un volume sufficiente (circa 30 ml) di anticorpo secondario diluito immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 1 ora a 37 ° C. Lavare le cellule 3 volte con il tampone bloccante.
  10. Applicare un volume sufficiente di TBS contenente DAPI (50-100 ng / ml) per immergere il campione cellulare. Incubare il campione di cellule per 5 minuti a RT. Lavare le cellule 1-2 volte con TBS.
  11. Montare il vetro di copertura che contiene il campione cellulare sul micro diapositiva come descritto in 2.11.

5. immunofluorescenza Immagine di osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e analisi

  1. Osservare il campione di cellule attraverso un microscopio a fluorescenza motorizzato dotato di una lente 63X e 100X olio di immersione, una fonte di luce esterna compatta, e una fotocamera CCD digitale.
  2. Eseguire l'acquisizione delle immagini e l'elaborazione, tra cui deconvoluzione, con SoftwareA, o Software B1 e B2 (vedere l'elenco dei materiali / attrezzature). Si prega di consultare supplementare Codice Files (5.2.1) per tutti i comandi utilizzati in Software A. Per tutti i comandi utilizzati in Software B1 e B2, vedi (5.2.2), in Supplemental Codice File.
  3. Utilizzare un metodo precedentemente descritto 23-25 ​​per quantificare i segnali di proteine ​​centromero-cinetocore (ad esempio, rimanendo segnali di CENP-A al centromero) con le seguenti modifiche minori:
    1. Seleziona area delle proteine ​​centromero-cinetocore e dello sfondo come segue:
      1. cell Mitotic: (regione centromero-cinetocore) Seleziona l'area di sovrapposizione con cromosomi colorati con DAPI; (regione di fondo) e area esterna cromosomi ma dentro l'identico singola cellula (regione cioè citosolico).
      2. cellula Interphase: (regione centromero-cinetocore) Seleziona l'area di sovrapposizione con cromatina macchiato con DAPI; (Regione di fondo) e la zona esterna della cromatina ma dentro l'identico singola cella ( cioè, regione citosolico).
        Nota: vedere anche Supplemental file di codice (5.2.1.4.3) o (5.2.2.6.4) per la selezione zona con Software A o Software B2, rispettivamente.
    2. Quantificare la percentuale di segnali rimanenti ai centromeri con Software A o B. Per questa operazione, utilizzare la seguente formula:
      segnali di proteine ​​centromero-cinetocore Rimanendo al centromero-cinetocore
      figure-protocol-1
      dove s è la luminosità del segnale dell'area selezionata, che è confermato da ACA o CENP-B colorazione, b è la luminosità segnale di fondo; r campione è i segnali ACA riferimento o CENP-B per siRNA (s) cellule -treated; e R ctrl è l'ACA di riferimento o segnali CENP-B per le cellule Luc siRNA-transfettate.
      Nota: In questa analisi, i segnali CENP-B sono stati utilizzati come segnali di riferimento per CUL4A e RBX1 come descritto nelle precedenti relazioni.
    3. Utilizzare un file di Excel per il calcolo dopo copiando e incollando i dati grezzi dal software del segnale quantitativa sopra descritta. Vedere anche supplementare file di codice: (5.2.1.4) e (5.2.2.6) per i dettagli. Un esempio di calcolo è mostrato nella Tabella 3.
  4. Analizzare almeno 20 cellule per eliminare variazione colorazione e acquisizione delle immagini per ogni livello di misurazione. Opzionalmente usare "valore medio" di rimanere segnali centromero-cinetocore per ogni analizzati cella per confrontare questi valori tra le diverse proteine ​​centromero-cinetocore.

