Name: Le proteine immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Impara a rilevare e quantificare le proteine del centromero-cinetocoro nelle cellule umane mediante immunofluorescenza indiretta. Questo metodo ottimizza la localizzazione di CENP-A endogena ed esogena per studi di biologia cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM68418.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Negli ultimi anni molti studi hanno sviluppato diversi saggi di microscopia quantitativa per le cellule fisse. 42 I progressi nel campo della biologia centromero-cinetocore spesso richiede una comprensione della funzione centromero-specifica o specifiche cinetocoro delle proteine ​​di cui subcellulare regolazione spazio-temporale riflette le funzioni mutevoli queste proteine ​​durante il ciclo cellulare. Quindi, qui abbiamo sviluppato metodi di IIF colorazione e un test quantitativo IIF per analizzare specifi...

&quot;I centromeri&quot; sono stati classicamente definiti come regioni della ricombinazione meiotica soppressa nel campo della genetica e in seguito riconosciuto come la costrizione primaria dei cromosomi mitotici, che svolge un ruolo essenziale nel accurata segregazione dei cromosomi durante la mitosi. &quot;cinetocori&quot; sono stati descritti come strutture multistrato che si legano ai microtubuli alla superficie di centromeri, come rivelato dalla microscopia elettronica; &quot;cinetocori&quot; sono stati successivamente definiti come il complesso macromolecolare che localizza al centromero dei cromosomi mitotici. Nonostante una divergenza drammatica di sequenze di DNA centromeriche tra i vertebrati, la struttura e la composizione cinetocoro sono altamente conservati. Una interazione dinamica tra microtubuli del fuso e il cinetocore è necessario per la separazione fedele dei cromosomi durante la mitosi, e difetti di centromero-cinetocore piombo funzione per aneuploidie e quindi il cancro. Il centromero nella maggior parte dei eucariotisenza sequenza di DNA definito, ma si compone di grandi array (0,3-5 MB) di DNA ripetitivo alphoid costituito da DNA α-satellite 171-bp. Salvo il lievito, identità centromero non è raggiunto dalla sequenza di DNA, ma per la presenza di un nucleosoma speciale che contiene la variante istone H3 CenH3 (centromero Proteina A [CENP-A] nell&#39;uomo). 5 CENP-A nucleosomi localizzare la piastra interna di cinetocori mammiferi 7 e si legano al DNA α-satellite 171 bp. centromeri attivi richiedono CENP-A-contenente nucleosomi per dirigere l&#39;assunzione di una rete costitutiva centromero-associato (Ccan) e le proteine ​​del cinetocore, che insieme regolano l&#39;attaccamento di cromosomi al fuso mitotico e la progressione del ciclo successivo attraverso il posto di blocco mandrino. Alla luce degli elementi di cui sopra, CENP-A è stato proposto per essere il marchio epigenetica del centromero 8; Tuttavia, il processo con cui CENP-A è incorporato into DNA centromerico e dei fattori responsabili di questa incorporazione non sono ancora stati ben caratterizzati. Una breve dominio centromero-targeting (CATD) risiede nel istone piegare regione CENP-A, e la sostituzione della corrispondente regione H3 con il CATD è sufficiente H3 al centromero. 9 Diversi studi suggeriscono ruoli funzionali per post-traduzionale modifica (PTM) di CENP-A 12-16; Tuttavia, i meccanismi molecolari di queste PTM di CENP-A nel reclutamento di centromeri non sono ancora stati chiariti. Abbiamo precedentemente riportato che CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligasi attività è necessario per CENP-A K124 ubiquitinazione e la localizzazione di CENP-A per centromeri. 17 La scoperta e la caratterizzazione di proteine ​​cinetocoro hanno portato a una nuova visione per quanto riguarda la segregazione dei cromosomi. 18 Più di 100 componenti cinetocoro sono stati identificati in cellule dei vertebrati dai vari approcci. 19,20 un sottoIn piedi di come cinetocori assemblare e la funzione viene anche dalla caratterizzazione delle funzioni cellulari di ciascuna rete centromero-cinetocore proteine ​​e proteine-proteine ​​all&#39;interno delle cellule. 19 visualizzazione diretta e di imaging avanzate metodologie di microscopia a fluorescenza forniscono notevole risoluzione di componenti centromero-cinetocore e permettono osservazione diretta di componenti molecolari specifici dei centromeri e cinetocori. Inoltre, i metodi di immunofluorescenza indiretta (IIF) colorazione utilizzando anticorpi specifici sono fondamentali per queste osservazioni. Tuttavia, nonostante le numerose segnalazioni circa i protocolli di IIF, pochi problemi discussi in dettaglio di specifiche proteine ​​centromero-cinetocore. 1-4 Così, lo sviluppo e la segnalazione metodi di IIF colorazione e un test quantitativo IIF per analizzare specificamente ogni proteina centromero-cinetocore è estremamente importante. In IIF colorazione, si deve procedere con il protocollo di colorazione per evitare la perdita della proteina di interesse oil resto della cellula. Tuttavia, la fissazione distrugge siti antigenici occasionalmente e diverse combinazioni anticorpo-antigene funziona male con un fissativo, ma molto bene con un altro, 21 e la scelta di fissativo dipende in gran parte della proteina (s) di interesse. Pertanto, diversi metodi di fissativi sono cruciali per IIF colorazione delle proteine ​​centromero-cinetocore. sono stati sviluppati metodi qui ottimizzate di immunofluorescenza indiretta (IIF) colorazione e un test per affrontare la localizzazione delle proteine ​​centromero-cinetocore endogeni, tra cui CENP-A e esogeni proteine ​​CENP-A-Flag con tag, e la quantificazione di queste proteine ​​nelle cellule umane. Questi metodi possono essere applicati all&#39;analisi delle proteine ​​centromero-cinetocore in altre specie.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>reagente di trasfezione I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>reagente di trasfezione II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Terreno di sierino ridotto, caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio (Dulbecco' s Eagle modificato' Life</td> <td>Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio, caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, origine statunitense</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (siero fetale bovino)</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina SOLUZIONE</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-lisina, 0,1% p/v, in acqua</td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Acqua sterile per colture tissutali&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetro Micro Cover (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Vetro di copertura (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cluster di colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Piastra