Articolo metodologico

LC-MS Analisi delle piastrine umane come una piattaforma per lo Studio del metabolismo mitocondriale

DOI:

10.3791/53941

⸱

4 aprile 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui mostriamo isolato piastrine umane possono essere utilizzati come accessibili ex vivo modello per studiare adattamenti metabolici in risposta al complesso I inibitore rotenone. Questo approccio impiega tracing isotopica e relativa quantificazione dal liquido spettrometria cromatografia massa e può essere applicato ad una varietà di disegni di studio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metabolismo mitocondriale perturbato ha ricevuto un rinnovato interesse in quanto svolge un ruolo causale in una serie di malattie. Indagare le alterazioni delle vie metaboliche richiede un modello in cui i fattori esterni possano essere ben controllati, consentendo risultati riproducibili e significativi. Molti studi impiegano modelli cellulari trasformati per questi scopi; Tuttavia, la riprogrammazione metabolica che si verifica in molte linee cellulari tumorali può introdurre variabili confondenti. Per questo motivo le cellule primarie sono desiderabili, anche se ottenere una biomassa adeguata per gli studi metabolici può essere difficile. Qui dimostriamo che le piastrine umane possono essere utilizzate come piattaforma per effettuare studi metabolici in combinazione con l'analisi cromatografica liquida-spettrometria di massa tandem. Questo approccio è suscettibile di quantificazione relativa e marcatura isotopica per sondare l'attività di specifiche vie metaboliche. La disponibilità di piastrine da singoli donatori o da banche del sangue rende questo sistema modello applicabile agli studi clinici e fattibile da scalare. Qui utilizziamo piastrine isolate per confermare i cambiamenti metabolici compensatori precedentemente identificati in risposta all'inibitore del complesso I rotenone. Più specificamente, una diminuzione della glicolisi è accompagnata da un aumento dell'ossidazione degli acidi grassi per mantenere i livelli di acetil-CoA. I nostri risultati mostrano che le piastrine possono essere utilizzate come modello facilmente accessibile e rilevante dal punto di vista medico per sondare gli effetti degli xenobiotici sul metabolismo cellulare.

Introduzione

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Metabolismo mitocondriale disfunzionale è stata implicata in una vasta gamma di malattie, tra cui neurodegenerazione, il cancro, le malattie cardiovascolari e 30. Come tale, grande sforzo è stato posto sulla caratterizzazione difetti metabolici che contribuiscono alla patogenesi della malattia. Spettrometria di massa cromatografia liquida-tandem (LC-MS / MS) è considerata il gold standard per la quantificazione di analiti da matrici biologiche complesse ed è spesso impiegato per studi metabolici 8. Tuttavia, come è spesso il caso con studi biomedici, raggiungendo un modello accessibile e ben definito rilevante per la malattia umana è una sfida.

Molti studi impiegano trasformate modelli cellulari per sondare l'impatto di xenobiotici o anomalie genetiche sul metabolismo cellulare 7,9. La riprogrammazione metabolica che si verifica nelle cellule tumorali può introdurre confusione fattori di 21 e non sono quindi l'ideale. Questi problemi possono essere circumvented con modelli cellulari primarie, anche se l'ottenimento di biomassa sufficiente per le analisi del metabolismo può essere impegnativo. Inoltre, l'impatto di elevate quantità di antibiotici utilizzati in cultura è stato evidenziato come potenzialmente confondenti studi mitocondriali 16.

Piastrine umane permettersi l'opportunità di utilizzare un modello di cellula primaria con sufficiente contenuto mitocondriale per studi metabolici 5,22,27,32. Innanzitutto, le piastrine possono essere facilmente acquisite, attraverso il sangue trae da donatori individuali o in grandi volumi da banche del sangue, e quindi fornire un modello in cui fattori esterni possono essere facilmente controllati. In secondo luogo, a causa delle loro piccole dimensioni, le piastrine possono essere facilmente isolati da altri componenti del sangue con il lavoro preparatorio minima in laboratori attrezzati minimamente 5. Da segnalare, le piastrine non contengono nuclei e possono quindi essere utilizzati per studiare le alterazioni al metabolismo indipendentemente dalla regolazione trascrizionale. Qui mostriamo cheoltre alla quantificazione relativa di (CoA) tioesteri acil-coenzima A, il sistema piastrinico isolato può essere utilizzato per esaminare il metabolismo carbonio. In particolare, si segnala l'utilizzo di marcatura metabolica con isotopi stabili (non radioattivo) marcato [13 C 6] Glucosio e [13 C 16] -palmitate per sondare incorporazione della [13 C] -label nella importante acetil metabolita CoA via glicolisi o ossidazione degli acidi grassi. Questo fornisce una piattaforma potente, generalizzabile, e versatile grazie alla massiccia partecipazione di specie acil-CoA in vie biochimiche 13,24 e la trattabilità di questo sistema per testare altre variabili, come ad esempio l'inibizione del complesso con rotenone 3,33. Oltre alle informazioni fornite nel protocollo di seguito, una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per l'etichettatura degli isotopi e per le analisi LC-MS-based può essere trovato in Basu e Blair 4.

