Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la risposta terapeutica antitumorale in singole cellule in coltura. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, tra cui la risposta terapeutica eterogenea e il destino cellulare. Per iniziare, all'interno di una cappa a flusso laminare sterile certificata, preparare le cellule HT1080 in piatti idonei alla coltura cellulare seguendo il protocollo descritto e incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari umidificato.

Due giorni prima dell'acquisizione delle immagini, seminare 50.000 cellule HT1080 FuGENE per pozzetto nel numero desiderato di pozzetti di una piastra da 12 pozzetti con fondo in vetro no. 1,5. Regolare il numero di cellule seminate in base al loro tasso di crescita e alla piastra utilizzata, in modo da ottenere circa il 60% di confluenza all'inizio dell'esperimento.

Impostare la camera ambientale a un'umidità di circa l'80% e una temperatura di 37 gradi Celsius nella posizione del campione. Assicurarsi che il serbatoio dell'acqua sia riempito con acqua distillata sterile seguendo le istruzioni del produttore. Accendere quindi la camera ambientale impostandola alla temperatura desiderata, posizionarla sullo stage del microscopio e configurarla.

Se c'è spazio libero tra la camera superiore del palco e l'incastro del palco, posizionare pezzi di pellicola di paraffina sui bordi dell'apertura dell'incastro del palco, prima di inserire la camera, per accoppiare la camera al palco. Assicurarsi che nessun collegamento tiri sulla camera, poiché ciò potrebbe introdurre artefatti di movimento. Inserire una capsula fittizia contenente acqua nella camera e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio a 37 gradi Celsius, quindi mantenerla a una temperatura stabile.

Per prepararsi all'acquisizione delle immagini, accendere il microscopio, il computer e tutte le periferiche necessarie. A seconda della sorgente luminosa, attendere ad accenderla fino al momento del bisogno. Con la torretta degli obiettivi in posizione bassa, selezionare l'obiettivo 20x con apertura numerica 0.7.

Posizionare quindi il campione sopra l'obiettivo, in modo da facilitare l'individuazione delle cellule quando il campione si trova nella camera. Dopo aver trasferito le cellule da sottoporre a imaging nella camera ambientale, secondo il protocollo descritto, sigillare la camera per mantenere un ambiente stabile e accendere il gas atmosferico. Successivamente, selezionare le condizioni di imaging che prevengano la fototossicità limitando i tempi di esposizione e utilizzando una luce di intensità inferiore.

Per individuare i piani X, Y e Z e le lunghezze d'onda desiderate per ciascuna posizione da acquisire. Per acquisizioni a lungo termine della maggior parte dei processi cellulari, registrare un'immagine ogni dieci o venti minuti. Una risoluzione temporale maggiore fornisce più punti dati e un tracciamento cellulare più accurato, ma comporta un'esposizione cumulativa alla luce più elevata e insiemi di dati più grandi.

Dato che le HT1080 FuGENE esprimono proteine fluorescenti verdi e rosse dinamiche, utilizzare i seguenti tempi di esposizione e impostare un binning 2x2. Nelle impostazioni avanzate, abilitare la messa a fuoco automatica controllata dal software utilizzando le impostazioni predefinite. Definire un intervallo di messa a fuoco automatica di 10 micrometri con l'incremento raccomandato.

Nella piastra sperimentale, per ridurre la deriva termica sostituire metà del mezzo con del mezzo contenente il farmaco desiderato, riscaldato a 37 gradi Celsius. Infine, avviare l'acquisizione a intervalli di tempo e raccogliere le immagini seguendo il protocollo descritto nel testo. Questi filmati mostrano esempi di una coppia di linee cellulari di carcinoma mammario MCF7, abbinate tra loro, che differiscono soltanto per lo stato del p53 e che sono state trattate con un farmaco antitumorale in grado di inibire la chinesina-5, provocando un arresto mitotico.

Come si può osservare in questa figura, quando il p53 viene eliminato mediante silenziamento stabile di p53, invece di arrestarsi dopo l'uscita dalla mitosi, le cellule attraversano cicli ripetuti in cui entrano in un secondo giro di mitosi anziché arrestarsi, e abbandonano la mitosi senza divisione. Qui sono mostrate cellule di carcinoma della cervice di derivazione Hela che esprimono stabilmente il marcatore della cromatina Istone 2b fuso all'mCherry e la beta tubulina fusa all'EGFP. Quando trattate con il farmaco stabilizzante dei microtubuli paclitaxel, l'allineamento e la segregazione dei cromosomi risultano alterati durante la mitosi, portando alla formazione di rigonfiamenti nucleari e micronuclei che sono soggetti a danni del DNA.

Questa linea cellulare esprime stabilmente i due indicatori fluorescenti dell'ubiquitina per il ciclo cellulare per CDT1, in arancione, e la geminina in verde, e progredisce normalmente attraverso il ciclo cellulare. Quando le stesse cellule vengono trattate con l'inibitore CDK46, le cellule progrediscono attraverso la fase G2 e si dividono normalmente, quindi si arrestano fortemente nella fase G1, indicando il potenziale di effetti citostatici efficaci nei tumori in crescita. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile seguire direttamente, in tempo reale e per diversi giorni, la risposta di una singola cellula, piuttosto che dedurla indirettamente.