in polistirene a 6 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina, Streptomicina; Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicillina-streptomicina</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Penna barriera idrofobica (per una barriera idrorepellente nella colorazione immunofluorescente)</td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol per analisi di cellule mitotiche</td></tr><tr><td>TN-16, inibitore dei microtubuli (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 per analisi di cellule mitotiche</td></tr><tr><td>BSA (albumina sierica bovina)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Reagente bloccante</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Detergente per permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Reagante di fissazione</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Per colorazione nucleare</td></tr><tr><td>p-fenilendiammina</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Per il montaggio di terreni VWR</td></tr><tr><td>Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro scivoli&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF, fissazione metanolo/acetone)-1:400 (IIF, fissazione paraformaldeide)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-B&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF, fissazione metanolo/acetone)-1:400 (IIF, fissazione con paraformaldeide)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-centromero (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Antisiero centromero umano; rapporto di diluizione di 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-H</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-H</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-I</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-KNL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Hec1</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Hec1 Anticorpo</td> policlonale <td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ska1</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A anticorpo</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RBX1</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4397</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio; rapporto di diluizione di 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Anticorpo monoclonale di topo; rapporto di diluizione di 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit</td><td>IgG Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato con affinità)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato per affinità)</td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato (sostituto approvato del latte in polvere di garofano)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (riordino n. 190915; Lot# 90629)</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>a fluorescenza motorizzato Leica DM IRE2 per latte scremato&nbsp;</td><td>Microscopio a fluorescenza motorizzato</td> <td>Leica</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Lente ad immersione in olio HCX PL APO 63x</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OLIO PH 3 CS</td><td>63X Lente ad immersione in olio</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x Lente ad immersione in olio</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OLIO PHE</td><td>100X Lente ad immersione</td></tr><tr><td>in olio Leica EL6000 Sorgente luminosa compatta</td><td>Leica</td><td></td><td>Sorgente luminosa compatta esterna per eccitazione fluorescente</td></tr><tr><td>Fotocamera CCD digitale ORCA-R2</td>Telecamera CCD digitale <td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Openlab versione 5.5.2 Software per l'imaging scientifico&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Per l'osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi</td></tr><tr><td>delle immagini Velocity versione 6.1.1 Software di analisi delle immagini 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Per l'osservazione, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi privi di EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>Compresse da cocktail di inibitori della proteasi</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine I per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con SDS</td></tr> <tr><td>al 2%)Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine II per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con SDS allo 0,1%)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore IPFL00010</td><td></td><td>membrana PVDF per il trasferimento</td></tr><tr><td>di IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 IgG anti-coniglio di capra</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG di capra anti-topo DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)</td></tr><tr>Anticorpo secondario coniugato con <td>DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:20000 (IIF)</td></tr><tr>Anticorpo secondario coniugato HRP <td>anti-topo di capra</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>anticorpo secondario coniugato con HRPPanticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (Secondario purificato per affinità anticorpale); rapporto di diluizione di 1:10000 (IIF)</td></tr><tr>Anticorpo secondario coniugato HRP <td>anti-coniglio di capra</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004Anticorpo</td><td>secondario coniugato con HRPanticorpo secondario coniugato con luce DyLightAnticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente IR (anticorpo secondario purificato per affinità); rapporto di diluizione di 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab versione 5.5.2. Software di imaging scientifico&nbsp;</td><td>Software Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>A</td></tr><tr><td>Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicatore</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Microtip Step, Solido, Filettato 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>Tromba disgregatrice per sonicazione</td></tr><tr><td>Sonicatore a ultrasuoni Branson Microtip Tapered 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>Microtip per la sonicazione</td></tr><tr><td>Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences Sistema di</td><td>imaging a infrarossi per la rilevazione di</td><td></td> immunoblot</tr><tr><td>Software di analisi Image Studio Ver 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>C Imager molecolare Versadoc MP4000 Sistema&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Imager a chemiluminescenza per la rilevazione di immunoblot</td></tr><tr><td>Quantità Un software di analisi 1-D&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrato di massima sensibilità</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Substrato chemiluminescente avanzato (ECL) ultrasensibile</td></tr></tbody></table>

