Name: Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Scopri la microscopia time-lapse per monitorare le risposte terapeutiche anti-cancro in singole cellule HT1080 e HeLa. Questo metodo consente di osservare in tempo reale l'eterogeneità cellulare e il destino delle cellule trattate.

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Ringraziamo Joshua Marcus per il supporto tecnico e Jolien Tyler, Ph.D., Direttore del Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, per la consulenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dell'Università del Colorado Boulder e dell'Università del Colorado Boulder Graduate School a J.D.O. R.T.B. è parzialmente supportato da una borsa di formazione pre-dottorato del NIH (T32 GM008759). Ringraziamo Karyopharm Therapeutics, Inc. per selinexor e Merck Serono per l'inibitore della chinesina-5. I plasmidi FUCCI provengono da Atsushi Miyawaki (RIKEN, Giappone) tramite MTA. mCherry-BP1-2 proveniva da Addgene. HeLa che esprime H2b-mCherry e β-tubulina-EGFP proviene da Daniel Gerlich (IMBA, Accademia Austriaca delle Scienze, Austria).

Il seguente protocollo utilizza parametri definiti dagli esperimenti nelle figure 4 e 6 impostazioni di acquisizione relative e delle condizioni sperimentali. Molti di questi parametri possono essere modificati per adattarsi altri esperimenti (ad esempio, i tempi di esposizione, categorizzazione, canali fluorescenti, ecc.). Tutte le procedure devono rispettare le linee guida e regolamenti istituzionali ed essere approvati dal comitato di biosicurezza istituzionale. siti web produttore microscopio contengono informazioni eccellente per l&#39;imaging cellulare dal vivo. 1. microscopi e software di imaging <ol><li> Eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo su una vasta gamma di microscopi invertiti. I microscopi più comuni sono widefield epifluorescenza e confocale spinning-disco. Qui, usare un microscopio automatico e motorizzato widefield epifluorescenza con sorgente luminosa a ioduri metallici da 200 watt. </li><li> Ottenere uno stadio-top o un microscopio camera ambientale. Qui, usare uno stadio-top camera ambientale. </li><li> Utilizzare il software commerciale per operare microscopi con utility per eseguire la microscopia time-lapse. </li><li> Utilizzare software disponibile in commercio o ImageJ per l&#39;analisi delle immagini. Molti altri strumenti di analisi sono disponibili in commercio, e ci sono programmi su misura, molti dei quali sono stati pubblicati 8,18. </li></ol> 2. Visualizzare i processi cellulari e fenotipici Risposte <ol><li> Visualizza le cellule con la microscopia in campo chiaro. Differenziale contrasto interferenziale contrasto di fase e solo può essere molto informativo per studiare le risposte alle risposte farmaco anti-cancro. Questi processi possono includere la mitosi, la motilità cellulare e apoptosi. </li><li> Visualizza strutture cellulari, organelli ei processi con biosensori fluorescenti. sonde fluorescenti sono informativi nel monitoraggio dei processi subcellulare specifici. Questi possono includere dinamica dei microtubuli, mitocondriale e le dinamiche reticolo endoplasmatico, l&#39;accumulo di proteine ​​e localizzazione, esegnali molecolari (ad es., fosforilazione, calcio). </li></ol> 3. Preparazione di campioni <ol><li> Crescere le cellule in piatti certificati di coltura cellulare in uno standard, coltura cellulare umidificata incubatore (ad esempio, 37 ° C, 5% di CO 2, 80% di umidità relativa). <ol><li> Crescere le cellule HT1080 in MEM con EBSS. Integrare la media con il 10% v / v FBS, 1% v / v pen / strep, 1% v / v di sodio piruvato e 1% v / v aminoacidi non essenziali. </li></ol></li><li> Due giorni prima di imaging, le cellule piastra 50.000 HT1080 Fucci in 3 pozzetti di una 12-pozzetti # 1.5 vetro piatto fondo in una cappa