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Protocollo

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Etica Dichiarazione: Tutti i protocolli in materia di trattamento dei campioni umani seguono le linee guida del comitato di etica della ricerca human L'Università della Pennsylvania di.

1. Preparazione di buffer e 100x archivio Solutions

  1. Preparare 1 L di tampone di base di Tyrode. Unire 8,123 g di NaCl, 1.428 g NaHCO 3, 0,466 g CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCl, e 0,095 g MgCl 2. Regolare il volume totale a 1 L con DDH 2 O. Filtro sterilizzare tampone di base Tyrode.
  2. Preparare soluzioni 100x di glucosio e acido palmitico. Per 100x soluzioni di riserva di glucosio, sciogliere 100 mg di glucosio o [13 C 6]-glucosio in 1 ml di DDH 2 O. Per soluzioni palmitato 100x, sciogliere 2,56 mg di acido palmitico o 2,72 mg di [13 C 16] acido -palmitic in 1 ml di etanolo. Filtro sterilizzare 100x azionari soluzioni.
  3. Preparare Buffer proprio il caso Enriched Tyrode
    1. Per gli studi non-etichettatura, aggiungere 1 ml di 100x di soluzione di glucosio e 1 ml di 100x palmitico acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
    2. Per gli studi di etichettatura di glucosio, aggiungere 1 ml di 100x [13 C 6] Glucosio soluzione madre e 1 ml di 100x palmitico acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
    3. Per gli studi di etichettatura acido palmitico, aggiungere 1 ml di 100x di glucosio soluzione madre e 1 ml di [13 C 16] -palmitic acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
  4. Preparare soluzioni per il trattamento Rotenone
    1. Preparare una soluzione madre di 10 mm rotenone in dimetilsolfossido (DMSO).
    2. Per gli studi di dose-risposta non-etichettatura, procedere alla 1.4.3. Per gli studi di etichettatura in una singola dose, procedere alla 1.4.5.
    3. Eseguire una diluizione seriale del 10 mM rotenone magazzino in DMSO per ottenere soluzioni con concentrazioni che vanno da rotenone 1 nM a 100 micron. Questi sono 100x magazzinoS.
    4. Aggiungere 50 ml di ogni stock a 5 ml di tampone di base Tyrode + glucosio + acido palmitico da 1.3.1 per preparare le soluzioni con concentrazioni che vanno da rotenone 22:00 a 1 micron. In alternativa, aggiungere 50 ml di DMSO a servire come un controllo del veicolo. Procedere alla 2.1.
    5. Diluire il 10 soluzione madre mM 1.000 volte in DMSO per ottenere una soluzione di lavoro 10 micron.
    6. Aggiungere 50 ml di questo stock a 5 ml di tampone di base di Tyrode + [13 C 6]-glucosio + acido palmitico da 1.3.2 e la base del buffer + glucosio + [13 C 16] acido -palmitic da 1.3.3 Tyrode. La concentrazione finale è 100 nM rotenone. In alternativa, aggiungere 50 ml di DMSO a ciascun buffer per servire come comandi del veicolo.

2. Isolamento delle piastrine

Nota: Questo metodo è suscettibile di piastrine derivate da sangue intero o da sacchetti piastrine. I dati di esempio contenuti nel presente documento è stato preparatoutilizzando piastrine derivate da sacchetti piastrine. Si prega di consultare Basu et al. 5 per maggiori dettagli per quanto riguarda utilizzando piastrine isolate da sangue intero.

  1. Isolamento delle piastrine da sangue intero
    NOTA: Se isolare le piastrine da un sacchetto di piastrine, procedere alla 2.2.1.
    1. Centrifugare il sangue intero a 175 x g per 15 minuti senza freni.
    2. Trasferire 1 ml di plasma ricco di piastrine superiore (PRP) strato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
    3. Centrifugare il PRP a 400 x g per 5 min.
    4. Aspirare il surnatante e procedere al punto 3.1 o 3.2.
  2. Isolamento piastrine da una borsa di piastrine
    1. Trasferire 1 ml della sospensione di piastrine in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
    2. Centrifugare la sospensione a 400 xg per 5 min.
    3. Aspirare il surnatante e procedere al punto 3.1. o 3.2.

