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Bioengineering

TAPE: ein biologisch abbaubares hämostatische Kleber Inspiriert von einer Ubiquitous Verbindung in Pflanzen für chirurgische Anwendung

Published: June 8, 2016 doi: 10.3791/53930
Automatic Translation
1, 1,2, 2,3
1The Graduate School of Nanoscience and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Department of Chemistry, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 3Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School

Summary

Wir beschreiben die einfachste Protokoll biologisch abbaubare medizinische Kleber herzustellen, die eine effektive hämostatische Fähigkeit hat. TAPE ist ein mit Wasser nicht mischbaren supramolekularen Aggregats, hergestellt durch Mischen von Gerbsäure, ein allgegenwärtiges Verbindung in Pflanzen gefunden und Poly (ethylen) glycol, ein 2,5-mal größer wasserbeständige Haftung im Vergleich mit handelsüblichen Fibrinkleber ergibt.

Abstract

Dieses Video beschreibt die einfachste Protokoll für biologisch abbaubare chirurgische Kleber vorbereitet, die eine effektive hämostatische Fähigkeit und eine größere wasserbeständige Haftfestigkeit als kommerzielle Gewebekleber hat. Medizinische Klebstoffe haben große Aufmerksamkeit als mögliche alternative Werkzeuge zu Nähten und Klammern angezogen aufgrund ihrer Bequemlichkeit in der Nutzung mit minimaler Invasivität. Obwohl es mehrere Protokolle für die Entwicklung von Gewebeklebern einschließlich kommerziell erhältlich wie Fibrinkleber und Cyanoacrylat-basierten Materialien, meist erfordern sie eine Reihe von chemischen Synthesen von organischen Molekülen, oder komplizierte Proteinreinigungsverfahren, bei Bio-driven Materialien (dh Fibrin - Kleber). Auch die Entwicklung von chirurgischen Leimen die eine hohe Haftungseigenschaften, während die biologische Abbaubarkeit beibehalten ist immer noch eine Herausforderung aufgrund von Schwierigkeiten bei guter Leistung in der feuchten Umgebung des Körpers zu erreichen. Wir stellen eine neue Methode ein vorzubereitenmedizinische Kleber, als TAPE bekannt, durch die gewichtsabhängige Trennung eines mit Wasser mischbaren nach einer physikalischen Mischung von einer Pflanze abgeleiteten, nassfesten Klebstoff Molekül gebildet supramolekulares Aggregat, Annic T A cid (TA), und ein wohlbekannter Biopolymers, Poly (ethylen) glycol (PEG). Mit unserem Ansatz, zeigt TAPE hohe Haftfestigkeit, die in Gegenwart von Wasser das 2,5-fache mehr als kommerzielle Fibrinkleber ist. Weiterhin TAPE ist in physiologischen Bedingungen biologisch abbaubar und kann als ein potenter hämostatische glue gegen Gewebeblutung verwendet werden. Wir erwarten, dass die weit verbreitete Verwendung von Klebeband in einer Vielzahl von medizinischen Einrichtungen und Arzneimittelverabreichungsanwendungen, wie Polymere für muco-Adhäsion, Wirkstoffdepots und anderen.

Introduction

In einem letzten zehn Jahren wurden Anstrengungen unternommen aktuellen chirurgischen Nähten und Klammern zu ersetzen Wunden mit biologisch abbaubaren / bioresorbierbaren Klebstoffe aufgrund ihrer Bequemlichkeit in der Nutzung und geringe Gewebe Invasivität bei chirurgischen Behandlungen zu schließen. Im Handel erhältlichen Gewebekleber werden in vier Typen eingeteilt: (1) Derivate Cyanacrylat 1, (2) Fibrin durch enzymatische Umwandlung von Fibrinogen gebildet Leime Polymeren zu Fibrin durch Thrombin 2,3, (3) Protein-basierten Materialien, wie chemisch oder physikalisch vernetztem Albumin und / oder Gelatine 4,5, und (4) synthetische Polymerbasis diejenigen 6. Obwohl sie in vielen klinischen Anwendungen verwendet wurden, sind alle Klebstoffe haben ihre eigenen intrinsischen Nachteile und Nachteile auf, die Hindernisse für ihre weit verbreitete Verwendung sein kann. Cyanacrylat-Basis Klebstoffe zeigen hohe Haftfestigkeit zu den Geweben, aber ihre toxische Nebenprodukte, wie beispielsweise Cyanacetat und Formaldehyd während des Abbaus gebildet werden, oft Zeichen verursachenificant Grad von Entzündungsreaktionen 7. Fibrinkleber und Albumin oder Gelatine-basierte Materialien haben Sicherheitsprobleme in Bezug auf die Übertragung von Infektions Komponenten wie Viren aus tierischen Quellen: humanem Blutplasma für Fibrinkleber und Tieren , einschließlich Vieh, Geflügel, Schweine und Fisch für Gelatine basierenden Klebern 8. Obwohl einige synthetische polymerbasierte Klebstoffe durch die Federal Drug Administration (FDA) genehmigt worden ist , hergestellt meisten Klebstoffe aus synthetischen Polymeren weiterhin Schwierigkeiten bei der Minimierung der Herstellungsprozessschritte zu haben und Biokompatibilität zu erreichen 9. Am wichtigsten ist , leiden alle Klebstoffe aus schlechten mechanischen und Haftfestigkeit an feuchten Tüchern 10. Vor kurzem von marinen Muscheln inspiriert Klebstoffe biomimetische Gewebe 11-13, Geckos 14, gecko mit Muschel 15 und endoparasitärer 16 Würmer haben als viel versprechende Alternativen zu aktuellen medizinischen Klebstoffe aufgrund ihrer einstellbaren mechanischen worden Schwellen- undKlebeeigenschaften mit Biokompatibilität. Doch bis heute gibt es immer noch Probleme angegangen werden , bevor sie kommerzielle Produkte 17 geworden.

