Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

L'obiettivo generale di questo test immunofluorescente indiretto è quello di ottimizzare la localizzazione e la quantificazione delle proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene, tra cui la proteina A del centromero e le proteine esogene CENP-A flag-taged nelle cellule umane. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come identificare e quantificare le proteine centromero-cinetocore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per quantificare diversi livelli di espressione del centromero-cinetocore a seconda dell'anafase selezionata di interesse.

18 ore dopo la semina, lavare una volta le cellule coltivate con PBS e aggiungere 500 microlitri di terreno di siero ridotto a ciascun pozzetto della piastra di coltura in polistirene a sei pozzetti. Quindi, trasfettare le cellule in ciascun pozzetto con una soluzione di miscela A e B appena preparata e incubare le colture a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo quattro ore e mezza, cambiare il DMEM a glucosio medio-alto integrato con FBS e antibiotici e rimettere la piastra nell'incubatore di coltura cellulare.

Da 48 a 72 ore dopo, aspirare il terreno di coltura cellulare e sciacquare le cellule una volta con PBS, aggiungendo la soluzione salina lungo i lati dei pozzetti di coltura per evitare di disturbare le cellule. Quindi fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Al termine del periodo di fissazione, sciacquare le cellule due volte con tampone Kb2 e permeabilizzare i campioni nel tampone Kb1 per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi sciacquare le cellule una volta con il tampone Kb2 e bloccare qualsiasi legame non specifico con l'aggiunta di un nuovo tampone Kb2. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pinza per rimuovere i vetri di copertura seminati da ciascuno dei pozzetti e utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare barriere idrofobiche attorno a ciascun campione di vetro di copertura. Trasferire i vetri di copertura in una nuova piastra di polistirene a sei pozzetti e immergere i campioni nell'anticorpo primario appropriato per un'ora a 37 gradi Celsius.

Quindi sciacquare le cellule tre volte con il tampone Kb2 e marcarle con l'anticorpo secondario appropriato per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, sciacquare i campioni con cinque lavaggi di 6 minuti in tampone Kb2. Quindi etichettare i nuclei cellulari con tampone Kb3 contenente DapE per cinque minuti a temperatura ambiente, seguiti da uno o due lavaggi in tampone Kb2 e riempire nuovamente i pozzetti con tampone Kb2.

Posizionare ora una goccia di terreno di montaggio al centro di un vetrino da microscopio per ogni vetro di copertura delle cellule e rimuovere qualsiasi liquido dai campioni di cellule. Infine, posizionare con cura ogni campione al centro di uno dei vetrini da microscopio preparati e rimuovere il supporto di montaggio in eccesso con un tovagliolo di carta. Come osservato in questo esperimento rappresentativo, i livelli di espressione endogena della proteina CENP-A nei lisati cellulari totali delle cellule trasfettate con siRNA CUL4A erano simili ai livelli di espressione di CENP-A nelle cellule trasfettate con siRNA luciferasi.

Inoltre, i livelli proteici di CENP-A endogeno nei lisati cellulari totali delle cellule trasfettate con siRNA RBX1 erano simili ai livelli endogeni di CENP-A delle cellule trasfettate con siRNA luciferasi, suggerendo che la CUL4A RBX1 E3 ligasi è necessaria per la localizzazione di CENP-A nei centromeri. I mutanti di lisina CENP-A perdono la loro capacità di localizzarsi all'interno dei centromeri, suggerendo che l'ubiquitinazione di CENP-A K124 è essenziale per la localizzazione di CENP-A ai centromeri. È importante sottolineare che la fusione esogena della monoubiquitina della proteina CENP-A ha salvato il mutante CENP-A K124R in delocalizzazione, riportando la proteina alla sua posizione centromerica.

Una volta padroneggiate, le procedure di fissazione cellulare e colorazione immunofluorescente possono essere completate in cinque o sei ore se eseguite correttamente. Ricordarsi di applicare delicatamente tutte le soluzioni sui lati dei pozzetti in modo che le cellule non vengano staccate dai vetri di copertura durante il risciacquo o l'immersione dei campioni. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide riscaldata al di fuori di una stanza ventilata o che i materiali infiammabili vicino al fuoco possono essere estremamente pericolosi e che è necessario prendere sempre le dovute precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.