le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni centromere-cinetocoro

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeri" e "cinetocore" si riferiscono al sito in cui i cromosomi si associano al fuso durante la divisione cellulare. La visualizzazione diretta delle proteine centromero-cinetocore durante il ciclo cellulare rimane uno strumento fondamentale per studiare i meccanismi di queste proteine. I metodi di imaging avanzati nella microscopia a fluorescenza forniscono una notevole risoluzione dei componenti centromero-cinetocoro e consentono l'osservazione diretta di specifici componenti molecolari dei centromeri e dei cinetocore. Inoltre, i metodi di colorazione con immunofluorescenza indiretta (IIF) utilizzando anticorpi specifici sono cruciali per queste osservazioni. Tuttavia, nonostante i numerosi rapporti sui protocolli IIF, pochi hanno discusso in dettaglio i problemi di specifiche proteine centromero-cinetocore. 1-4 Qui riportiamo protocolli ottimizzati per colorare le proteine centromero-cinetocore endogene nelle cellule umane utilizzando la fissazione con paraformaldeide e la colorazione IIF. Inoltre, riportiamo protocolli per rilevare le proteine esogene CENP-A Flag-taged in cellule umane sottoposte a fissazione con acetone o metanolo. Questi metodi sono utili per rilevare e quantificare le proteine centromero-cinetocore endogene e le proteine CENP-A contrassegnate con flag, comprese quelle nelle cellule umane.

Immunofluorescenza di endogena CENP-A supporta l&#39;ipotesi che CUL4A-E3 ligasi è richiesto per la localizzazione di CENP-A per centromeri I nostri studi recenti hanno dimostrato che CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligasi attività è necessario per ubiquitylation di lisina 124 (K124) sulla CENP-A e la localizzazione di CENP-A per centromeri. 17 Inizialmente, il complesso interfase-centromero (ICEN) è stato isolato da anti-CENP-a: nativo immunoprecipitazione della c...

Qui riportiamo protocolli per rilevare proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene nelle cellule umane e quantificare questi livelli di proteine a centromeri-cinetocori mediante colorazione immunofluorescente indiretta attraverso l'uso di fissazione (paraformaldeide, acetone o metanolo).