Hier berichten wir über eine völlig neue Art der medizinischen Kleber TAPE genannt, die durch die intermolekulare Wasserstoffbindung zwischen einer Pflanze abgeleitetes Adhäsionsmolekül, Gerbsäure (TA) und einem bio-inerten Polymer Poly (ethylenglykol) (PEG) hergestellt wird, wie der Name schon sagt. TA ist eine repräsentative Gallotannine ubiquitär während des Sekundärmetabolismus von Pflanzen gefunden. Es wurde viel Aufmerksamkeit aufgrund seiner anti-oxidant, antimutagene und antikarzinogene Eigenschaften angezogen und wurde in supramolekularen Wechselwirkungen mit vielen Polymeren, wie Poly (N Isopropylacrylamid) (PNIPAM) und Poly (N teilnehmen gezeigt - Vinylpyrrolidon) (PVPON) zu bilden , Schicht- für -Schicht (LbL) -Folien 18-20 und arzneimittelfreisetzende Mikrokapseln 21-23. In dieser Studie, entdecken wir, dass TA als effizienter agieren könnenwasserbeständige Klebstoff funktionelle Einheit einen medizinischen Klebstoff, TAPE zu bilden. Durch einfaches Mischen mit TA, ein Nicht-Fouling-Polymer PEG wird zu einer supramolekularen Klebstoff mit 2,5-fach erhöhte Haftfestigkeit im Vergleich mit handelsüblichen Fibrinkleber und diese Haftung wurde während bis zu 20 Zyklen Anbringen und Abnehmen, auch in Gegenwart von Wasser gehalten . Die hämostatische Fähigkeit wurde auf einem Leberblutungen Modell in vivo getestet und zeigte eine gute hämostatische Fähigkeit innerhalb von wenigen Sekunden die Blutung zu stoppen. TAPE hat seine wichtige Bedeutung in einem verwandten Bereich als erste aus Pflanzen gewonnene Klebstoff, der neue Einblicke in die Lösung der Nachteile der derzeitigen Probleme mit bio-inspirierte Ansätze offenbaren. Wir erwarten, dass auch die weit verbreitete Verwendung von TAPE in einer Vielzahl von medizinischen und pharmazeutischen Anwendungen wie schleimig-Klebstoffe, arzneimittelfreisetzende Pflaster, Wundpflege Dressings und anderen aufgrund seiner einfachen Herstellungsverfahren, Skalierbarkeit abstimmbaren Bioabbaurate sowie sehr nass feste KlebsIonen-Eigenschaften.

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Protocol

Alle Tierpflege und Experimente werden in Übereinstimmung mit dem ethischen Protokoll vom KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology) IRB (Institutional Review Board) vorgesehen durchgeführt.

1. TAPE Formation

  1. Für eine TA-Lösung vorbereitet, legen Sie ein 4 ml-Größe Glasfläschchen auf einem Magnetrührer, und 1 ml destilliertem Wasser mit einem Rührstab. 1 g Gerbsäure in das Fläschchen, und lösen sie im Wasser durch leichtes Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute für mehr als 1 Stunde. Wenn das TA vollständig gelöst, wird die Mischung transparent mit einer braunen Farbe.
  2. Bereiten einer PEG-Lösung durch Zugabe von 1 g PEG-Pulver (4-Arme, 10 kDa und linear, 4,6 kDa) auf 1 ml destilliertem Wasser, gefolgt von Vermischen für einige Sekunden durch Vortexen eine weiße Aufschlämmung herzustellen. Halten dieser Aufschlämmung in den Inkubator bei 60 ° C für 10 min. bis der weiße wird man ganz klar.
    HINWEIS: Der Schmelzpunkt von PEG mit 10 kDa Molekulargewicht beträgt etwa 55- 60 ° C und die 4 kDa ist 53-58 ° C. Geschmolzener PEG wird mit Wasser mischbaren, so daß eine hohe Konzentration von PEG in Wasser bis zu 1 g / ml kann als klare Lösung erreicht werden. Sobald eine klare PEG-Lösung bei einer hohen Temperatur gebildet wird, ist die Lösung, immer noch stabil bei Raumtemperatur nach dem Abkühlen.
  3. Hinzufügen 329 ul der PEG (4-Arme, 10 kDa) Lösung in Schritt von 1,2 bis 671 & mgr; l der TA-Lösung in Schritt 1.1 hergestellten (Im Fall eines linearen PEG mit 4,6 kDa, fügen 311 ul einer PEG-Lösung 689 ul einer Lösung, TA) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsichtig mischen die beiden viskos und honigartige Lösungen mit einem schmalen Spachtel sie homogen zu vermischen.
    ACHTUNG: Beide Lösungen sind ziemlich viskos, so muss der Wissenschaftler langsam , aber ausreichend hochziehen und die Lösungen mit einer Mikropipette übertragen.
  4. Drehen um die Mischung in Schritt hergestellten 1,3 bei 12.300 × g für 3 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor ausgestattet.
  5. sorgfältig remso viel von der Überstand wie möglich ove mit einer Mikropipette, und das Produkt zu sammeln, die sesshaft wurde: Dies ist der voll ausgebildet TAPE. Nach TAPE Bildung, sollte sie in den Kühlschrank (4 - 8 ° C) für bis zu mehreren Wochen . HINWEIS: TAPE können in chirurgischen Anwendungen vor der Verwendung durch Gammastrahlung oder Elektronenstrahlbehandlung sterilisiert werden.

2. Die Messung der Haftfestigkeit von TAPE

  1. Bereiten Sie zwei Stücke von Schweinehautgewebe mit einem Durchmesser von 6 mm durch eine Biopsie Punch schneiden, nachdem alle Fett auf das Hautgewebe zu entfernen.
    HINWEIS: Die Schweinehautgewebe wurde von gesunden Schweinen Flanke Haut erhalten und wurde von einem lokalen Fleischmarkt befindet sich in Daejeon in Südkorea gekauft.
  2. Anwenden kommerziellen Cyanacrylat Klebstoff auf die Außenseite jedes Gewebes, und befestigen das Gewebe an den Metallstab.
    HINWEIS: Der Metallstab als Zusatzhandgriff verwendet wird , so Geweben asind nicht direkt von der Maschine erfaßt. Dementsprechend kann es mit anderen Materialien nach der Konfiguration der Zugprüfmaschine ersetzt werden.
  3. Einen Tropfen TAPE (ein Tropfen TAPE beträgt ca. 3 bis 6 mg) zu einer Seite des Gewebes. Dann verteilt das Band gleichmäßig ein anderes Gewebe zwischen den beiden Geweben an ihren Innenseiten mit Hilfe so sie gebunden sind , wie in 2A gezeigt.
  4. Dann manuell befestigen und die beiden Seiten der Gewebe mehrmals lösen homogen zu vermischen und die Schnittstelle zwischen jedem Gewebe und TAPE maximieren.
  5. Mit der UTM, sorgfältig Griff auf jeder Seite der Stange. Die Haftfestigkeit wird durch den mit Klebeband angebracht zu lösen zwei Gewebe benötigt Kraft bestimmt werden. Zuerst wird eine Kraft von 20 N für 1 min anzuwenden. Als nächstes wird mit der Maschine mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / min jede Stange in einer entgegengesetzten Richtung zu ziehen. bis die Gewebe vollständig abgelöst.
    HINWEIS: Die Daten werden als Kraft-Weg (FD) Kurve , die durch die Bewegung erkannt gegeben werdenjeder Stange.
  6. Berechnen der Haftfestigkeit des Bandes durch die maximale Kraft Dividieren (kN) auf der Kurve FD in Schritt 2.5 von der Probenoberfläche erreicht , gezeigt, das heißt, 3,14 x (0,003 m) 2.
  7. Zur Überwachung der Haftfestigkeit in Gegenwart von Wasser, fügen Sie 20 ul Wasser auf dem abgelösten Bereich zwischen zwei Geweben, und sie sofort befestigen. Mit der Maschine, führen wieder die Ablösung Test.

3. In - vitro - Abbautest

  1. Schneiden Sie eine Kappe (d = 8 mm) von Mikrozentrifugenröhrchen und wiegen die Kappe als W c zu definieren.
  2. Füllen Sie die Kappe mit 150 mg TAPE, und wiegen alle wieder zusammen , es zu setzen als Gesamtausgangsgewicht W 0.
    ACHTUNG: Legen Sie nicht zu TAPE in der Kappe. Die Höhe der Band sollte niedriger sein als die Oberseite der Kappe, da es sich um eine physikalische Barriere zu einem Strom von PBS-Puffer durch den Rührvorgang während der Inkubation in Schritt 3.4 generiert werden kann.
    3. (2 75 cm) TAPE in eine Zellkulturflasche enthält, und 50 ml PBS - Puffer hinzufügen (1x, pH 7,4) in die Zellkulturflasche , so dass die Band in der Kappe ist vollständig eingetaucht in dem PBS - Puffer, wie in 3A gezeigt (n = 5).
  3. Inkubieren der Zellkulturflasche, hergestellt in Schritt 3.3 in einem Orbital Schüttelinkubator bei 37 ° C, ähnlich wie bei physiologischen Bedingungen, unter leichtem Rühren (50 rpm).
    ACHTUNG: Halten Sie die Rührbedingungen bei 50 Umdrehungen pro Minute. Höhere Drehzahl könnte einen Zusammenbruch von TAPE verursachen.
  4. Zu jedem Zeitpunkt, nehmen Sie die Kappe mit Band aus der Zellkulturflasche, und sie dann trocknen durch Stickstoffgas bläst. Wiegen Sie die Kappe auf dem Band verbleibende enthält. Stellen Sie das Gewicht zu jedem Zeitpunkt zu W t. Ersetzen Sie den frisch wieder PBS, und schütteln Sie sie wieder nach W t zu jedem Zeitpunkt zu messen.
  5. Berechnen Sie die relativen Restgewicht (%) die folgende Gleichung.
    Relative Restgewicht (%) = (W t c) / (W 0 - W c) x 100%

4. hämostatische Fähigkeit von TAPE

HINWEIS: Alle Tierversuche sollten vom koreanischen Ministerium für Gesundheit und Soziales , die mit den Richtlinien und ethischen Protokoll gemäß durchgeführt werden.

  1. Um die in vivo hämostatische Fähigkeit zu bewerten, die hemorrhaging Mauslebermodell überprüfen , wie in Lit. 24 beschrieben.
  2. Anesthetize fünfzehn Mäuse (normal ICR-Maus, 6 Wochen 30 - 35 g, männlich) mit einer intraperitoneale Injektion von Tiletamin-Zolazepam (33.333 mg / kg) und Xylazin (7,773 mg / kg) (n = 5 pro Gruppe). Ordnungsgemäße Betäubung zu bestätigen, kneifen die Pfote des Tieres sanft und beobachten Bewegungen wie die Pfote zurückzuziehen usw. Keine Bewegung gibt an, dass das Tier ausreichend narkotisierten ist eine Operation zu tun.
  3. Bei Trockenheit von Tieraugen gelten Tierarzt Salbe die Augen ausreichend, während sie unter einem verhindernesthesia. Setzen Sie die Leber über eine Mittellinie Bauchschnitt, und stechen die Leber mit einer 18 G-Nadel Blutungen zu induzieren.
  4. Entfernen Sie das fließende Blut mit steriler Gaze und legte 100 ul TAPE oder Fibrinkleber (positive Kontrolle) unmittelbar an der Blutungsstelle.
    HINWEIS: Keine weiteren Vernähen benötigt wird , um nach TAPE Anwendung aufgrund seiner hoch Blut feste Klebeeigenschaften auf Wundgewebe. Für die Negativkontrolle tritt keine Behandlung an der Stelle der Blutung.
  5. In jedem Fall, setzen Sie ein Filterpapier mit bekannten Masse unterhalb der Leber das Blut von der Schadstelle zu sammeln. Ersetzen Sie das Papier durch eine frische alle 30 Sekunden für 4 - mal (dh., 2 min).
  6. Messen Sie die Masse der absorbierten Blut auf jedem Filterpapier alle 30 Sekunden gesammelt. Nach dem Tierversuch opfern , um die Mäuse durch CO 2 Ersticken Euthanasie.

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Representative Results

TAPE ist ein supramolekulares Aggregat , das nach dem Zentrifugieren der Mischung von zwei wässrigen Lösungen legt sich enthält TA (1 g / ml in destilliertem Wasser) und PEG (1 g / ml in destilliertem Wasser) mit 2: 1 - Volumenverhältnis (1A). Das Mischungsverhältnis ist der Schlüsselfaktor in hohe Haftfestigkeit zu erreichen; Wenn das Band durch einen 2 gebildet wird: 1 Mischungsverhältnis, 20 Einheiten der Hydroxylgruppe (-OH) in 25 Einheiten von TA mit jeder Ethergruppe (-O-) in PEG zu interagieren, mit maximaler in der höchsten intermolekulare Wasserstoffbindungsbildung ergeb Haftungseigenschaften. Die verbleibenden fünf Einheiten -OH scheinen durch die intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen mit benachbarten Carbonylgruppen (C = O) in TA (1B) verbraucht wird. Wenn entweder eine der Komponenten im Überschuß des 2 war: Verhältnis 1 Volumen wurde die Haftfestigkeit verringert insbesondere 25. Wasserstoffbrücken werden auch die kritischen molekularen Ebene Interaktion mit Geweben. RegelungDie inter- und intramolekularen Wasserstoffbindung zwischen TA und PEG für den Zusammenhalt und zwischen TA und die Gewebe für die Adhäsion könnte eine plausible Mechanismus TAPE als wirksame chirurgische Kleber sein.

Für die Haftfestigkeit zu messen, wurde zuerst zwischen jeder TAPE epidermale Seite von zwei Schweinehäute mit einem Durchmesser von 6 mm aufgetragen. Anschließend wurde es über Stangen auf einer Zugprüfmaschine gegriffen außerhalb jedes Schweinehaut angebracht ist , wie in 2A dargestellt. Die Kraft , die benötigt zwei Schweinehäute zu lösen wurde von der Maschine in Abwesenheit (2B) und in Gegenwart von Wasser (2C) nach jeweils 5 Zyklen wiederholten Anbringen und Lösen gemessen, bis zu 20 Zyklen. Die Haftfestigkeit in einem trockenen Zustand betrug etwa 200 kPa bei der ersten Messung, und auch nach 20 Zyklen auf etwa 250 kPa erhöht. In Gegenwart von Wasser zu jedem Zyklus hinzugefügt, war Adhäsion etwa 90 kPa, die dannverringerte sich nach 20 Zyklen auf 50 kPa. Die Haftfestigkeit in einem nassen Zustand war niedriger als die in einem trockenen Zustand, aber es war immer noch vergleichbar mit dem handelsüblichen Kleber, Fibrinkleber, die in Abwesenheit von Wasser 25 identisch uns durch eine Einstellung etwa 70 kPa gemessen.

Die Abbaubarkeit von TAPE wurde durch gravimetrische Analyse in vitro (Figur 3) untersucht. Band wurde in 1x PBS (pH 7,4) bei 37 ° C unter leichtem Rühren eingetaucht, dann wird die Masse jedes Mal zurückblieb, wurde zu 21 Tage gemessen werden. Fotos von der verbleibenden Band jedes Mal sind auch in 3B gezeigt. Die TAPE hergestellt von TA und PEG Mischen mit einem 1: 1 - Verhältnis war nach 13 Tagen vollständig abgebaut, und 42% der TAPE durch zwei Komponenten mit einem 2 hergestellt: Es wurde nach 21 Tagen (3C) 1 - Verhältnis verschlechtert. Die Abbaurate ist in inverse Korrelation mit der Haftfestigkeit, weil schnelleren Abbau hauptsächlich zurückzuführen ist aufniedrigere intermolekulare Wechselwirkung, und dieser Zustand erzeugt geringere Haftfestigkeit in dem Fall von TAPE, wie zuvor erwähnt. So war das Ergebnis wie erwartet; TAPE durch ein 2 gemischt: Verhältnis 1 zeigte langsamer Abbau als durch eine 1: 1-Verhältnis, da alle reaktiven OH in TA und alle O- in PEG die höchste Zahl von intermolekularen Wasserstoffbrücken. Bei einem 1: 1-Verhältnis, die überschüssige Menge an -O in PEG könnte den Zusammenhalt schwächen, in schnelleren Abbau führt.

