Articolo metodologico

TAPE: Biodegradabile Una Hemostatic Glue Ispirato da un composto Ubiquitous nelle piante per applicazioni chirurgiche

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DOI:

10.3791/53930

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8 giugno 2016

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1The Graduate School of Nanoscience and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Department of Chemistry, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 3Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

Descriviamo il protocollo più semplice per preparare la colla medica biodegradabili che ha una capacità emostatico efficace. TAPE è un aggregato supramolecolare idroimmiscibile preparata mescolando di acido tannico, un composto ubiquitario nelle piante, e poli glicole (etilene), ottenendo un 2,5 volte maggiore aderenza impermeabile rispetto colla di fibrina commerciale.

Abstract

Questo video descrive il protocollo più semplice per preparare la colla chirurgica biodegradabili che ha una capacità emostatico efficace e una maggiore forza di adesione resistente all'acqua di adesivi tissutali commerciali. adesivi medici hanno attirato grande attenzione come potenziali strumenti alternativi per suture e punti metallici a causa della loro convenienza in uso con il minimo invasività. Anche se ci sono diversi protocolli per sviluppare adesivi tessutali compresi quelli commercialmente disponibili quali colle di fibrina e materiali cianoacrilato a base, soprattutto richiedono una serie di sintesi chimiche di molecole organiche, o metodi proteina-purificazione complicate, nel caso di materiali bio-driven (cioè, colla di fibrina). Inoltre, lo sviluppo di colle chirurgiche esibendo elevate proprietà adesive mantenendo biodegradabilità è ancora una sfida per la difficoltà di ottenere buone prestazioni in ambiente umido del corpo. Illustriamo un nuovo metodo per preparare uncolla medica, noto come TAPE, dalla separazione in base al peso di un aggregato supramolecolare immiscibile con l'acqua formata dopo una miscelazione fisica di una molecola adesivo wet-resistenti di origine vegetale, T Annic una CID (TA), e un noto biopolimero, poli (etilene) glicole (PEG). Con il nostro approccio, TAPE mostra alta resistenza di adesione, che è 2,5 volte più di colla di fibrina commerciale in presenza di acqua. Inoltre, TAPE è biodegradabile in condizioni fisiologiche e può essere utilizzato come un potente collante emostatico contro spurgo tessuto. Ci aspettiamo che l'uso diffuso di nastro in una varietà di ambienti medici e le applicazioni di consegna della droga, come i polimeri per muco-adesione, depositi di droga, e altri.

Introduzione

In un decennio, gli sforzi sono stati fatti per sostituire attuali suture chirurgiche e punti metallici per chiudere ferite con adesivi biodegradabili / bioassorbibili per la loro praticità nell'uso e bassa invasività dei tessuti durante i trattamenti chirurgici. Disponibili in commercio tessutali adesivi sono classificati in quattro tipi: (1) derivati ​​cianoacrilato 1, (2) colle di fibrina formata mediante conversione enzimatica da fibrinogeno in fibrina polimeri da trombina 2,3, (3) materiali a base di proteine ​​come chimicamente o fisicamente albumina reticolato e / o gelatina 4,5, e quelli (4) a base di polimeri sintetici 6. Anche se sono stati utilizzati in molte applicazioni cliniche, tutti gli adesivi hanno i loro svantaggi intrinseci e inconvenienti che possono essere ostacoli al loro uso diffuso. colle cianoacrilato basato mostrano elevata forza di adesione ai tessuti, ma la loro sottoprodotti tossici quali cianacetato e formaldeide formatasi durante la degradazione, spesso causa segnogradi ificant di risposte infiammatorie 7. Colle di fibrina e di albumina o di materiali a base di gelatina hanno problemi di sicurezza per quanto riguarda la trasmissione di componenti infettivi, come virus di origine animale: plasma del sangue umano per colle di fibrina e animali tra cui bovini, galline, maiali e pesci per colle a base di gelatina 8. Anche se un paio di adesivi a base di polimeri sintetici sono stati approvati dalla Federal Drug Administration (FDA), la maggior parte degli adesivi in polimeri sintetici continuano ad avere difficoltà nel ridurre al minimo le fasi del processo di produzione e di raggiungere biocompatibilità 9. Soprattutto, tutte le colle soffrono di scarsa resistenza meccanica e di adesione ai tessuti umidi 10. Recentemente, adesivi tissutali biomimetici ispirati da cozze marine 11-13, gechi 14, Geco con cozze 15 e worm endoparassiti 16 sono state emergendo come alternative promettenti a colle medici attuali per la loro meccanica e sintonizzabileproprietà adesive con biocompatibilità. Tuttavia, fino ad oggi, ci sono ancora questioni da affrontare prima che diventino prodotti commerciali 17.