3. Esecuzione di un esperimento

  1. Per determinare l'effetto di xenobioticitrattamento (ad esempio, rotenone) sui livelli di un metabolita di interesse (ad esempio, acetil-CoA), procedere alla 3.1.1. Per determinare l'effetto di uno xenobiotico (ad es., Rotenone) sull'incorporazione di un precursore metabolico in un metabolita valle di interesse, procedere alla 3.2.1.
    1. Utilizzando non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere piastrinica pellet dal punto 2.1.4 o 2.2.3 in 1 ml di ciascuna soluzione dal punto 1.4.4.
    2. Incubare piastrine risospese in un incubatore CO 2 con camicia d'acqua insieme al 95% di umidità, 5% di CO 2 e 37 ° C per 1 ora. Passare al punto 4.1
      Nota: Qui si descrive un esperimento di risposta alla dose. In alternativa, un esperimento decorso potrebbe essere fatto in cui la dose è stato fissato e la lunghezza di incubazione era varia invece.
  2. Per determinare l'effetto del trattamento xenobiotico sull'incorporazione di un precursore metabolico in un metabolita valle di interesse.
    1. Ucantare non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere piastrinica pellet dal punto 2.1.4 o 2.2.3 in 1 ml di ciascuna formulazione del marcato del buffer di Tyrode dal punto 1.4.6.
    2. Incubare piastrine risospese in un incubatore CO 2 con camicia d'acqua insieme al 95% di umidità, 5% di CO 2 e 37 ° C per 1 ora. Passare al punto 4.1.

4. raffreddamento e CoA Estrazione

  1. Pellet piastrine per centrifugazione a 3.000 xg per 3 min.
  2. Aspirare il surnatante.
  3. piastrine risospendere in 750 microlitri freddo ghiaccio acido tricloroacetico 10% (w / v).
  4. Aggiungere adeguato standard interno marcati con isotopi stabili. Ad esempio, se l'obiettivo è di confrontare i livelli di specie CoA tutti i campioni, utilizzare 100 ml di una miscela di tioesteri CoA etichettati ottenuti da lieviti come descritto precedentemente stabile isotopi (tecnica SILEC) 29.
  5. Pulse-ultrasuoni ogni campione di 30 volte con impulsi di 0,5 sec.
  6. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
  7. Fissare C18 estrazione in fase solida (SPE) colonne di collettore del vuoto.
  8. Condizionare le colonne con 1 ml di metanolo.
  9. Equilibrare le colonne con 1 ml DDH 2 O.
  10. Eseguire campione derivato surnatante (circa 850 microlitri in questo caso) attraverso le colonne.
  11. Lavare le colonne con acqua 1 ml.
  12. Caricare 10 ml provette di vetro centrifuga nel collettore del vuoto per raccogliere frazione di eluizione.
  13. Eluire le colonne di 1 ml di acetato di ammonio 25 mM in metanolo.
  14. eluato secco sotto azoto.
  15. Risospendere residui secchi in 50 microlitri 5% (w / v) di acido 5-solfosalicilico e trasferire in fiale HPLC.

Setup 5. HPLC

  1. Utilizzando il software di controllo per il sistema di HPLC, creare un metodo con condizioni HPLC ottimizzate per gli analiti bersaglio e colonna utilizzata, come elencato nella Tabella 1.
    Nota: La colonna di temperature utilizzata per la produzione di questi dati era di 25 ° C ma i parametri specifici varierà per strumento e per quanto riguarda i composti di interesse. Per acil-CoA quantificazione, sono stati riportati diversi metodi di analisi LC-MS, e convalidato per i diversi analiti nelle diverse condizioni di LC 14,19,20.
  2. Lasciare che il HPLC per equilibrare adeguatamente.
    Nota: Questo dovrebbe includere sia innesco di solventi prima di collegare una colonna e equilibrazione della colonna in cominciando condizioni solvente per il metodo. Il volume di equilibrio deve seguire le indicazioni del produttore, e la conseguente effluente deve essere deviato da perdere.
    Nota: Consultare Basu e Blair 5 per maggiori dettagli per quanto riguarda le impostazioni HPLC.

