Métodos de estudio de complejos macromoleculares que contienen MRP4-en el Reglamento de Migración de fibroblastos
Summary
MRP4 regula diversos eventos de señalización de nucleótidos cíclicos dependiente incluyendo un papel recientemente dilucidado en la migración celular. Se describe un enfoque directo, pero multifacética para desentrañar las dianas moleculares aguas abajo de MRP4 que resulta en la identificación de un interactoma MRP4 único que juega un papel clave en la regulación afinado de la migración de fibroblastos.
Abstract
proteína de resistencia a múltiples fármacos 4 (MRP4) es un miembro de la familia de casete de unión a ATP de transportadores de membrana y es un transportador de eflujo endógena de nucleótidos cíclicos. Mediante la modulación de la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos, MRP4 puede regular múltiples eventos celulares dependientes de nucleótidos cíclicos-incluyendo la migración celular. Anteriormente, hemos demostrado que, en ausencia de MRP4, células de fibroblastos contienen altos niveles de nucleótidos cíclicos intracelulares y pueden migrar más rápido. Para comprender los mecanismos subyacentes de este hallazgo, hemos adoptado un enfoque directo aún multifacético. En primer lugar, hemos aislado posibles complejos de proteínas que interactúan en MRP4 de un sistema de pila de MRP4 sobreexpresión mediante inmunoprecipitación seguida de espectrometría de masas. Después de la identificación de proteínas únicas en el interactoma MRP4, hemos utilizado Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para explorar el papel de estas interacciones proteína-proteína en el contexto de la transducción de señales. Hemos dilucidado la popapel poten- del complejo proteína MRP4 en la migración celular e identificado F-actina como un importante mediador del efecto de MRP4 sobre la migración celular. Este estudio también ha destacado el papel de cAMP y cGMP como actores clave en los fenómenos migratorios. El uso de microscopía de alto contenido, se realizaron ensayos de migración celular y observamos que el efecto de MRP4 sobre la migración de fibroblastos está completamente abolida por la interrupción del citoesqueleto de actina o la inhibición de la quinasa dependiente de cAMP A (PKA). Para visualizar las modulaciones de señalización en una celda de la migración en tiempo real, se utilizó un sensor basado en FRET para medir la actividad de PKA y encontramos, la presencia de la actividad de PKA más polarizada cerca del borde de ataque de la migración MRP4 – / – fibroblastos, en comparación con MRP4 + / + fibroblastos. Esto a su vez aumenta la formación de actina cortical y aumenta el proceso de migración. Nuestro enfoque permite la identificación de las proteínas que actúan aguas abajo de MRP4 y nos proporciona un excesovista del mecanismo implicado en la regulación MRP4 dependiente de la migración de fibroblastos.
Introduction
La migración celular es un proceso de múltiples pasos complicado. Los estudios han demostrado que las células durante la migración se polarizó en los bordes de ataque y salida. Al adherirse a la matriz extracelular, el borde de ataque proporciona la tracción necesaria para el cuerpo de la célula se mueva hacia adelante. Por último, las liberaciones se arrastran los bordes traseros adjuntos y completa el ciclo de migración 1,2.
polarización de las células para la migración celular eficiente está regulada por la segregación espacial de señalización intracelular. Segundos mensajeros celulares, tales como cAMP, median en la compartimentación de los eventos de señalización requeridos para la migración celular 3,4 direccional afinado. Acumulaciones preferenciales de cAMP y la actividad de PKA quinasa dependiente de cAMP en el borde delantero desempeñan un papel clave en la migración celular direccional de 5,6. Mediante la fosforilación de las pequeñas GTPasas como sustrato relacionada con Ras toxina botulínica C3 (Rac) y el control de la división celular de proteínas 42 homólogo o Cdc42, PKA activa la proteína actina relacionadas con 2/3 (Arp 2/3) en el borde delantero e induce la formación de lamelipodia 7-9. PKA también fosforila un agente anti-nivelación, vasodilatador estimulada fosfoproteína (VASP), de ese modo regula los ciclos de oscilación de extensión y retracción de la membrana 10,11.