Qui riportiamo un nuovo tipo di colla medica chiamata TAPE che viene preparato mediante legami idrogeno intermolecolari tra una molecola adesiva di derivazione vegetale, acido tannico (TA), ed un polimero bio-inerte poli (etilene glicole) (PEG), come indica il nome. TA è un tannino idrolizzabile rappresentante ubiquitariamente trovato durante il metabolismo secondario delle piante. Essa ha attirato molta attenzione a causa della sua antiossidante, anti-mutageno, e le proprietà anti-cancerogene e ha dimostrato di partecipare interazioni supramolecolari con molti polimeri come poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) e poli (N - vinilpirrolidone) (PVPON), per formare layer-by-layer (LBL) pellicole 18-20 e farmaco-rilasciando microcapsule 21-23. In questo studio, si scopre che TA può agire come un efficaceporzione funzionale adesivo resistente all'acqua per formare un adesivo medico, TAPE. Con la semplice miscela con TA, un non-fouling PEG polimero diventa una colla supramolecolare con 2.5 volte maggiore forza di adesione rispetto colla di fibrina commerciale, e questa adesione è stata mantenuta per tutta fino a 20 cicli di attacco e stacco, anche in presenza di acqua . La sua capacità emostatico stato testato su un modello di emorragia epatica in vivo e ha mostrato una buona capacità emostatico per fermare l'emorragia in pochi secondi. TAPE ha il suo significato notevole in un settore correlato come il primo adesivo di origine vegetale, che può rivelare una nuova visione di risolvere gli inconvenienti dei problemi attuali con approcci bio-ispirati. Ci aspettiamo inoltre l'uso diffuso di TAPE in una varietà di applicazioni mediche e farmaceutiche come muco-adesivi, patch droga rilascio, medicazioni cura delle ferite, e altri per il semplice metodo di preparazione, scalabilità, velocità di biodegradazione sintonizzabile, nonché ADHES altamente wet-resistentiproprietà di ioni.

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Protocollo

Tutto cura degli animali e gli esperimenti vengono eseguiti secondo il protocollo etico fornito dalla KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology) IRB (Institutional Review Board).

Formazione 1. TAPE

  1. Per preparare una soluzione TA, collocare una fiala di vetro 4 ml dimensioni su un agitatore magnetico, e aggiungere 1 ml di acqua distillata con una barra di agitazione. Aggiungere 1 g di acido tannico alla fiala, e sciogliere nell'acqua da blanda agitazione a 200 rpm per più di 1 ora. Quando il TA è completamente sciolto, la miscela diventa trasparente di colore marrone.
  2. Preparare una soluzione di PEG aggiungendo 1 g di PEG in polvere (4 bracci, 10 kDa, e lineare, 4,6 kDa) a 1 ml di acqua distillata seguita mescolandoli vortexando per alcuni secondi per fare una sospensione bianca. Tenere questo slurry in incubatore a 60 ° C per 10 min. fino a quando il bianco diventa completamente trasparente.
    NOTA: Il punto di fusione di PEG con peso molecolare 10 kDa è di circa 55- 60 ° C, e il 4 kDa uno è di 53 - 58 ° C. Fuso PEG diventa miscibile con acqua in modo che un'alta concentrazione di PEG in acqua fino a 1 g / ml può essere realizzato come una soluzione limpida. Una volta che una soluzione limpida PEG è formata ad una temperatura elevata, la soluzione è ancora stabile a temperatura ambiente dopo il raffreddamento.
  3. Aggiungere 329 ml di PEG (4 bracci, 10 kDa) soluzione preparata al punto 1.2 a 671 microlitri della soluzione di TA preparato al punto 1.1 (Nel caso di un PEG lineare con 4,6 kDa, aggiungere 311 microlitri di una soluzione di PEG al 689 ml di una soluzione TA) in una provetta micro-centrifuga. fondere delicatamente le due soluzioni viscose e simile al miele con una spatola stretta per mescolarli in modo omogeneo.
    ATTENZIONE: Entrambe le soluzioni sono abbastanza viscosa, così lo scienziato deve lentamente ma sufficiente tirare verso l'alto e trasferire le soluzioni con una micropipetta.
  4. Spin il composto preparato al punto 1.3 a 12,300 xg per 3 minuti in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso.
  5. attenzione remil sobrio come gran parte del surnatante possibile utilizzando una micropipetta, e raccogliere il prodotto che ha depositato giù: Questo è il nastro completamente formato. Dopo la formazione TAPE, conservare in frigorifero (4 - 8 ° C) fino a diverse settimane. NOTA: TAPE può essere sterilizzata con raggi gamma o un trattamento a fascio di elettroni prima dell'uso in applicazioni chirurgiche.