Schließlich wurde die hämostatische Fähigkeit der TAPE in vivo untersucht. TAPE wurde zunächst unmittelbar auf der Mausleber angewendet nach der Beschädigung von einer 18 G - Nadel, wie in 4A gezeigt. Die Menge der Blutung während einer anfänglichen 30 Sekunden nach der Behandlung wurde durch Adsorbieren Blut auf einem Filterpapier gesammelt und Vergleichen der negativen (keine Behandlung) und Positivkontrolle (Fibrinkleber) (4B und 4C). Die Gesamtmenge der Blutung war auch calculATED indem die Menge der Blutung alle 30 Sekunden gesammelt werden. bis es gestoppt. Wie in 4D gezeigt, wurde Blutung wesentlich durch die hämostatische Fähigkeit der TAPE unterdrückt (die Gesamtblutungsmenge nur 15,4% der unbehandelten Fall war) als ein kommerzielles Produkt, Fibrinkleber (Die Gesamtblutungsmenge betrug 60,7% der unbehandelten Fall ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Die Bildung von TAPE (A) Serien Schritte des Herstellens TAPE. (Maßstab: 0,5 cm). (B) Eine chemische Reaktion von TAPE Bildung über intra- und intermolekularen Wasserstoffbrücken. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Haftfestigkeit von TAPE auf Schweinehaut (A) Ein Schema der Messeinstellung. (B - C) Haftfestigkeitsänderungen bei wiederholter Befestigung und Ablösung auf Schweinehaut (B) in Abwesenheit und (C) in Gegenwart von Wasser. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von 3 wiederholten Messungen (* p <0,05, ** p <0,01 *** p <0,001 und **** p <0,0001, mit Einweg-ANOVA-Test). (Re-Print mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 25.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Abbaurate von TAPE unter physiologischen Bedingungen (A) Ein Foto von der Messeinstellung.. (B) Repräsentative photos von TAPE an jedem Abbautest verbleiben. (C) Die restlichen% Massenänderungen nach einer Zeitdauer in einem 1x PBS - Puffer inkubiert (pH 7,4) bei 37 ° C wurde zu 21 Tagen überwacht up (TA: PEG = 2: 1 und 1: 1) (n = 5 Fehlerbalken ± SD). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Hämostatische Fähigkeit von TAPE In Vivo (A) Ein Foto , um die Anwendung von TAPE auf der Oberfläche eines durch eine 18 G - Nadel beschädigt Leber anzeigt. (B) zeigt Repräsentative Fotos , um die Menge von einer anfänglichen 30 Sekunden Blutungen. nach der Behandlung von TAPE, sowie der negativen (keine hämostatischen Mittels) und Positivkontrolle (Fibrinkleber). Jede quantitative Menge an bleeding wurde in (C) gezeigt. (D) Die Gesamtmenge an Blutungen, alle 30 Sekunden gesammelt , bis es gestoppt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von 5 wiederholten Messungen (* p <0,05, ** p <0,01 *** p <0,001 und **** p <0,0001, mit Einweg- oder Zweiweg- ANOVA-Test). (Re-Print mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 25.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Wir entwickelten eine völlig neue Klasse von hämostatischen Kleber genannt TAPE durch die wasserfesten molekulare Wechselwirkung einer Pflanze abgeleitetes Polyphenol-Verbindung angeregt, TA. TA ist eine repräsentative Gallotannine, die deutlich Aufmerksamkeit wegen seiner antioxidativen, antibakteriellen, anti-mutagen und anti-karzinogenen Eigenschaften angezogen hat.

Das Verfahren zur Herstellung TAPE ist extrem einfach, skalierbar und umweltfreundlich, da sie durch Zentrifugieren ohne weitere chemische Syntheseverfahren nur die einstufige Mischen von zwei wässrigen Lösungen folgt.

Das Zwei-Komponenten-Mischprotokoll ist das typischste und einfachste Methode Gewebekleber in herkömmlichen Produkten, wie beispielsweise Fibrinkleber verwendet zu bilden. Es wird durch Mischen von Fibrinogen und Thrombin kurz vor der Anwendung auf das Gewebe 3 gebildet. Jedoch wird mehrstufigen chemischen Synthese erforderlich, um die Komponenten eines Klebers in dem Fall vorzubereiten of Cyanoacrylat-Klebstoff und synthetische polymerbasierte Klebstoffe. Darüber hinaus sind hochgiftige Chemikalien manchmal als eine Komponente einbezogen chemisch die andere Komponente aus polymeren Precursoren in Protein-basierten Materialien, ausgehärtete von Glutaraldehyd und Klebstoff enthält, Formalin und Resorcin besteht vernetzen.

Materialien , die durch Glutaraldehyd gehärtet zeigte eine hohe in vivo Entzündungsreaktion auf Lungen- und Lebergewebe in Tierstudien unter Verwendung von Kaninchen, obwohl sie von der FDA für Aorten- Gewebe zugelassen wurde. Materialien Leim Formalin und Resorcinol leidet auch an Toxizität Bedenken aus Formalin entstehen 26 mit umgebenden Gewebe zu reagieren.

Die Zentrifuge Schritt ist der einzige Nachteil von TAPE als ein in - situ - bildende, injizierbare Klebstoff im Körper zu entwickeln, aber TAPE die plenteous Vorteile versprechen , seine offene, weite Verbreitung. Ein kritischer Schritt des TAPE Bildung ist, dass die Vermischung von zwei Komponenten könnenetwas schwierig sein, wegen ihrer hohen Viskosität, aber insgesamt, jeder konsequent riesige Mengen an TAPE in einem Labor ohne Charge zu Charge Variationen machen kann.