En las células, los niveles de cAMP están regulados por tres procesos principales: i) la síntesis de la adenilato ciclasa, ii) la degradación por fosfodiesterasas, y iii) el transporte por transportadores de salida unidos a la membrana 3. proteína de resistencia a múltiples fármacos 4 (MRP4), un miembro de la ATP vinculante cassette (ABC) de la familia de transportadores de membrana, funciona como un transportador de eflujo endógena de nucleótidos cíclicos. Por lo tanto, MRP4 puede regular los niveles intracelulares de cAMP y dependiente de cAMP celular de señalización 11-13. Hemos demostrado previamente que en MRP4 – / -, los fibroblastos contienen niveles relativamente altos de nucleótidos cíclicos y migran más rápido compared a MRP4 fibroblastos + / + 14. También informó de un efecto bifásico de nucleótidos cíclicos sobre la migración de fibroblastos. Sobre la base de estudios previos y nuestra conclusión de que MRP4 – / – fibroblastos contiene cAMP más polarizada durante el transcurso de la migración, la hipótesis de que esta regulación MRP4 mediada por la migración de fibroblastos es dependiente de cAMP. Con el fin de comprender el mecanismo aguas abajo, tomamos un enfoque directo aún multifacético.
Para identificar las proteínas asociadas y en interacción con MRP4, immunoprecipitated complejos macromoleculares que contienen MRP4-a partir de células HEK293 que expresan más de MRP4. El uso de la espectrometría de masa, se identificaron varias proteínas que interaccionan con MRP4 y analizamos su interconectividad usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA es una herramienta útil para analizar las interacciones proteína-proteína (tanto estructurales como funcionales) y explorar sus aportaciones en particular, fisiológicos y patológicoseventos basados en la literatura y las evidencias experimentales 15,16. IPA indicó que F-actina es un importante objetivo aguas abajo de MRP4 en el contexto de la migración de células, donde cAMP y cGMP son la clave moléculas 17 de señalización. Estos datos fueron confirmados además por microscopía de alta contenido. Microscopía de alta contenido puede capturar y analizar los comportamientos celulares tales como la migración celular de una manera más conveniente, precisa y de alto rendimiento 18. Los datos de alto contenido de microscopía demostraron que el efecto de MRP4 sobre la migración de fibroblastos está completamente abolida en la interrupción del citoesqueleto de actina o la inhibición de PKA 17.
Además, se utilizó una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a base de sensor de PKA para controlar la dinámica de PKA en la migración de las células en tiempo real. Sensores de quinasa basados en FRET por lo general consisten en péptidos sustrato de fosforilación específicos flanqueadas por PPC y YFP fluoróforos 19-21. pmAKAR3 es una mejora y membrane dirigido sensor PKA basados en FRET que contiene dominio forkhead-asociado 1 (FHA1) y la secuencia de sustrato de PKA LRRATLVD 5,22. La fosforilación de pmAKAR3 por el pKa aumenta subunidad catalítica FRET señal entre CFP y YFP 19. La inserción de un dominio de modificación de lípidos en el sensor se dirige a la membrana plasmática para el control de la dinámica de PKA, específicamente en el compartimento de membrana 23.
Usando pmAKAR3, hemos demostrado que el borde delantero de la migración MRP4 – / – fibroblastos mostraron actividad PKA más polarizada que MRP4 fibroblastos + / +, que a su vez incrementó la formación de actina cortical en borde de ataque de la célula 17. En conjunto, estos eventos resultó en una mejor polarización celular y la migración celular más rápido direccional en ausencia de MRP4. Nuestro enfoque específico y directo identificado abajo objetivos clave para MRP4 y proporciona una importante, pero comoaún sin explorar del mecanismo para la regulación MRP4 dependiente de la migración de fibroblastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
Riferimenti
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