6. Western Blot analisi delle proteine ​​totali

  1. Risospendere le cellule in denaturazione tampone A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desossicolato; 0,5% SDS, 1 mM EDTA e completa proteasi inibitore cocktail gratuito-EDTA), 26 soggetti la sospensione di un sonicazione e il processo di congelamento-scongelamento, e la misuraconcentrazioni di proteine ​​come segue:
    1. Per il processo di sonicazione, aggiungere 50 ml di tampone A per le cellule raccolte da due pozzetti di una piastra di polistirene 6 pozzetti a 48-72 ore dopo la trasfezione (vedi protocollo 1). Operare un sonicatore dotata di corno disgregatore e microtip (vedi elenco dei materiali / Equipment) per 15 sec durata intermittente impulsi totale (duty cycle del 50%) per un campione.
    2. Per il processo di congelamento-scongelamento, congelare cellule con azoto liquido e scongelare le cellule a temperatura ambiente.
    3. Misurare concentrazioni di proteine ​​usando un saggio commerciale proteine ​​reagenti I o II (vedi elenco dei materiali / attrezzature).
      Nota: I lisati sono diluiti con rapporto di 1:10 nella misurazione delle concentrazioni di proteine ​​sia con reagente I o II. A questa diluizione, la SDS presente nel tampone A mostra poca o nessuna interferenza in questa misura.
  2. Mescolare il lisato contenente 20-30 mg di proteine ​​totali con tampone di caricamento 2 × 4 × o SDS-PAGE. 27 Lessare i campioni per5 min e poi caricarli su un 12,0% -15,0% denaturazione gel di SDS-poliacrilammide per l'elettroforesi.
  3. Trasferire le proteine ​​separate mediante SDS-PAGE su una membrana PVDF utilizzando un metodo Western blotting descritto in precedenza. 17,24,27-31
    1. Bloccare i siti di legame non specifici sulla membrana con latte scremato 5% a 1 × PBS, e incubare la membrana con soluzioni di anticorpi primari diluiti per 1 ora a RT. Vedere elenco dei materiali / attrezzature per informazioni dettagliate (ad esempio, il rapporto di diluizione) di ogni anticorpo primario.
    2. Dopo aver lavato le membrane 3-4 volte (ogni 3 a 5 minuti di incubazione con agitazione) con PBS-T tampone (1 × PBS e 0,1% Tween-20), incubare la membrana in una miscela di vicino infrarosso (IR) fluorescenti anticorpi secondari coniugati colorante (rapporto di diluizione di 1: 20.000), anticorpi secondari coniugati DyLight (rapporto di diluizione di 1: 20.000), e / o perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpi secondari (diluito in PBS-T; dilutiil rapporto di 1: 10.000) per 1 ora a RT. Vedere elenco dei materiali / attrezzature per informazioni dettagliate (ad esempio, il rapporto di diluizione) di ogni anticorpo secondario.
  4. Lavare la membrana 3 volte, e quindi acquisire la membrana per analizzare le proteine ​​con il sistema di imaging a raggi infrarossi e / o l'imager chemiluminescenza per il rilevamento immunoblot (vedi elenco dei materiali / attrezzature).
    1. Per utilizzare il sistema di imaging a raggi infrarossi, vedi (6.4.1) in Supplemental Codice File.
    2. Per utilizzare il imager chemiluminescenza, vedi (6.4.2) in Supplemental Codice File. Utilizzare un substrato ultrasensibile migliorato chemiluminescenza (ECL) (vedi elenco dei materiali / Equipment) per questo sistema.