Die Haftfestigkeit von TAPE war 2,5 mal höher als die der weit verbreiteten kommerziellen Klebstoff, Fibrinkleber und Massenblutungen wurde erfolgreich durch das Blut festen Befestigung von TAPE auf die Wundstelle in unserer Mausleber-Blutungen Modell in vivo unterdrückt. Die Abbaugeschwindigkeit und mechanische Eigenschaften von TAPE können mit verzweigt / mehrarmige PEG sowie eine mit end-funktionellen Gruppen, wie Amin-, Carboxylat- und Epoxid weiter abstimmbar sein. Die maximale Haftfestigkeit in unseren Daten wurden durch das Verhältnis von einer Art von PEG optimiert (4-Arme, 10 kDa und 2-Arme, 6,4 kDa) auf TA, aber es sollte auch von end-funktionellen Gruppen, die Anzahl der Arme berührt und das Molekulargewicht von PEG.

Wir gehen davon aus, dass das Band auch weit verbreitete Verwendung als Medikamentendepot haben kann und Adhäsive Patch für Zwecke Wundheilung, nicht nur als ein hämostatisches Mittel aufgrund ihrer Fähigkeit , Chemikalien über die bekannte Affinität von TA auf eine Vielzahl von Makromoleküle zu verkapseln, einschließlich Rinderserumalbumin 27, 28 DNA, Poly (N Isopropylacrylamid) ( PNIPAM) 29, und Metallionen 30.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tannic acid Sigma-aldrich 403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated Aldrich 565709 Averge Mn ~ 10,000
Poly(ethylene glycol) Aldrich 373001 Average Mn 4,600
Biopsy punch Miltex 33-36 Diameter = 6 mm
Aron Alpha Toagosei Co., Ltd. Instant glue
Universal testing machine (UTM) Instron 5583
Microcentrifuge tubes SPL life science 60015 1.5 ml
Petri dish SPL life science 10090 90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011 1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic Sigma S5136 1x PBS ingredient
Sodium chloride Duchefa biochemie S0520.5000 1x PBS ingredient
Incubating shaker Lab companion SIF6000R
ICR mice Orient bio Normal ICR mouse 6 weeks, 30 - 35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50) Virbac
Zylazine (Rompun) Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G) BD 302032 18 G
Filter paper Whatman 1001 125 Diameter = 125 mm
Parafilm Bemis Flexible Pakaging PM996