Setup 6. spettrometro di massa

  1. Utilizzando il software di controllo per lo spettrometro di massa, creare un metodo mirato per la rilevazione di forme ionizzate dei composti di interesse. I parametri sono presentatiin Tabella 2.
    Nota: stabili analoghi isotopici di questi composti devono essere utilizzati per determinare se un modo positivo o negativo dà sensibilità superiore e di ottimizzare la sorgente e la condizione ottica di rilevazione. Il tempo di rilevamento totale del metodo spettrometro di massa deve corrispondere al componente temporale del metodo HPLC associato.
    Nota: Come precedentemente accennato, sono stati riportati diversi metodi di analisi acil-CoA, compresi positivi e negativi 14 ionizzazione 15 modalità e l'uso di una massa spettrometro ad alta risoluzione 17, piuttosto che uno strumento triplo quadrupolo 28.
  2. Pulire e calibrare lo strumento, stabilire uno spruzzo stabile nello spettrofotometro, e lasciare il tempo per la soluzione di taratura per dissipare adeguatamente dalla sorgente e ottica secondo le istruzioni del produttore.
  3. Impostare una sequenza per tutti i campioni con il software di controllo spettrometro di massa. include il nome o identificatori numerici e indicare il metodo di volume di iniezione e strumento appropriato. Eseguire un vuoto prima del primo campione, ed eseguire altri spazi e lavaggi tra i campioni come necessario per ridurre di riporto o di matrice effetti.
    Nota: Un metodo di lavorazione per il picco di integrazione dei cromatogrammi liquidi analiti selezionati 'spesso può essere impostata all'interno di questa sequenza o successivamente applicato nel trattamento dei dati.
  4. Iniziare la sequenza e monitorare il sistema spettrometro e HPLC di massa periodicamente per problemi tra cui variazioni di pressione o di guasti del sistema e la perdita di intensità del segnale durante la corsa.
    Nota: Gravi problemi o guasti run persistenti possono richiedere l'arresto della corsa e spurgo e ri-equilibrante del sistema HPLC così come la pulizia e la taratura dello spettrometro di massa. Consultare Basu e Blair 5 per ulteriori dettagli riguardanti le impostazioni ei dati MS trattamento.

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Risultati

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Per dimostrare l'utilità di questa metodologia abbiamo riprodotto la generalizzabilità dei precedentemente descritto adattamento metabolico compensativo esposizione al rotenone. Questo risultato è stato precedentemente identificato in modelli di coltura cellulare e questa indagine aveva lo scopo di verificare se questo cambiamento metabolico si verifica anche nelle piastrine, che sono anuclear e non incline agli stessi artefatti sperimentali come coltura cellulare. Questo lavoro è stato ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui abbiamo dimostrato l'utilità delle piastrine isolate come piattaforma per lo studio del metabolismo mitocondriale perturbato. In particolare, abbiamo caratterizzato adattamento metabolico in risposta alla inibizione del complesso I da rotenone.

Il presente studio ha esteso risultati precedentemente segnalati sul ruolo di inibizione del complesso da rotenone in linee cellulari di piastrine umane. È importante sottolineare che questo ha rivelato che la formazione delle piastrine roteno...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Noi riconosciamo il sostegno del NIH sovvenzioni P30ES013508 e T32ES019851.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-Aldrich746398
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2 * H2O)Sigma-Aldrich223506
Cloruro di potassio (KCl)Sigma-AldrichP9541
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337
glucosioSigma-AldrichG8270
13C6-glucosioSigma-Aldrich389374
Acido palmiticoCayman10006627
13C16-Acido palmiticoSigma-Aldrich605573
RotenoneSigma-AldrichR8875
Acido tricloro aceticoSigma-AldrichT6399
Acido 5-solfosalicilicoSigma-Aldrich390275
AcetonitirleFischer ScientificA996-4(optima)
Acqua (H2O)Fischer ScientificW7-4(optima)
Acido formicoFischer Scientific85171(optima)
Dimetil solfossidoSigma-Aldrich472301
EtanoloFischer Scientific04-355-222
MetanoloFischer ScientificA454-4(optima)
Acetato di ammonioFischer ScientificA639-500
2 ml Eppendorf TubesBioExpressC-3229-1
LC fiale (plastica)Waters186002640
10 ml Vetro Centrifuge TubesKimble Chase73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE)Colonne WatersWAT094225
Pastuer PipetsFischer Scientific13-678-200
NomeAziendaCatalog NumberComments
Equipment
CO2 Incubatrice con camicia d'acquaNuaireAutoFlow NU-8500
Spettrometro di massa a triplo quadripoloThermo ScientificFinnigan TSQ Quantum
HPLCThermo ScientificDionex Ultimate 3000
FonteThermo ScientificHESI II
HPLC ColonnaPhenomenexLuna C183 μ Dimensione delle particelle M, 200 mm x 2 mm

Riferimenti

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Rotenone TreatmentPlatelet IsolationStable Isotope LabelingAcetyl CoA ThioestersFatty Acid OxidationGlycolysis InhibitionComplex I Inhibitor

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