Qui, descriviamo un metodo di microscopia time-lapse a lungo termine per tracciare longitudinalmente singole cellule in risposta a terapie antitumorali.
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Articolo metodologico
Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro
In questo articolo
Sommario
Abstract
La risposta di singole cellule di farmaci anti-cancro contribuiscono a determinare la risposta della popolazione, e quindi è un importante fattore nel risultato complessivo. Immunoblotting, citometria a flusso e esperimenti sulle cellule fisse sono spesso utilizzati per studiare come le cellule rispondono ai farmaci anti-cancro. Questi metodi sono importanti, ma hanno diversi difetti. La variabilità della risposta ai farmaci tra il cancro e cellule normali, e tra le cellule di origine diversa cancro, e transitori e le risposte rare sono difficili da capire usando saggi popolazione calcolo della media e senza essere in grado di monitorare direttamente e analizzarli in senso longitudinale. Il microscopio è particolarmente adatto a cellule vive di immagine. Gli avanzamenti nella tecnologia ci permettono di ordinariamente celle di immagine con una risoluzione che consente non solo di inseguimento cellulare, ma anche l'osservazione di una varietà di risposte cellulari. Descriviamo un approccio in dettaglio che permette di imaging continuo time-lapse dicellule durante la risposta ai farmaci essenzialmente per il tempo desiderato, in genere fino a 96 ore. Utilizzando varianti dell'approccio, le cellule possono essere monitorati per settimane. Con l'impiego di organismi geneticamente codificati biosensori fluorescenti processi numerosi, i percorsi e le risposte possono essere seguite. Mostriamo esempi che includono il monitoraggio e la quantificazione della crescita cellulare e la progressione del ciclo cellulare, la dinamica dei cromosomi, danni al DNA, e la morte cellulare. Discuteremo anche le variazioni della tecnica e la sua flessibilità, e mettere in evidenza alcuni problemi comuni.
Introduzione
microscopia Live-cell e il monitoraggio longitudinale di singole cellule, non è una nuova tecnica. Fin dai primi microscopi, gli appassionati e gli scienziati hanno osservato e studiato singole cellule e organismi, i loro comportamenti, e lo sviluppo 1-3. Un esempio famoso della fine del David Rogers alla Vanderbilt University nel 1950 mostra un neutrofili umano in uno striscio di sangue a caccia di un batterio Staphylococcus aureus e, infine, il processo di fagocitosi 4. Questo film live-cell è un eccellente esempio di come i processi multipli possono essere osservati e correlati in un singolo esperimento: rilevamento di un gradiente d....
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Protocollo
Il seguente protocollo utilizza parametri definiti dagli esperimenti nelle figure 4 e 6 impostazioni di acquisizione relative e delle condizioni sperimentali. Molti di questi parametri possono essere modificati per adattarsi altri esperimenti (ad esempio, i tempi di esposizione, categorizzazione, canali fluorescenti, ecc.). Tutte le procedure devono rispettare le linee guida e regolamenti istituzionali ed essere approvati dal comitato di biosicurezza istituzionale. siti web produttore microscopio contengono informazioni eccellente per l'imaging cellulare dal vivo.
1. microscopi e softw....
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Risultati
A lungo termine time-lapse microscopia e di monitoraggio longitudinale diretta consente per lo studio di molti effetti anti-cancro durante la risposta ai farmaci. Seguendo lo schema generale della figura 1, più esempi di cellule sono mostrati esprimere reporter fluorescenti convalidati trattata con farmaci antitumorali, cingolati e analizzati utilizzando approcci diversi.
Fase microscopio a contrasto da solo è.......
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Discussione
Vantaggi di Microscopia time-lapse e monitoraggio longitudinale
Il microscopio è uno strumento ideale per gli studi longitudinali di risposta ai farmaci in quanto consente ai ricercatori di monitorare le singole cellule e il loro destino, nonché l'intera popolazione. La variabilità della risposta ai farmaci all'interno di una popolazione di cellule è una questione importante per l'anti-cancro disegno terapeutico. monitoraggio longitudinale di singole cellule perm.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Joshua Marcus per il supporto tecnico e Jolien Tyler, Ph.D., Direttore del Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, per la consulenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dell'Università del Colorado Boulder e dell'Università del Colorado Boulder Graduate School a J.D.O. R.T.B. è parzialmente supportato da una borsa di formazione pre-dottorato del NIH (T32 GM008759). Ringraziamo Karyopharm Therapeutics, Inc. per selinexor e Merck Serono per l'inibitore della chinesina-5. I plasmidi FUCCI provengono da Atsushi Miyawaki (RIKEN, Giappone) tramite MTA. mCherry-BP1-2 proveniva da Addgene. HeLa che esprime H2b-mCherry e β-tubulina-EGFP pr....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | farmaco stabilizzante dei microtubuli |
| Etoposide | Selleckchem | S1225 | inibitore della topoisomerasi II |
| Selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | inibitore XPO1/CRM1, regalo |
| Inibitore della chinesina-5 | Merck Serono | na | regalo, disponibile anche da American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| Terreno di coltura cellulare | HyClone (Fisher) o Mediatech | molte aziende disponibili | |
| 5% CO2/bilancia aria, certificato | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35 mm Piatto, 20 mm fondo di vetro | Cellvis | D35-20-1.5-N | molte aziende disponibili |
| 35 mm 4 pozzetti Piatto, 20 mm fondo di vetro | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | molte aziende disponibili |
| Piatto da 35 mm, fondo in vetro grigliato | MatTek | P35G-2-14-CGRD | molte aziende disponibili |
| Multi-pozzetto, fondo in vetro | Cellvis | P12-1.5H-N | molte aziende disponibili |
| Microscopio a epifluorescenza invertito Olympus IX81 | Controller Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III tavolino motorizzato | Prio Scientific | H117 | |
| STEV camera | InVivo Scientific | STEV. ECU. HC5 STAGE TOP | |
| Unità di controllo ambientale | InVivo Scientific | STEV. ECU. HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD con controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon Nikon | ||
| lancio laser Nikon | |||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT CAMERA DI ASSOCIAZIONE | TOKAI HIT | TIZSH |
Riferimenti
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Obser....
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Ristampe e permessi
