Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

microscopia Live-cell e il monitoraggio longitudinale di singole cellule, non è una nuova tecnica. Fin dai primi microscopi, gli appassionati e gli scienziati hanno osservato e studiato singole cellule e organismi, i loro comportamenti, e lo sviluppo ^1-3. Un esempio famoso della fine del David Rogers alla Vanderbilt University nel 1950 mostra un neutrofili umano in uno striscio di sangue a caccia di un batterio Staphylococcus aureus e, infine, il processo di fagocitosi ^4. Questo film live-cell è un eccellente esempio di come i processi multipli possono essere osservati e correlati in un singolo esperimento: rilevamento di un gradiente di chimica, la meccanica e la velocità della motilità cellulare, cellule forme dinamiche, l'adesione e la fagocitosi di un agente patogeno.

L'avvento di microscopi completamente automatizzati e fotocamere digitali ad alta sensibilità ha portato ad un crescente numero di ricercatori che utilizzano la microscopia di porre domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule che vanno from come le cellule si muovono ^5,6 e ^7,8 per dividono organelli dinamica e traffico di membrana ^9-11. Non fluorescente, in campo chiaro microscopia, tra cui contrasto di fase (PC), che ha ottenuto il premio Nobel per Frits Zernike nel 1953, e il contrasto di interferenza differenziale (DIC) consentire l'osservazione di cellule e nuclei ma anche strutture sub-cellulari, tra cui fasci microtubuli , cromosomi, nucleoli, dinamica organelli, e fibre di actina spessore ^12. Geneticamente codificato proteine ​​fluorescenti e lo sviluppo di coloranti fluorescenti contro organelli hanno notevolmente influenzato time-lapse microscopia a ^13-15. Pur non essendo il focus di questo articolo, l'imaging in sferoidi di cellule e in situ (microscopia intravitale) utilizzando la microscopia confocale e multiphoton rappresentano un'altra espansione dell'approccio, e non ci sono articoli in sospeso che usano e trattano questi approcci ^16-19.

Le risposte delle cellule di anti-cancfarmaci er o prodotti naturali sono determinate sulla scala molecolare e cellulare. Comprensione delle risposte cellulari e sorti in seguito al trattamento spesso comporta saggi popolazione della media (ad es., Immunoblotting, misure e integrali), o il tempo-punti fissi con il rilevamento di immunofluorescenza e citometria a flusso, che misurano singole cellule. L'eterogeneità nelle risposte delle cellule singole a farmaci all'interno di una popolazione, in particolare nei tumori, può spiegare alcune delle variabilità nella risposta visto attraverso le linee cellulari e tumori che vengono trattati con lo stesso farmaco a saturazione. A lungo termine approcci longitudinali seguire una determinata cella singola o di una popolazione di cellule è un approccio meno comune ma molto potente che consente lo studio diretto di percorsi risposta molecolare, diversi fenotipi (ad es., Morte cellulare o divisione cellulare), osservazione cella-a-cella di variabilità all'interno di una popolazione, e come questi fattori contribuiscono alla dinamica di risposta della popolazione ^20-22. Ottimisticamente, essendo in gradodi osservare e quantificare le risposte delle cellule singole contribuirà a migliorare la nostra comprensione di come funzionano le droghe, il motivo per cui a volte falliscono, e come li utilizzano al meglio.

La tecnica di lungo termine microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale, e l'analisi delle risposte farmaco è disponibile per molti ricercatori e può essere semplice, utilizzando solo la luce trasmessa per osservare le risposte fenotipo ^20,21. I componenti principali del metodo sono: la corretta preparazione delle cellule di interesse, un microscopio automatizzato con camera ambientale, una fotocamera integrata con un computer per acquisire e memorizzare le immagini, e il software di rivedere il time-lapse e misurare e analizzare le cellule e qualsiasi biosensori fluorescenti. Forniamo un protocollo dettagliato con molti suggerimenti per lo svolgimento di time-lapse microscopia di cellule in coltura per tutto il tempo diversi giorni con campo chiaro e / o la microscopia epifluorescente widefield. Questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi linea cellulare che può essere coltivata in colturaper studiare le loro risposte alle terapie anti-cancro. Forniamo esempi di dati acquisiti e analizzati utilizzando più biosensori fluorescenti geneticamente codificati diversi e un esempio di microscopio a contrasto di fase, discutere brevemente i diversi tipi di sonde, i vantaggi e gli svantaggi di lungo termine time-lapse e il monitoraggio longitudinale, ciò che può essere imparato a questo approccio che è difficile da capire da approcci non-diretti, e alcune variazioni che speriamo essere di interesse e valore per i ricercatori inesperti che non hanno pensato di utilizzare l'approccio, e di ricercatori esperti.

Il seguente protocollo utilizza parametri definiti dagli esperimenti nelle figure 4 e 6 impostazioni di acquisizione relative e delle condizioni sperimentali. Molti di questi parametri possono essere modificati per adattarsi altri esperimenti (ad esempio, i tempi di esposizione, categorizzazione, canali fluorescenti, ecc.). Tutte le procedure devono rispettare le linee guida e regolamenti istituzionali ed essere approvati dal comitato di biosicurezza istituzionale. siti web produttore microscopio contengono informazioni eccellente per l'imaging cellulare dal vivo.

1. microscopi e software di imaging

1. Eseguire l'imaging cellulare dal vivo su una vasta gamma di microscopi invertiti. I microscopi più comuni sono widefield epifluorescenza e confocale spinning-disco. Qui, usare un microscopio automatico e motorizzato widefield epifluorescenza con sorgente luminosa a ioduri metallici da 200 watt.
2. Ottenere uno stadio-top o un microscopio camera ambientale. Qui, usare uno stadio-top camera ambientale.
3. Utilizzare il software commerciale per operare microscopi con utility per eseguire la microscopia time-lapse.
4. Utilizzare software disponibile in commercio o ImageJ per l'analisi delle immagini. Molti altri strumenti di analisi sono disponibili in commercio, e ci sono programmi su misura, molti dei quali sono stati pubblicati ^8,18.

2. Visualizzare i processi cellulari e fenotipici Risposte

1. Visualizza le cellule con la microscopia in campo chiaro. Differenziale contrasto interferenziale contrasto di fase e solo può essere molto informativo per studiare le risposte alle risposte farmaco anti-cancro. Questi processi possono includere la mitosi, la motilità cellulare e apoptosi.
2. Visualizza strutture cellulari, organelli ei processi con biosensori fluorescenti. sonde fluorescenti sono informativi nel monitoraggio dei processi subcellulare specifici. Questi possono includere dinamica dei microtubuli, mitocondriale e le dinamiche reticolo endoplasmatico, l'accumulo di proteine ​​e localizzazione, esegnali molecolari (ad es., fosforilazione, calcio).

3. Preparazione di campioni

1. Crescere le cellule in piatti certificati di coltura cellulare in uno standard, coltura cellulare umidificata incubatore (ad esempio, 37 ^° C, 5% di CO _2, 80% di umidità relativa).
   1. Crescere le cellule HT1080 in MEM con EBSS. Integrare la media con il 10% v / v FBS, 1% v / v pen / strep, 1% v / v di sodio piruvato e 1% v / v aminoacidi non essenziali.
2. Due giorni prima di imaging, le cellule piastra 50.000 HT1080 Fucci in 3 pozzetti di una 12-pozzetti # 1.5 vetro piatto fondo in una cappa a flusso laminare sterile certificata. Regolare il numero di cellule piastrate per raggiungere ~ 60% di confluenza per l'inizio dell'esperimento. A seconda della linea cellulare e la natura dell'esperimento densità cellulare può essere inferiore.
   Nota: Densità cellulare può avere una profonda influenza sulla crescita della linea cellulare e sui risultati sperimentali. Contare le celle per ridurre al minimo esperimento-to-esperimento variability a causa della densità.
   1. A seconda della camera ambientale e le condizioni necessarie per l'esperimento, le cellule piastra in singoli piatti e (di solito 35- o 60-mm), 4 e 35 mm piatti, 6-, piastre di coltura cellulare a 12 o 24 pozzetti, o coprivetrino per diapositive in vari formati. Usare piatti con fondo di vetro con # 1.5 vetro come la maggior parte delle lenti dell'obiettivo sono ottimizzati per questo spessore del vetro, e immagini attraverso plastica coltura cellulare è molto povera.
      Nota: Alcune linee di cellule non crescono e sopravvivono su vetro. In questi casi, il vetro può essere rivestito per migliorare l'aderenza delle cellule (ad es., Poli-lisina o collagene). Alcune aziende producono ottica di plastica coltura cellulare, occorre determinare empiricamente se questa è una valida opzione.

4. Camera ambientale Set-up

1. Prima di qualsiasi sperimentazione, set-up la camera ambientale in modo che funziona a ~ 80% di umidità e quindi la temperatura nella posizione del campione è 37 ^° C. Cellule più coltivate crescono in atmosfera al 5% di aria CO ₂ / saldo al tampone bicarbonato di sodio in mezzo. A seconda del set-up, impostare il controller ambientale al 5% di CO ₂ e si mescolare 100% CO ₂ con l'aria, o utilizzare premiscelato, certificata 5% di CO ₂ / bilancio dei gas dell'aria. Seguire le istruzioni del produttore per il gas portate.
   Nota: Alcune linee di cellule crescono in CO ₂ media -indipendente nel qual caso essi possono essere mantenuti senza CO _2. supporti di imaging Specificamente progettato è inoltre disponibile che limita l'aggiunta di composti autofluorescenti. La crescita in tesi mezzi per il tipo cellulare desiderato deve essere determinato empiricamente in anticipo.
2. Prima di imaging, garantire il serbatoio è pieno (seguendo le indicazioni del produttore) con acqua distillata sterile. Accendere la camera ambientale per l'impostazione della temperatura desiderata e posizionarlo nella inserto palco microscopio. Per salvare il gas, non avviare il flusso, a questo punto.
   Nota: Se c'è qualche spazio libero tra la camera di fase-top e la fase incasso e / o di qualsiasi tensione sui cavi di collegamento alla camera si può introdurre artefatti da movimento nella esperimento.
   1. Lay pezzi di pellicola di paraffina sui bordi dell'apertura inserto palco prima di inserire la camera in esso per paio camera al palco, e assicurarsi che nessuna connessione stanno tirando sulla camera.
3. Lasciare che la camera di equilibrare a 37 ^° C. Mantenere una temperatura stabile per evitare fluttuazioni di temperatura durante l'imaging che può influenzare la fisiologia cellulare e introdurre deriva. Raggiungendo equilibrazione temperatura richiede tipicamente 30 min a 1 ora, a seconda dell'ambiente.
   1. Inserire un piatto di 'manichino' con l'acqua nei pozzi nella camera durante il riscaldamento. Un piatto di imaging riempito con acqua imita il campione, contribuendo a garantire la camera è sufficientemente riscaldato e stabilizzata. Riempire la camera con acqua sterile pre-riscaldatoriduce il tempo necessario alla stabilizzazione della temperatura e minimizza la diminuzione di temperatura dopo l'aggiunta del campione sperimentale.

5. Microscopio Set-up

1. Accendere il microscopio, computer associato, ed eventuali periferiche necessarie.
   1. A seconda della sorgente di luce, l'ora di accenderlo fino al momento dell'uso (es., LED).
2. Con la torretta obiettivo in una posizione bassa, seleziona l'obiettivo 20X 0,7 NA da utilizzare.
3. Posizionare il campione rispetto all'obiettivo - questo renderà più facile trovare le cellule in cui il campione è nella camera.
4. Definire i parametri di imaging in questo momento se essi sono noti da precedenti esperimenti.

6. Il trasporto di cellule al microscopio e nella Camera

1. Il trasporto le cellule per essere ripreso dal termostato per la camera ambientale. Assicurarsi che questo è fatto rapidamente per limitare gli effetti di un relativamente basso di CO ₂
2. Collocare le cellule in un contenitore sigillato polistirolo o sacchetto isolato per evitare grandi cambiamenti ambientali.

Inserire il piatto di imaging campione nella camera seguendo le indicazioni del produttore.

Dopo che le cellule sono stati fissati all'interno della camera ambientale, sigillare la camera per mantenere un ambiente stabile e girare immediatamente sulla fonte (s) di gas atmosferici.

1. Poiché alcune camere ambientali non utilizzano un coperchio stretto, sigillato, per ritardare l'evaporazione, strato sterile, olio minerale embrione certificata sopra del mezzo di crescita. Avvolgere pellicola di paraffina gas permeanti intorno ai perimetrali-bordi del piatto del campione facendo attenzione a non ostacolare l'area di esposizione di vetro. Localizzato, metodi di umidificazione secondari possono essere impiegati. Condensa sul coperchio del piatto del campione può diminuire perforMance della microscopia in campo chiaro.

Al fine di minimizzare gli effetti della deriva termica precoce durante l'esperimento, attendere 30 minuti prima di iniziare il time-lapse. Il tempo necessario varia in base alle dimensioni piatto di imaging e di altri fattori. Determinare empiricamente.

7. Impostazione del Imaging

1. Selezionare le condizioni di imaging che meglio rappresentano i dati. Prendere precauzioni per evitare la fototossicità, limitando i tempi di esposizione, utilizzando la luce minore intensità e selezionando le sonde che vengono eccitati da lunghezze d'onda della luce.
2. Definire x, y, z-aereo e desiderata lunghezza d'onda (s) per ciascuna posizione da acquisire. La risoluzione temporale è limitata dal numero di posizioni e lunghezze d'onda. Per lungo termine time-lapse della maggior parte dei processi cellulari, acquisire un'immagine ogni 10 - 20 min; risoluzione temporale superiore (brevi intervalli, per esempio., 1 min) fornisce più punti di dati e quindi più robusto di monitoraggio delle cellule, ma anche i risultati in più integrataesposizione alla luce e set di dati più grandi.
   1. Come HT1080 FUCCI hanno proteine ​​fluorescenti verde e rosso dinamici (vedi Rappresentante dei risultati), utilizzare i seguenti tempi di esposizione: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, campo chiaro - 20 msec. Utilizzare un bidone 2 x 2.
3. Attivare il software messa a fuoco automatica a controllo utilizzando i parametri predefiniti in Impostazioni avanzate. Definire un area di lettura di 10 micron con la dimensione del passo consigliato. Essere sicuri di fare questo prima di iniziare il time-lapse. Autofocus con immagini campo chiaro e mai con fluorescenza per ridurre fototossicità e photobleaching.
   1. Utilizzare sistemi di autofocus software controllato su qualsiasi microscopio con un palco motorizzato, e mettere a fuoco direttamente sul campione. Tuttavia, possono limitare la velocità di acquisizione dell'esperimento. Hardware controllato i sistemi di messa a fuoco in continuo funzionano bene per la microscopia time-lapse e migliorare la velocità, consentendo un più posizioni per essere ripreso o un più alto tasso di acquisizione. Tuttavia, essiaffidarsi al rilevamento di all'interfaccia aria-vetro e può perdere la concentrazione del campione con variazioni di spessore del vetro attraverso il pozzo.
4. Sostituire la metà dei mezzi di comunicazione con i media che contiene la concentrazione di farmaco desiderato che è stato riscaldato a 37 ^° C. sostituzione dei supporti parziale aiuta a ridurre la deriva termica. Le condizioni di questo esperimento sono veicolo (DMSO), 1 micron selinexor e 10 micron PD0332991.
   Nota: Questo passaggio può essere fatto anche dopo l'avvio l'acquisizione mettendo in pausa e riavviare l'esperimento. Questo permette il monitoraggio longitudinale delle risposte pre e post-farmaco di singole cellule. Se la stabilità della droga o il metabolismo è una preoccupazione, fermandosi e sostituzione dei supporti può essere fatto con lo stesso metodo. Per eseguire il test per la degradazione di droga o il metabolismo, i media da cellule trattate possono anche essere collocati sulle cellule naive per testare azione dei farmaci.
5. Avviare il time-lapse.
6. Come il time-lapse corre, in modo che i campi imaged rimangono a fuoco e l'ChambeR mantiene un umido 37 ^° C.
   1. Regolare la messa a fuoco in base alle esigenze mettendo in pausa l'acquisizione durante l'intervallo di tempo tra i punti di tempo.
7. Se necessario, aggiungere acqua alla camera durante gli esperimenti più lunghi. Evitare di raffreddare la camera con l'aggiunta di pre-riscaldato, acqua distillata sterile a 37 ^° C.

8. Terminare la Time-lapse

1. Quando l'esperimento è stato eseguito fino al completamento, fermare l'acquisizione se non è stato impostato per interrompere automaticamente.
2. Assicurarsi che il time-lapse è stato salvato correttamente sul disco rigido, anche se la maggior parte dei pacchetti software salva automaticamente durante l'acquisizione, se non finito correttamente i dati possono essere persi.
3. Rimuovere la camera dal microscopio e smaltire le cellule in rifiuti a rischio biologico seguendo le procedure di biosicurezza istituzionale approvate.

9. longitudinale di monitoraggio e analisi dei dati Time-lapse

1. Scegliere la metodologia di analisi che èappropriato per i processi biologici di interesse. Molti plugin per ImageJ, programmi utilizzando Matlab, e le piattaforme su misura sono stati prodotti per applicazioni specifiche. Il seguente metodologia copre inseguimento di nuclei e analisi di sonde fluorescenti nucleari come dimostrato nelle figure 4 e 5.
2. Aprire le pile di immagini .tif per i canali utilizzati in ImageJ. In alternativa, aprire i file nativi del programma di acquisizione direttamente in ImageJ utilizzando il plugin Bioformats.
3. Disegnare una regione di interesse (ROI) all'interno del nucleo di una cellula utilizzando l'immagine campo chiaro o il canale etichetta nucleare (se utilizzato) e aggiungerlo al gestore ROI. Nota: Se le cellule imaged hanno un'etichetta nucleari (ad esempio, istone H2B-EGFP.), Quindi il monitoraggio delle cellule automatica può essere utilizzata per creare regioni di interesse (ROI) che rappresenta i singoli nuclei attraverso il tempo.
4. Passare al successivo punto di tempo e posizionare la ROI all'interno della stessa nucleuS. Aggiungere il ROI al gestore ROI.
5. Continuare a monitorare e rendere ROI per la singola cella fino a quando c'è un evento cellulare (mitosi, apoptosi, ecc.) O la cellula non può più essere rintracciato (es., Si muove fuori cornice o termine dell'esperimento).
6. Quando ROI sono state stabilite per cellule attraverso il tempo che sono nel campo, sovrapporle sui canali fluorescenti di interesse. Misurare l'intensità media della fluorescenza in ciascun canale per ogni punto di tempo. Salvare l'elenco ROI per un uso successivo.
   1. Varie misurazioni possono essere effettuate entro il ROI per applicazioni in diversi esperimenti. Clicca Analisi → Imposta Misure ... per far apparire un menu per scegliere il metodo analitico (ad es., Intensità media all'interno del ROI, intensità integrata, ecc.).
7. Nota destino di singole celle (ad es., L'apoptosi, la divisione, sopravvivenza) tenendo traccia. Ciò consente la creazione di curve di sopravvivenza e furtheanalisi R popolazione.
8. Con l'intensità media per entrambi i canali, creare un diagramma a dispersione per visualizzare dinamiche del ciclo cellulare in risposta terapeutica (Figura 5B, C).
   Nota: trame possono essere creati per singole celle nel tempo o mediate su una popolazione di cellule cingolati. imaging quantitativo può essere fondamentale per la creazione di risposte complesse e relazioni di cellule in risposta a terapie contro il cancro. A lungo termine la microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale e l'analisi dei dati è un processo multi-step, con molte opzioni per il tipo di strumenti di microscopia ed analisi, e segue lo schema generale di figura 1.

A lungo termine time-lapse microscopia e di monitoraggio longitudinale diretta consente per lo studio di molti effetti anti-cancro durante la risposta ai farmaci. Seguendo lo schema generale della figura 1, più esempi di cellule sono mostrati esprimere reporter fluorescenti convalidati trattata con farmaci antitumorali, cingolati e analizzati utilizzando approcci diversi.

Fase microscopio a contrasto da solo è molto istruttivo e robusto rapporti sul interfase contro la mitosi, la durata mitotico e l'arresto, la divisione cellulare anormale, e la morte cellulare 21,23,24. I farmaci che hanno come target la divisione cellulare, i farmaci anti-mitotico spesso definito, continuano ad essere sviluppato. Figura 2 e Video 1 e 2 mostrano esempi di un paio di linee di cellule MCF7 abbinate da tumore della mammella-derivati ​​che differiscono solo per il loro stato di p53, trattati con 500 nM di un tipo di farmaco anti-cancro che obiettivie inibisce la proteina del motore mitotico, Kinesin-5 (KSP1, Kif11, Eg5), con conseguente mitosi protratta 20. Cellule wild MCF7 tipo (Figura 2A) sono un paradigma per lo studio p53-dipendente arresto del ciclo cellulare 25-27. Cellule wild type entrano mitosi, rimangono per diverse ore, poi lascia e in gran parte arresto con l'induzione di p53 25. Quando p53 è rimosso dal knockdown p53 stabile (MCF7 sh p53), invece di arrestare dopo che lasciano mitosi, le cellule passano attraverso cicli ripetuti (Figura 2B). Le cellule sono stati monitorati manualmente e l'indice mitotico e la percentuale di cellule che entrano in un secondo mitosi stati segnati (Figura 2C, D). Osserviamo che la cellula p53 sh rintracciato divide quando si entra in un secondo round di mitosi, piuttosto che arrestare e lasciando mitosi senza divisione. Sebbene non illustrato la durata degli eventi mitotici, tempo tra mitosi successive, cento di divisioni cellulari ed eventi di morte cellulare associati può anche essere sanimato 20,21.

I taxani, per esempio paclitaxel e docetaxel, sono la chemioterapia comune per molti tipi di cancro, compresi quelli che sono difficili da trattare come il seno al pancreas e avanzato. Paclitaxel lega alla dinamica plus-end di microtubuli e li stabilizza, impedendo loro normale funzione. Paclitaxel ha notato effetti dose-dipendenti, e anche a basse concentrazioni può perturbare il normale progressione mitotico e la segregazione cromosoma 16. Segregazione fedele di cromosomi è essenziale per il normale proliferazione cellulare e quando anormali possono provocare aneuploidia che possono innescare l'arresto del ciclo cellulare, ma anche agire come un driver di progressione del cancro. Figura 3 e film 3 mostra cervicali cellule HeLa carcinoma derivate esprimono stabilmente la cromatina marcatore istone-2b fuso al mCherry e beta-tubulina fusa EGFP (non mostrato) in mezzo di crescita normale trattato con 1 nM paclitaxel. In questoad esempio, l'ingresso e la progressione attraverso la mitosi può essere seguito. I tempi di mitosi appare normale in questa cella, però l'allineamento dei cromosomi e la segregazione non è, con conseguente rigonfiamenti nucleari e micronuclei, che sono strutture che indicano scarsa segregazione dei cromosomi. Micronuclei sono inclini a danni al DNA e cromotripsi, che è la frammentazione su larga scala di cromosomi o cromatina - questo ha importanti implicazioni per l'evoluzione del tumore 28,29. Anche se non è mostrato qui, l'origine dei micronuclei in relazione ad altre strutture mitotici e il destino di queste cellule può essere direttamente monitorati tramite a lungo termine time-lapse. Inoltre, un marker cromatina espressa con un giornalista danni al DNA potrebbe essere utilizzato per stabilire la relazione tra la segregazione dei cromosomi, micronuclei e danni al DNA.

reporter fluorescenti consentono di processi cellulari enumerabili di tenere traccia e nuovi giornalisti sono continuamente in fase di sviluppo. per exampio, il ciclo cellulare è costituito da fasi che sono di particolare interesse per lo sviluppo mirato terapie anti-cancro. Figura 4 e Movie 4 mostra una linea cellulare fibrosarcoma-derivato (HT1080) che stabilmente co-esprime due giornalisti chiamati, gli indicatori del ciclo cellulare ubiquitina fluorescente (FUCCI) 30. Nel sistema qui, una porzione del polipeptide CDT1 è fuso mKO2 (monomerico Kusabira arancione 2) ed aumenta in G1-fase e viene degradato all'inizio della fase S, ed una porzione di Geminin è fuso MAG (monomerica Azami verde) e aumenti di mid-S-fase e viene degradato su anaphase. Questa cella è normale mezzo di crescita e progredisce attraverso il ciclo cellulare in 15 ore. Figura 5A, B e Movie 5 mostrano le stesse cellule in terreno normale trattati con 10 PD0332991 micron, un Cdk4 / 6 inibitore. Le cellule progrediscono G2-fase e dividono normalmente, e arrestano fortemente nella successiva fase G1, indicando la possibilità di effettoive effetti citostatici nei tumori in crescita. La figura 5C, D e Movie 6 mostrano le stesse cellule in terreno normale trattato con una piccola molecola chiamata selinexor (KPT-330), un potente inibitore della proteina nucleare export, exportin-1 (XPO1, aka CRM1 ). Questi composti sono chiamati inibitori selettivi di esportazione nucleare (SINE) ed i loro effetti anti-cancro sono attualmente sotto inchiesta 31,32. I risultati del trattamento SINE a forti fenotipi del ciclo cellulare e la morte cellulare 33,34. Questo esempio mostra una cella che procede attraverso G1-fase con cinetiche normali (circa 6 ore), ma sperimenta ritardo nella progressione fase S come indicato dal termine con il segnale sia rosso e verde (circa 3 ore in controllo ma 10 in SINE trattati ). Questa cellula muore alla fine di S o G2-fase, dopo 21 ore 30 min; un ciclo cellulare normale è di circa 15 ore. Gli effetti di selinexor sono allo studio per il sangue diverso e tumori solidi 35.

<p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = "1"> un pilastro della terapia anti-cancro è la citotossicità attraverso danni al DNA catastrofici. danno al DNA può essere indotta attraverso molte terapie, tra cui le radiazioni, addotti a base di platino, e piccola molecola di droga - ad esempio, quelli che colpiscono la topoisomerasi I e / o II. Molte terapie combinate anche attaccare l'asse danni al DNA da entrambe inducendo danni attraverso percorsi separati o bloccando la capacità delle cellule di riparare i danni. La cinetica e il livello di danni e se e come questo provoca la morte delle cellule è di una diffusa importanza nelle terapie di sviluppo. Figura cellule HT1080 6 e 7 mostrano film che esprimono stabilmente un danno al DNA a doppio filamento giornalista, mCherry-BP1-2 36 in crescita normale media trattata con 10 pM etoposide (VP-16), un veleno topoisomerasi II. Questo reporter comprende una porzione della proteina sito rottura del DNA a doppio filamento, 53BP1 che è fuso con mCherry. Il nucleo di questa cellula è stato rintracciato USIng il plugin Analizzare Particelle in ImageJ e il segnale mCherry-BP1-2 integrato è stata misurata in ogni fotogramma dopo thresholding i valori che ha eliminato la sonda nucleare solubile. danno al DNA è minimo per il primo 10 ore e quindi aumenta costantemente. Inibitori della topoisomerasi II sono noti per influenzare particolarmente S e G2-fase, quando l'enzima è più attivo 37,38. La cinetica osservate in questo esempio potrebbe indicare ciclo cellulare danni associati; combinando mCherry-BP1-2 con i giornalisti Fucci ha potuto dimostrare la tempistica dei danni che possono poi essere collegata alla cella destino.

Figura 1. Introduzione all'uso a lungo termine microscopia time-lapse e longitudinale di monitoraggio per studiare la risposta ai farmaci anti-cancro. Le cellule in appositi piatti live-cell imaging etichettati, se lo desideri vengono esposte, cellule o regioni di interesse sono tracciati, ed i dati sono analizzato. Molti metodi esistono per monitorare e quantificare le cellule, alcuni sono indicati qui. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Fase contrasto Microscopia time-lapse mostra p53-dipendenza dopo Anti-mitotico Drug Treatment. Wildtype (A) e p53-atterramento (B) MCF7 cellule sono state trattate con 500 nM Kinesin-5 inibitori e ripreso ogni 10 minuti per 96 hr usando la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo NA 20X PH2 0,70. Le singole celle sono stati monitorati manualmente e la mitosi per cento e se la cella progredisce a un altro mitosi di nuovo durante il time-lapse sono stati segnati. Le frecce indicano cellule che viene monitorato. La cella sh p53 (B) divide entrando un secondo mitosi. (C) Entrambe le linee cellulari show arresto mitotico prolungato come indicato dalla percentuale mitosi picco (primo blu e frecce rosse). (C, D) Circa il 90% di celle senza p53 (sh p53, n = 87) mostra progressione continua (frecce rosse) rispetto al 20% di tipo selvatico (n = 130). Le barre di errore indicano la deviazione standard. Bar = 20 micron. Film 1 e 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. La cromatina Marker Histone 2b rivela prova di segregazione cromosomica Anomalie dopo basso dosaggio Paclitaxel trattamento. Paclitaxel è un farmaco mirato microtubuli che si traduce in difetti complessi, concentrazione-dipendente in crescita e divisione cellulare. L'organizzazione della cromatina informa sui diversi stati cellulari, tra cui lo stadiodella mitosi e la morte cellulare. cellule HeLa che esprimono stabilmente sia H2b-mCherry e β-tubulina-EGFP sono stati trattati con 1 nM paclitaxel. Questa cella è inizialmente in interfase, procede attraverso le fasi della mitosi e divide. Mentre il tempo in mitosi appare normale, ci sono prove di errori di collegamento dei cromosomi e di segregazione che si risolvono (frecce). Il destino di queste cellule può essere determinata direttamente dal monitoraggio longitudinale. A contrasto di fase (non mostrato) e le immagini fluorescenti sono stati acquisiti a 1 frame per 10 min con una lente NA 20X Ph2 0,70. Bar = 10 micron. Film 3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. I marcatori del ciclo cellulare fluorescenti permettere il monitoraggio diretto della progressione del ciclo cellulare.(A) Un campo di cellule HT1080 fibrosarcoma vive che esprimono il sistema FUCCI ripreso dal contrasto di fase e fluorescenza. (B, C) ​​La cella mitotica nella casella tratteggiata nella pannello A è seguito. Normalmente progredire attraverso il ciclo cellulare in circa 15 ore. Dopo la mitosi, le cellule sono brevemente debole, e quindi diventano rossi mentre progrediscono in e attraverso G1-fase. Quando le cellule entrano fase S, la sonda rossa CDT1 è degradata e le verdi aumenta sonda Geminin. Il breve periodo di circa 3 ore in cui entrambe le sonde sono presenti, indica precoce fase S. Come le cellule progressi attraverso S e G2-fase e nel prossimo mitosi rimangono verde. La sonda verde è degradato su anaphase della divisione cellulare. A contrasto di fase e le immagini fluorescenti sono state acquisite a 1 fotogramma al 10 min con una lente NA 20X PH2 0,70. Bar = 10 micron. Film 4. Clicca qui a view una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Cell Cycle effetti specifici e associati morte cellulare. La stessa linea di cellule come in Figura 4, ma trattati con due molecole diverse che rappresentano diversi obiettivi anti-cancro. Volte dopo il trattamento sono indicati. (A, B) Dopo il trattamento di un ritardo cellule / G2 fase S con 10 pM PD0332991 Cdk4 / 6 inibitore, si procede cellule normalmente mitosi (M) e divide. Una cellula figlia viene monitorato misurando intensità di fluorescenza rossa e verde nella regione di interesse nel nucleo. La cella rimane arrestato in G1-fase per circa 40 ore. (C, D) Dopo il trattamento di una cella tardiva G2-fase con 1 pM selinexor, essa cella progredisce normalmente mitosi (M) e divide. Una cellula figlia viene monitorato ed entra G1-fase, progredisce attraversouna precoce fase S prolungata (segnale rosso e verde), transizioni per il solo verde e muore dopo 21 ore 30 min. I dati suggeriscono progressione fase S è influenzato dal trattamento selinexor. A contrasto di fase e le immagini fluorescenti sono state acquisite a 1 fotogramma al 10 min con una lente NA 20X PH2 0,70. Bar = 10 micron. Film 5 e 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Dynamics danni al DNA dopo trattamento farmacologico. Molte terapie anti-cancro provocano danni al DNA che possono avere un impatto profondo risposta delle cellule e il successo del trattamento. cellule HT1080 stabilmente che esprimono sia il marcatore danni al DNA a doppio filamento mCherry-BP1-2 e H2b-EGFP (non mostrato) sono stati trattati con 10 mM della topoisomerasi II etoposide droga e DNA dAmage è stato rintracciato. (A) Il numero e l'intensità della crescita focolai dopo etoposide. Vi è inizialmente un certo ritardo, indicando i possibili effetti del ciclo cellulare coerenti con il meccanismo noto di etoposide. Con 22 hr 50 min questa cella ha accumulato un alto livello di danni. Sebbene non illustrato, il destino di questa cella può essere determinata mediante rilevamento diretto. (B) Un ROI corrispondente al nucleo ottenuto attraverso il segnale H2b-EGFP è stato rintracciato utilizzando il monitoraggio di particelle in ImageJ e il segnale BP1-2 mCherry integrato è stata quantificata e tracciati nel corso del tempo. Il ritardo del segnale fino a circa 10 ore è notato, seguito da un aumento persistente. immagini fluorescenti sono state acquisite a 1 fotogramma al 10 min con una lente NA 40X PH2 0.75. Bar = 10 micron. Film 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Film 1. Fase contrasto Microscopia time-lapse di tipo selvatico cellule MCF7 dopo. Tipo selvatico cellule MCF7 anti-mitotico trattamento farmacologico sono stati trattati con 500 nM Kinesin-5 inibitori e ripreso ogni 10 minuti per 96 ore usando la microscopia a contrasto di fase con un 20X PH2 0,70 lente NA. Arresto mitotico prolungato e l'uscita dalla mitosi possono essere osservati, come descritto nella Figura 2. Cliccate qui per scaricare questo file.

Movie 2. Fase contrasto Microscopia time-lapse di p53-knockdown cellule MCF7 dopo che le cellule anti-mitotico Drug Treatment. MCF7 esprimono stabilmente un piccolo RNA tornante mira p53 per la degradazione sono stati trattati con 500 nM Kinesin-5 inibitori e ripreso ogni 10 minuti per 96 ore usando la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo NA 20X PH2 0,70. Arresto mitotico prolungato e vari cicli di mitosi si possono osservare, come descritto nella Figura 2. Cliccate qui per scaricare questo file.

Movie 3. Fluorescente Microscopia time-lapse di cellule HeLa dopo Basse dosi di cellule Paclitaxel trattamento. HeLa che esprimono stabilmente H2B-mCherry e β-tubulina-EGFP sono stati trattati con 1 nM paclitaxel. Attaccamento cromosomiche e problemi di segregazione possono essere osservati, come descritto nella Figura 3. Le immagini sono state acquisite ogni 10 min con una lente NA 20X PH2 0,70. Cliccate qui per scaricare questo file.

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Film 4. I marcatori del ciclo cellulare fluorescenti permettere il monitoraggio diretto della progressione del ciclo cellulare. Le cellule che esprimono il sistema HT1080 FUCCI sono stati longitudinalmente monitorati durante la microscopia time-lapse. La cella va fioca dopo l'uscita mitosi, e poi diventa rossa come la cellula progredisce attraverso G1-fase. Come la cellula entra fase S, diventa giallo come i verdi aumenta sonda Geminin e la sonda rossa CDT1 è degradata. La cella rimane verde mentre progredisce attraverso S e G2-fase. Il verde degrada come le cellule entra anaphase. La quantificazione di questo cellulare è mostrato in Figura 4. Le immagini sono state acquisite ogni 10 min con una lente NA 20X PH2 0,70. Clicca qui per scaricare questo file.

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Film cellulare 5. HT1080 Esprimendo marcatori del ciclo cellulare fluorescenti dopo il trattamento con un inibitore G1-fase. Le cellule che esprimono il sistema HT1080 FUCCI sono stati trattati con 10 micron PD0332991, un Cdk4 / 6 inibitore. La cella rintracciato progredisce normalmente mitosi e divide. Una figlia è monitorato, e rimane rosso in G1 per la durata del film. La quantificazione è mostrato in Figura 5. Le immagini sono state acquisite ogni 10 min con una lente NA 20X PH2 0,70. Clicca qui per scaricare questo file.

Film 6. HT1080 cellulari che esprimono fluorescenti marcatori del ciclo cellulare dopo il trattamento con il Exportin-1 Inhibitor, Selinexor. Le cellule che esprimono il sistema HT1080 FUCCI erano treatEd con 1 micron selinexor. Questa cella ritardo G2-fase è stato rintracciato attraverso la mitosi. Una cellula figlia procede poi attraverso G1-fase (rosso) ed entra fase S (giallo). La cella progredisce lentamente attraverso S-fasi fino alla sua entrata-S tardo / G2-fase e muore dopo 21 ore 30 minuti di trattamento. La quantificazione è mostrato in Figura 5. Le immagini sono state acquisite ogni 10 min con una lente NA 20X PH2 0,70. Clicca qui per scaricare questo file.

Film 7. DNA Dynamics danni dopo il trattamento con un topoisomerasi II cellule HT1080 inibitori. Esprimono stabilmente il marcatore danni al DNA a doppio filamento mCherry-BP1-2 e H2B-EGFP sono stati trattati con 10 micron etoposide, un inibitore della topoisomerasi II. Il mCherry-BP1-2 viene visualizzata nel film. Poiché il trattamento continuas, il segnale di aumenti mCherry-BP1-2, indicando un aumento doppio filamento danni al DNA. La quantificazione è mostrato in Figura 6. Le immagini sono state acquisite ogni 10 min con una lente NA 40X PH2 0.75. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.