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Results

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Immunofluorescenza di endogena CENP-A supporta l'ipotesi che CUL4A-E3 ligasi è richiesto per la localizzazione di CENP-A per centromeri
I nostri studi recenti hanno dimostrato che CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligasi attività è necessario per ubiquitylation di lisina 124 (K124) sulla CENP-A e la localizzazione di CENP-A per centromeri. 17 Inizialmente, il complesso interfase-centromero (ICEN) è stato isolato da anti-CENP-a: nativo immunoprecipitazione della cromati...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni molti studi hanno sviluppato diversi saggi di microscopia quantitativa per le cellule fisse. 42 I progressi nel campo della biologia centromero-cinetocore spesso richiede una comprensione della funzione centromero-specifica o specifiche cinetocoro delle proteine ​​di cui subcellulare regolazione spazio-temporale riflette le funzioni mutevoli queste proteine ​​durante il ciclo cellulare. Quindi, qui abbiamo sviluppato metodi di IIF colorazione e un test quantitativo IIF per analizzare specifi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM68418.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668reagente di trasfezione I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778reagente di trasfezione II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Terreno di sierino ridotto, caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
DMEM ad alto contenuto di glucosio (Dulbecco' s Eagle modificato' LifeTechnologies/BioWhittaker12-604DMEM ad alto contenuto di glucosio, caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, origine statunitenseLife Technologies/Gibco10082FBS (siero fetale bovino)
Poli-L-lisina SOLUZIONESIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-lisina, 0,1% p/v, in acqua
Acqua distillata ultrapuraLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Acqua sterile per colture tissutali 
Vetro Micro Cover (22 mm x 22 mm) Surgipath105Vetro di copertura (22 mm x 22 mm) 
Cluster di colture cellulari a 6 pozzettiFisher/Corning Incorporated07-200-83Piastra in polistirene a 6 pozzetti 
Penicillina, Streptomicina; LiquidFisher/Gibco15-140Penicillina-streptomicina
PAP PEN Binding SiteAD100.1Penna barriera idrofobica (per una barriera idrorepellente nella colorazione immunofluorescente)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol per analisi di cellule mitotiche
TN-16, inibitore dei microtubuli (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 per analisi di cellule mitotiche
BSA (albumina sierica bovina)SIGMA-SLDRICHA7906Reagente bloccante
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergente per permeabilizzazione
ParaformaldeideSIGMA-SLDRICHP6148Reagante di fissazione
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Per colorazione nucleare
p-fenilendiamminaSIGMA-SLDRICHP6001Per il montaggio di terreni VWR
Micro Slides, FrostedVWR International48312-013Micro scivoli 
Anticorpo anti-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorpo anti-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PAnticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF, fissazione metanolo/acetone)-1:400 (IIF, fissazione paraformaldeide)
Anticorpo anti-CENP-B abcamab25734Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF, fissazione metanolo/acetone)-1:400 (IIF, fissazione con paraformaldeide)
Anticorpo anti-centromero (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Antisiero centromero umano; rapporto di diluizione di 1:2000 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-HBD612142Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-IN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaAnticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anticorpo anti-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Hec1 AnticorpoGeneTexGTX110735di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Ska1abcamab46826Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF3165Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF7425Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A anticorpoN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriAnticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anticorpo anti-RBX1Segnalazione cellulare4397Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:2000 (WB)
Anticorpo anti-GAPDHChemiconMAB374Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-RabbitIgG Life Technologies/InvitrogenA11008anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato per affinità)
Latte in polvere scremato (sostituto approvato del latte in polvere di garofano)Fisher ScientificNC9255871 (riordino n. 190915; Lot# 90629)Microscopio
a fluorescenza motorizzato Leica DM IRE2 per latte scremato Microscopio a fluorescenza motorizzatoLeica
Lente ad immersione in olio HCX PL APO 63xLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OLIO PH 3 CS63X Lente ad immersione in olio
HCX PL APO 100x Lente ad immersione in olioLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OLIO PHE100X Lente ad immersione
in olio Leica EL6000 Sorgente luminosa compattaLeicaSorgente luminosa compatta esterna per eccitazione fluorescente
Fotocamera CCD digitale ORCA-R2HamamatsuC10600-10B 
Openlab versione 5.5.2 Software per l'imaging scientifico Perkin Elmer/ImprovisionPer l'osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi
delle immagini Velocity versione 6.1.1 Software di analisi delle immagini 3D Perkin Elmer/ImprovisionPer l'osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi delle immagini
Cocktail completo di inibitori della proteasi privi di EDTARoche11873580001/11836170001Compresse da cocktail di inibitori della proteasi
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine I per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con SDS
al 2%)Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine II per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con SDS allo 0,1%)
Immobilon-FLEMD Millipore IPFL00010membrana PVDF per il trasferimento
di IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)
IRDye 680 IgG anti-coniglio di capraLI-COR Biosciences926-32221Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)
IgG di capra anti-topo DyLight 549Fisher ScientificPI35507anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)
DyLight 649Fisher ScientificPI35565anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)
anti-topo di capraSanta CruzSC-2005anticorpo secondario coniugato con HRPPanticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (Secondario purificato per affinità anticorpale); rapporto di diluizione di 1:10000 (IIF)
anti-coniglio di capraSanta CruzSC-2004Anticorposecondario coniugato con HRPanticorpo secondario coniugato con luce DyLightAnticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:10000 (IIF)
Openlab versione 5.5.2. Software di imaging scientifico Software Improvision/PerkinElmerA
Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Quantification)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450Sonicatore
Branson Ultrasonics Microtip Step, Solido, Filettato 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Tromba disgregatrice per sonicazione
Sonicatore a ultrasuoni Branson Microtip Tapered 6.5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Microtip per la sonicazione
Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx LI-COR Biosciences Sistema diimaging a infrarossi per la rilevazione di
Software di analisi Image Studio Ver 4.0 LI-COR BiosciencesSoftware
C Imager molecolare Versadoc MP4000 Sistema Bio-RadImager a chemiluminescenza per la rilevazione di immunoblot
Quantità Un software di analisi 1-D Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto Substrato di massima sensibilitàThermo34095Substrato chemiluminescente avanzato (ECL) ultrasensibile
policlonale  Telecamera CCD digitale Anticorpo secondario coniugato con Anticorpo secondario coniugato HRP Anticorpo secondario coniugato HRP immunoblot

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