2. Misura della forza di adesione di nastro

  1. Preparare due pezzi di tessuto cutaneo suina con un diametro di 6 mm tagliando con un punzone biopsia dopo aver rimosso tutto il grasso sul tessuto cutaneo.
    NOTA: Il tessuto della pelle dei suini è stato ottenuto da pelle sana fianco suina ed è stata acquistata da un mercato della carne locale situato a Daejeon in Corea del Sud.
  2. Applicare la colla cianoacrilato commerciale al lato esterno di ogni tessuto e fissare il tessuto al tondino metallico.
    NOTA: Il tondino metallico viene utilizzato come impugnatura supplementare così tessuti unNon ri direttamente afferrato dalla macchina. Di conseguenza, può essere sostituito con altri materiali seguenti la configurazione della macchina di trazione.
  3. Applicare una goccia di TAPE (una goccia di TAPE è circa 3 - 6 mg) ad un lato del tessuto. Poi, diffondere la TAPE uniformemente usando un altro tessuto tra i due tessuti sui loro lati interni in modo che siano attaccati come mostrato nella Figura 2A.
  4. Quindi, fissare manualmente e staccare le due parti dei tessuti più volte per mescolare in modo omogeneo e massimizzare l'interfaccia tra ogni tessuto e TAPE.
  5. Con l'UTM, accuratamente presa ciascun lato della barra. La forza di adesione sarà determinato dalla forza necessaria per staccare due tessuti attaccato con TAPE. Innanzitutto, applicare una forza di 20 N per 1 min. Successivamente, con la macchina, tirare ciascuna asta in senso opposto ad una velocità di 1 mm / min. finché i tessuti sono completamente staccati.
    Nota: I dati saranno date come forza-distanza (FD) della curva rilevato dal movimentodi ciascuna asta.
  6. Calcolare la forza di adesione del TAPE dividendo la forza massima (kN) mostrato nella curva FD ottenuto nel passo 2.5 dalla superficie del campione, cioè, 3,14 x (0,003 m) 2.
  7. Per monitorare la forza di adesione in presenza di acqua, aggiungere 20 ml di acqua nell'area indipendente tra due tessuti, e collegarli immediatamente. Con la macchina, eseguire nuovamente il test di distacco.

3. Test in vitro degradazione

  1. Tagliare un tappo (d = 8 mm) del tubo micro-centrifuga, e pesare il tappo a definirlo come W c.
  2. Riempire il cappuccio con 150 mg di nastro, e pesare di nuovo tutti insieme per impostarlo come un peso complessivo iniziale W 0.
    ATTENZIONE: Non sovraccaricare TAPE nel tappo. L'altezza del nastro deve essere inferiore alla parte superiore del tappo, come può essere una barriera fisica per un flusso di tampone PBS generato dal processo di agitazione durante l'incubazione nel passo 3.4.
  3. Mettere il tappo contenente TAPE in un pallone di coltura cellulare (75 cm 2), aggiungere 50 ml di tampone PBS (1x, pH 7,4) al pallone di coltura cellulare in modo che il nastro nel tappo è completamente immerso nel tampone PBS, come mostrato nella Figura 3A (n = 5).
  4. Incubare la pallone di coltura cellulare preparato al punto 3.3 in un incubatore orbitale agitando a 37 ° C, simile a condizioni fisiologiche, con blanda agitazione (50 rpm).
    ATTENZIONE: mantenere la condizione agitazione a 50 giri al minuto. Regimi più elevati potrebbe causare un crollo di TAPE.
  5. Ad ogni punto di tempo, prendere il tappo con nastro dal pallone di coltura cellulare, e poi asciugarli soffiando gas di azoto. Pesare il tappo contenente restante TAPE. Impostare il peso in ogni punto il tempo di W t. Sostituire il PBS fresco di nuovo, e agitare di nuovo dopo la misurazione W t in ogni punto.
  6. Calcolare il peso rimanente relativo (%) la seguente equazione.
    Peso relativo restante (%) = (W t - W c) / (W 0 - W c) x 100%

4. emostatiche Capacità di TAPE

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere eseguite in conformità con le linee guida e protocollo etico forniti dal Ministero coreano della Sanità e del Welfare.

  1. Per valutare la capacità emostatica in vivo, rivedere il modello di fegato di emorragia del mouse, come descritto in rif 24.
  2. Anestetizzare quindici topi (normale topo ICR, 6 settimane, 30 - 35 g, maschio) con una iniezione intraperitoneale di tiletamina-zolazepam (33,333 mg / kg) e xilazina (7,773 mg / kg) (n = 5 per gruppo). Per confermare il corretto anestesia, stringere la zampa dell'animale delicatamente e osservare i movimenti, come il ritiro della zampa, ecc Nessun movimento indica che l'animale è sufficientemente anestetizzato di fare un intervento chirurgico.
  3. Per prevenire la secchezza degli occhi dell'animale, applicare veterinario pomata per gli occhi sufficientemente sottoposto aESTHESIA. Esporre il fegato attraverso una incisione addominale mediana, e pungere il fegato con un ago 18 G per indurre il sanguinamento.
  4. Rimuovere il sangue che scorre con garza sterile, e mettere 100 ml di nastro adesivo o colla di fibrina (controllo positivo) immediatamente sul sito di sanguinamento.
    NOTA: Nessun ulteriore sutura è necessaria dopo l'applicazione TAPE grazie alle sue proprietà adesive altamente resistente sangue sui tessuti della ferita. Per il controllo negativo, nessun trattamento avviene al sito di sanguinamento.
  5. In ogni caso, inserire una carta da filtro con massa nota sotto il fegato per raccogliere il sangue dal sito danni. Sostituire la carta con uno nuovo ogni 30 secondi per 4 volte (es., 2 min).
  6. Misurare la massa di sangue assorbita su ogni carta da filtro raccolti ogni 30 sec. Dopo l'esperimento animale, sacrificare i topi con CO 2 asfissia l'eutanasia.

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Risultati

TAPE è un aggregato supramolecolare che assesta dopo centrifugazione la miscela di due soluzioni acquose contenenti TA (1 g / ml in acqua distillata) e PEG (1 g / ml in acqua distillata) con 2: 1 rapporto in volume (Figura 1A). Il rapporto di miscelazione è il fattore chiave per il raggiungimento di alta forza di adesione; quando TAPE è formata da un rapporto 2: 1 di miscelazione, 20 unità del gruppo ossidrile (-OH) in 25 unità di TA interagiscono tra gruppo etere (-O-) ...

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Discussione

Abbiamo sviluppato una nuova classe di emostatico adesivo chiamato TAPE ispirato l'interazione molecolare resistente all'acqua di un composto polifenolico di derivazione vegetale, TA. TA è un tannino idrolizzabile rappresentante che ha attirato l'attenzione in modo significativo a causa della sua anti-ossidanti, anti-batteriche, anti-mutagene, e anti-cancerogene.

Il processo di creazione di TAPE è estremamente semplice, scalabile, ed ecologico, in quanto è solo la miscelazione di...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dalla National Research Foundation of South Korea: Mid-career scientist grant (2014002855), e dal Ministero dell'Industria, del Commercio e delle Risorse Naturali: World Premier Material Development Program. Questo lavoro è anche supportato in parte dal Center for Nature-inspired Technology (CNiT) del KAIST Institute for NanoCentury (KINC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido tannicoSigma-aldrich403040
Poli(ossido di etilene), 4 bracci, terminato idrossilatoAldrich565709Averge Mn ~ 10.000
Poli(glicole etilenico)Aldrich373001Media Mn 4.600
Punzone per biopsiaMiltex33-36Diametro = 6 mm
Aron AlphaToagosei Co., Ltd.Colla istantanea
Macchina di prova universale (UTM)Instron5583
Provette per microcentrifugaSPL life science60015da 1,5 ml
SPL life science1009090 x 15 mm
Fosfato di sodio monobasicoSigmaS50111x Ingrediente PBS
Fosfato di sodio bibasicoSigmaS51361x Ingrediente PBS
Cloruro di sodioDuchefa biochemieS0520.50001x ingrediente PBS
Agitatore di incubazioneCompagno di laboratorioSIF6000R
topi ICROrient bioNormal ICR mouse6 settimane, 30 - 35 g, maschio
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)Virbac
Zylazine (Rompun)Bayer
Ago PrecisionGlideTM (18 G)BD30203218 G
Carta da filtroWhatman1001 125Diametro = 125 mm
ParafilmBemis Flexible PakagingPM996
Piastra di Petri

Riferimenti

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