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

L'obiettivo generale di questo saggio di immunofluorescenza indiretta è ottimizzare la localizzazione e la quantificazione di proteine endogene ed esogene del centromero-cinetocoro, inclusa la proteina A del centromero e proteine CENP-A esogene marcate con un flag, in cellule umane. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali su come identificare e quantificare le proteine del centromero-cinetocoro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata per quantificare diversi livelli di espressione del centromero-cinetocoro a seconda dell'anafase di interesse selezionata.18 ore dopo la semina, lavare le cellule coltivate una volta con PBS e aggiungere 500 microlitri di mezzo con siero ridotto in ogni pozzetto della piastra di coltura in polistirene a sei pozzetti. Successivamente, trasfettare le cellule in ogni pozzetto con una soluzione fresca della miscela A e B e incubare le colture a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo quattro ore e mezza, sostituire il mezzo con DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con FBS e antibiotici e reinserire la piastra nell'incubatrice per colture cellulari.48-72 ore dopo, aspirare il mezzo di coltura cellulare e risciacquare le cellule una volta con PBS, aggiungendo la soluzione salina lungo i lati dei pozzetti della coltura per evitare di disturbare le cellule. Quindi fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Al termine del periodo di fissazione, risciacquare le cellule due volte con tampone Kb2 e permeabilizzare i campioni in tampone Kb1 per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi risciacquare le cellule una volta con tampone Kb2 e bloccare qualsiasi legame non specifico aggiungendo del tampone Kb2 fresco. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, utilizzare pinzette per rimuovere i coprivetri seminati da ciascun pozzetto e usare una penna per barriera idrofoba per tracciare barriere idrofobe intorno a ciascun campione di coprivetro. Trasferire i coprivetri in una nuova piastra in polistirene a sei pozzetti e immergere i campioni nell'anticorpo primario appropriato per un'ora a 37 gradi Celsius.Quindi lavare le cellule tre volte con tampone Kb2 ed etichettarle con l'anticorpo secondario appropriato per un'ulteriore ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con cinque lavaggi di 6 minuti ciascuno in tampone Kb2. Successivamente, colorare i nuclei cellulari con tampone Kb3 contenente DapE per cinque minuti a temperatura ambiente, seguito da uno o due lavaggi in tampone Kb2 e ricompilare le pozzette con tampone Kb2.Ora posizionare una goccia di mezzo di montaggio al centro di un vetrino per ogni coprioggetto con cellule, e rimuovere qualsiasi liquido dai campioni cellulari. Infine, posizionare con attenzione ciascun campione al centro di uno dei vetrini preparati e rimuovere l’eccesso di mezzo di montaggio con un fazzoletto di carta. Come osservato in questo esperimento rappresentativo, i livelli di espressione proteica endogena di CENP-A nei lisati totali di cellule trasfettate con siRNA per CUL4A erano simili ai livelli di espressione di CENP-A nelle cellule trasfettate con siRNA per Luciferasi.Inoltre, i livelli proteici di CENP-A endogeno nei lisati cellulari totali di cellule trasfettate con siRNA per RBX1 erano simili ai livelli di CENP-A endogeno nelle cellule trasfettate con siRNA per Luciferasi, suggerendo che il ligasi E3 CUL4A RBX1 è necessario per il corretto posizionamento di CENP-A ai centromeri. Mutanti della lisina di CENP-A perdono la capacità di localizzarsi all'interno dei centromeri, indicando che l'ubiquitinazione di CENP-A in K124 è essenziale per il suo corretto posizionamento ai centromeri. In modo importante, la fusione esogena di monoubiquitina alla proteina CENP-A ha ripristinato la localizzazione del mutante CENP-A K124R, riportando la proteina alla sua posizione centromerica.Una volta acquisita padronanza, le procedure di fissazione cellulare e di colorazione immunofluorescente possono essere completate in cinque o sei ore se eseguite correttamente. Ricordarsi di applicare delicatamente tutte le soluzioni sui lati dei pozzetti in modo che le cellule non si stacchino dai loro vetrini durante il risciacquo o l'immersione dei campioni. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide riscaldata all'esterno di un ambiente ventilato o avvicinare materiali infiammabili a fiamme può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare le opportune precauzioni.

immunofluorescence-analysis-endogenous-exogenous-centromere

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Imaging di proteine ​​centrosomica durante Drosophila spermatogenesi è un metodo efficace per identificare nuove proteine ​​critiche per la biologia cntrosoma nonché per chiarire la particolare funzione di giocatori noti in questo processo.

I centrosomi Imaging in Fly Testicoli

Qui, viene sviluppato un nuovo test di fluorescenza quantitativa per misurare i cambiamenti nel livello di una proteina specificamente nei centrosomi normalizzando l'intensità di fluorescenza di quella proteina a quella di uno standard interno appropriato.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Abbiamo sviluppato una strategia per purificare e un gran numero di centrioli in diversi orientamenti suscettibili per microscopia di Super-risoluzione e con una media di singola particella di immagine.

Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Presentato qui è un protocollo per l'imaging a cellule vive a super-risoluzione nel tessuto intatto. Abbiamo standardizzato le condizioni per l'imaging di una popolazione di cellule staminali adulte altamente sensibile nel suo ambiente di tessuti nativi. Questa tecnica prevede il bilanciamento della risoluzione temporale e spaziale per consentire l'osservazione diretta dei fenomeni biologici nei tessuti vivi.

Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Il movimento cromosomico durante la profase meiotica è un fenomeno poco compreso che è fondamentale per la formazione delle spore. Questo protocollo descrive un metodo per acquisire, analizzare e quantificare i movimenti del centromero durante la profase meiotica nei meiociti maschi di Arabidopsis thaliana .

Caratterizzazione con imaging dal vivo dei movimenti del centromero durante la profase meiotica maschile in Arabidopsis thaliana

Impara a rilevare e quantificare le proteine del centromero-cinetocoro nelle cellule umane mediante immunofluorescenza indiretta. Questo metodo ottimizza la localizzazione di CENP-A endogena ed esogena per studi di biologia cellulare.

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

Esplora altri video

Le proteine immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro