Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la risposta terapeutica antitumorale in singole cellule in coltura. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro, tra cui la risposta terapeutica eterogenea e il destino cellulare. Per iniziare, sotto una cappa a flusso laminare sterile certificata, preparare le cellule HT1080 in piastre certificate per coltura secondo il protocollo di testo e incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari umidificato.

Due giorni prima dell'imaging, piastra 50.000 cellule FuGENE HT1080 per pozzetto nel numero desiderato di pozzetti di un piatto con fondo di vetro n. 1,5 a 12 pozzetti. Regolare il numero di cellule piastrate in base al loro tasso di crescita e alla piastra utilizzata per ottenere circa il 60% di confluenza per l'inizio dell'esperimento.

Impostare la camera ambientale a circa l'80% di umidità con la temperatura nella posizione del campione impostata a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che il serbatoio dell'acqua sia riempito con acqua distillata sterile seguendo le indicazioni del produttore. Quindi accendere la camera ambientale sull'impostazione della temperatura desiderata, posizionarla nel tavolino del microscopio e impostarla.

Se c'è dello spazio libero tra la camera superiore del tavolino e l'inserto del tavolino, stendere pezzi di pellicola di paraffina sui bordi dell'apertura dell'inserto del tavolino, prima di inserire la camera al suo interno, per accoppiare la camera al tavolino. Assicurarsi che non ci siano collegamenti che tirano sulla camera, entrambi i quali possono introdurre artefatti di movimento. Inserire un piatto cieco con acqua nella camera e lasciare che la camera si equilibri a 37 gradi Celsius, quindi mantenere una temperatura stabile.

Per eseguire l'imaging, accendere il microscopio, il computer e tutte le periferiche necessarie. A seconda della fonte di luce, attendere l'accensione fino al momento del bisogno. Con la torretta dell'obiettivo in posizione bassa, selezionare l'obiettivo con apertura numerica 20x 0,7.

Quindi posizionare il campione sopra l'obiettivo, in modo da facilitare la ricerca delle cellule quando il campione si trova nella camera. Dopo aver trasferito le celle da fotografare nella camera ambientale, secondo il protocollo di testo, sigillare la camera per mantenere un ambiente stabile e accendere il gas atmosferico. Quindi, seleziona le condizioni di imaging che prevengono la fototossicità limitando i tempi di esposizione e utilizzando una luce di intensità inferiore.

Per trovare i piani X, Y e Z e le lunghezze d'onda desiderate per ogni posizione da riprendere. Per il lasso di tempo a lungo termine della maggior parte dei processi cellulari, acquisire un'immagine ogni dieci-venti minuti. Una maggiore risoluzione temporale fornisce più punti dati e un tracciamento delle celle più robusto, ma si traduce in un'esposizione alla luce più integrata e set di dati più grandi.

Poiché HT1080 FuGENE ha proteine florificanti verdi e rosse dinamiche, utilizzare i seguenti tempi di esposizione e utilizzare un contenitore due per due. Nelle impostazioni avanzate, abilitare la messa a fuoco automatica controllata dal software utilizzando le impostazioni predefinite. Definire un intervallo di messa a fuoco automatica di 10 micrometri con la dimensione del passo consigliata.

Nel piatto sperimentale, per ridurre la deriva termica, sostituire metà del mezzo con un mezzo contenente il farmaco desiderato che è stato riscaldato a 37 gradi Celsius. Infine, avvia il time lapse e acquisisci le immagini secondo il protocollo di testo. Questi filmati mostrano esempi di una coppia di linee cellulari MCF7 derivate dal cancro al seno che differiscono solo nel loro stato di p53 che sono state trattate con un farmaco antitumorale che inibisce la chinesina-5 con conseguente arresto mitotico.

Come si vede in questa figura, quando p53 viene rimossa dal knockdown stabile di p53, invece di arrestarsi dopo aver lasciato la mitosi, le cellule passano attraverso cicli ripetuti in cui entrano in un secondo ciclo di mitosi piuttosto che arrestarsi, e lasciano la mitosi senza divisione. Qui sono mostrate cellule Hela derivate dal carcinoma cervicale che esprimono stabilmente il marcatore della cromatina Istone 2b fuso a mCherry e la beta tubulina fusa a EGFP. Se trattato con il paclitaxolo, un farmaco stabilizzante dei microtubuli, l'allineamento e la segregazione dei cromosomi vengono interrotti durante la mitosi, con conseguente formazione di rigonfiamenti nucleari e micronuclei soggetti a danni al DNA.

Questa linea cellulare coesprime stabilmente i due indicatori del ciclo cellulare dell'ubiquitina fleroscente per CDT1, in arancione, e geminina in verde, e progredisce normalmente attraverso il ciclo cellulare. Quando le stesse cellule vengono trattate con l'inibitore CDK46, le cellule progrediscono attraverso la fase G2 e si dividono normalmente, quindi si arrestano fortemente nella fase G1, indicando il potenziale di effetti citostatici affettivi nei tumori in crescita. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile seguire la risposta di una singola cellula, direttamente, in tempo reale nel corso di molti giorni piuttosto che dedurre tali risposte.