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References

  1. Leggat, P. A., Smith, D. R., Kedjarune, U. Surgical applications of cyanoacrylate adhesives: a review of toxicity. ANZ J Surg. 77 (4), 209-213 (2007).
  2. MacGillivray, T. E. Fibrin Sealants and Glues. J Cardiac Surg. 18 (6), 480-485 (2003).
  3. Radosevich, M., Goubran, H. A., Burnouf, T. Fibrin sealant: scientific rationale, production methods, properties and current clinical use. Vox. Sang. 72 (3), 133-143 (1997).
  4. Schultz, D. G. FDA approval: BioGlue Surgical Adhesive P010003. FDA. , Available from: http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf/P010003a.pdf (2001).
  5. Nomori, H., Horio, H., Suemasu, K. The efficacy and side effects of gelatin-resorcinol formaldehyde-glutaraldehyde (GRFG) glue for preventing and sealing pulmonary. Surg. Today. 30 (3), 244-248 (2000).
  6. Duarte, A. P., Coelho, J. F., Bordado, J. C., Cidade, M. T., Gil, M. H. Surgical adhesives: Systematic review of the main types and development forecast. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1031-1050 (2012).
  7. Bhatia, S. K. Traumatic injuries. Biomaterials for clinical applications. , Springer. New York. 1st Ed 213-258 (2010).
  8. Bouten, P. J. M., et al. The chemistry of tissue adhesive materials. Prog.Polym. Sci. 39 (7), 1375-1405 (2014).
  9. Annabi, N., Tamayol, A., Shin, S. R., Ghaemmaghami, A. M., Peppas, N. A., Khademhosseini, A. Surgical materials: Current challenges and nano-enabled solutions. Nano Today. 9 (5), 574-589 (2014).
  10. Strausberg, R. L., Link, R. P. Protein-based medical adhesives. Trends.Biotechnol. 8 (2), 53-57 (1990).
  11. Bilic, G., et al. Injectable candidate sealants for fetal membrane repair: bonding and toxicity in vitro. Am J Obstet Gynecol. 202 (1), 1-9 (2010).
  12. Mehdizadeh, M., Weng, H., Gyawali, D., Tang, L., Yang, J. Injectable citrate-based mussel-inspired tissue bioadhesives with high wet strength for sutureless wound closure. Biomaterials. 33 (32), 7972-7980 (2012).
  13. Ryu, J. H., Lee, Y., Kong, W. H., Kim, T. G., Park, T. G., Lee, H. Catechol-functionalized chitosan/pluronic hydrogels for tissue adhesives and hemostatic materials. Biomacromolecules. 12 (7), 2653-2660 (2011).
  14. Mahdavi, A., et al. A biodegradable and biocompatible gecko-inspired tissue adhesive. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (7), 2307-2310 (2008).
  15. Lee, H., Lee, B. P., Messersmith, P. B. A reversible wet/dry adhesive inspired by mussels and geckos. Nature. 488, 338-341 (2007).
  16. Yang, S. Y., et al. A bio-inspired swellable microneedle adhesive for mechanical interlocking with tissue. Nature Commun. 4, 1702-1710 (2013).
  17. Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives: components of the surgical toolbox. Transfusion (Paris). 48 (7), 1502-1516 (2008).
  18. Erel, I., Schlaad, H., Demirel, A. L. Effect of structural isomerism and polymer end group on the pH-stability of hydrogen-bonded multilayers. J Colloid Interface Sci. 361 (2), 477-482 (2011).
  19. Shutava, T. G., Prouty, M. D., Agabekov, V. E., Lvov, Y. M. Antioxidant Properties of Layer-by-Layer films on the Basis of Tannic Acid. Chem Lett. 35 (10), 1144-1145 (2006).
  20. Schmidt, D. J., Hammond, P. T. Electrochemically erasable hydrogen-bonded thin films. Chem Commun. 46 (39), 7358-7360 (2010).
  21. Shutava, T., Prouty, M., Kommireddy, D., Lvov, Y. pH Responsive Decomposable Layer-by-Layer Nanofilms and Capsules on the Basis of Tannic Acid. Macromolecules. 38 (7), 2850-2858 (2005).
  22. Erel, I., Zhu, Z., Zhuk, A., Sukhishvili, S. A. Hydrogen-bonded layer-by-layer films of block copolymer micelles with pH-responsive cores. J Colloid Interface Sci. 355 (1), 61-69 (2011).
  23. Kim, B. -S., Lee, H. -I., Min, Y., Poon, Z., Hammond, P. T. Hydrogen-bonded multilayer of pH-responsive polymeric micelles with tannic acid for surface drug delivery. Chem Commun. 45 (28), 4194-4196 (2009).
  24. Murakami, Y., Yokoyama, M., Nishida, H., Tomizawa, Y., Kurosawa, H. A simple hemostasis model for the quantitative evaluation of hydrogel-based local hemostatic biomaterials on tissue surface. Colloids Surf B Biointerfaces. 65 (2), 186-189 (2008).
  25. Kim, K., et al. TAPE: A Medical Adhesive Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants. Adv Funct Mater. 25 (16), 2402-2410 (2015).
  26. Suzuki, S., Ikada, Y. Adhesion of cells and tissues to bioabsorbable polymeric materials: scaffolds, surgical tissue adhesives and anti-adhesive materials. J Adhes. Sci. Technol. 24 (13), 2059-2077 (2010).
  27. Lomova, M. V., et al. Multilayer Capsules of Bovine Serum Albumin and Tannic Acid for Controlled Release by Enzymatic Degradation. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (22), 11732-11740 (2015).
  28. Shin, M., Ryu, J. H., Park, J. P., Kim, K., Yang, J. W., Lee, H. DNA/Tannic Acid Hybrid Gel Exhibiting Biodegradability, Extensibility, Tissue Adhesiveness, and Hemostatic Ability. Adv Funct Mater. 25 (8), 1270-1278 (2015).
  29. Kozlovskaya, V., Kharlampieva, E., Drachuk, I., Chenga, D., Tsukruk, V. V. Responsive microcapsule reactors based on hydrogen-bonded tannic acid layer-by-layer assemblies. Soft Matter. 6 (15), 3596-3608 (2010).
  30. Oh, D. X., et al. A rapid, efficient, and facile solution for dental hypersensitivity: The tannin-iron complex. Sci Rep. 5, 10884 (2015).

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Bioengineering Heft 112 OP-Kleber Polyphenole Gerbstoffe PEGs Hämostase Biodegradable
TAPE: ein biologisch abbaubares hämostatische Kleber Inspiriert von einer Ubiquitous Verbindung in Pflanzen für chirurgische Anwendung
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Kim, K., Lee, H., Hong, S. TAPE: A… More

Kim, K., Lee, H., Hong, S. TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application. J. Vis. Exp. (112), e53930, doi:10.3791/53930 (2016).

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