a flusso laminare sterile certificata. Regolare il numero di cellule piastrate per raggiungere ~ 60% di confluenza per l&#39;inizio dell&#39;esperimento. A seconda della linea cellulare e la natura dell&#39;esperimento densità cellulare può essere inferiore. Nota: Densità cellulare può avere una profonda influenza sulla crescita della linea cellulare e sui risultati sperimentali. Contare le celle per ridurre al minimo esperimento-to-esperimento variability a causa della densità. <ol><li> A seconda della camera ambientale e le condizioni necessarie per l&#39;esperimento, le cellule piastra in singoli piatti e (di solito 35- o 60-mm), 4 e 35 mm piatti, 6-, piastre di coltura cellulare a 12 o 24 pozzetti, o coprivetrino per diapositive in vari formati. Usare piatti con fondo di vetro con # 1.5 vetro come la maggior parte delle lenti dell&#39;obiettivo sono ottimizzati per questo spessore del vetro, e immagini attraverso plastica coltura cellulare è molto povera. Nota: Alcune linee di cellule non crescono e sopravvivono su vetro. In questi casi, il vetro può essere rivestito per migliorare l&#39;aderenza delle cellule (ad es., Poli-lisina o collagene). Alcune aziende producono ottica di plastica coltura cellulare, occorre determinare empiricamente se questa è una valida opzione. </li></ol></li></ol> 4. Camera ambientale Set-up <ol><li> Prima di qualsiasi sperimentazione, set-up la camera ambientale in modo che funziona a ~ 80% di umidità e quindi la temperatura nella posizione del campione è 37 ° C. Cellule più coltivate crescono in atmosfera al 5% di aria CO 2 / saldo al tampone bicarbonato di sodio in mezzo. A seconda del set-up, impostare il controller ambientale al 5% di CO 2 e si mescolare 100% CO 2 con l&#39;aria, o utilizzare premiscelato, certificata 5% di CO 2 / bilancio dei gas dell&#39;aria. Seguire le istruzioni del produttore per il gas portate. Nota: Alcune linee di cellule crescono in CO 2 media -indipendente nel qual caso essi possono essere mantenuti senza CO 2. supporti di imaging Specificamente progettato è inoltre disponibile che limita l&#39;aggiunta di composti autofluorescenti. La crescita in tesi mezzi per il tipo cellulare desiderato deve essere determinato empiricamente in anticipo. </li><li> Prima di imaging, garantire il serbatoio è pieno (seguendo le indicazioni del produttore) con acqua distillata sterile. Accendere la camera ambientale per l&#39;impostazione della temperatura desiderata e posizionarlo nella inserto palco microscopio. Per salvare il gas, non avviare il flusso, a questo punto. Nota: Se c&#39;è qualche spazio libero tra la camera di fase-top e la fase incasso e / o di qualsiasi tensione sui cavi di collegamento alla camera si può introdurre artefatti da movimento nella esperimento. <ol><li> Lay pezzi di pellicola di paraffina sui bordi dell&#39;apertura inserto palco prima di inserire la camera in esso per paio camera al palco, e assicurarsi che nessuna connessione stanno tirando sulla camera. </li></ol></li><li> Lasciare che la camera di equilibrare a 37 ° C. Mantenere una temperatura stabile per evitare fluttuazioni di temperatura durante l&#39;imaging che può influenzare la fisiologia cellulare e introdurre deriva. Raggiungendo equilibrazione temperatura richiede tipicamente 30 min a 1 ora, a seconda dell&#39;ambiente. <ol><li> Inserire un piatto di &#39;manichino&#39; con l&#39;acqua nei pozzi nella camera durante il riscaldamento. Un piatto di imaging riempito con acqua imita il campione, contribuendo a garantire la camera è sufficientemente riscaldato e stabilizzata. Riempire la camera con acqua sterile pre-riscaldatoriduce il tempo necessario alla stabilizzazione della temperatura e minimizza la diminuzione di temperatura dopo l&#39;aggiunta del campione sperimentale. </li></ol></li></ol> 5. Microscopio Set-up <ol><li> Accendere il microscopio, computer associato, ed eventuali periferiche necessarie. <ol><li> A seconda della sorgente di luce, l&#39;ora di accenderlo fino al momento dell&#39;uso (es., LED). </li></ol></li><li> Con la torretta obiettivo in una posizione bassa, seleziona l&#39;obiettivo 20X 0,7 NA da utilizzare. </li><li> Posizionare il campione rispetto all&#39;obiettivo - questo renderà più facile trovare le cellule in cui il campione è nella camera. </li><li> Definire i parametri di imaging in questo momento se essi sono noti da precedenti esperimenti. </li></ol> 6. Il trasporto di cellule al microscopio e nella Camera <ol><li> Il trasporto le cellule per essere ripreso dal termostato per la camera ambientale. Assicurarsi che questo è fatto rapidamente per limitare gli effetti di un relativamente basso di CO 2 </sub&gt; atmosfera e diminuite temperatura sulle cellule. Seguire tutte le linee guida di biosicurezza istituzionali per il trasporto del campione e pulizia in caso di fuoriuscita. <ol><li> Collocare le cellule in un contenitore sigillato polistirolo o sacchetto isolato per evitare grandi cambiamenti ambientali. </li></ol></li><li> Inserire il piatto di imaging campione nella camera seguendo le indicazioni del produttore. </li><li> Dopo che le cellule sono stati fissati all&#39;interno della camera ambientale, sigillare la camera per mantenere un ambiente stabile e girare immediatamente sulla fonte (s) di gas atmosferici. <ol><li> Poiché alcune camere ambientali non utilizzano un coperchio stretto, sigillato, per ritardare l&#39;evaporazione, strato sterile, olio minerale embrione certificata sopra del mezzo di crescita. Avvolgere pellicola di paraffina gas permeanti intorno ai perimetrali-bordi del piatto del campione facendo attenzione a non ostacolare l&#39;area di esposizione di vetro. Localizzato, metodi di umidificazione secondari possono essere impiegati. Condensa sul coperchio del piatto del campione può diminuire perforMance della microscopia in campo chiaro. </li></ol></li><li> Al fine di minimizzare gli effetti della deriva termica precoce durante l&#39;esperimento, attendere 30 minuti prima di iniziare il time-lapse. Il tempo necessario varia in base alle dimensioni piatto di imaging e di altri fattori. Determinare empiricamente. </li></ol> 7. Impostazione del Imaging <ol><li> Selezionare le condizioni di imaging che meglio rappresentano i dati. Prendere precauzioni per evitare la fototossicità, limitando i tempi di esposizione, utilizzando la luce minore intensità e selezionando le sonde che vengono eccitati da lunghezze d&#39;onda della luce. </li><li> Definire x, y, z-aereo e desiderata lunghezza d&#39;onda (s) per ciascuna posizione da acquisire. La risoluzione temporale è limitata dal numero di posizioni e lunghezze d&#39;onda. Per lungo termine time-lapse della maggior parte dei processi cellulari, acquisire un&#39;immagine ogni 10 - 20 min; risoluzione temporale superiore (brevi intervalli, per esempio., 1 min) fornisce più punti di dati e quindi più robusto di monitoraggio delle cellule, ma anche i risultati in più integrataesposizione alla luce e set di dati più grandi. <ol><li> Come HT1080 FUCCI hanno proteine ​​fluorescenti verde e rosso dinamici (vedi Rappresentante dei risultati), utilizzare i seguenti tempi di esposizione: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, campo chiaro - 20 msec. Utilizzare un bidone 2 x 2. </li></ol></li><li> Attivare il software messa a fuoco automatica a controllo utilizzando i parametri predefiniti in Impostazioni avanzate. Definire un area di lettura di 10 micron con la dimensione del passo consigliato. Essere sicuri di fare questo prima di iniziare il time-lapse. Autofocus con immagini campo chiaro e mai con fluorescenza per ridurre fototossicità e photobleaching. <ol><li> Utilizzare sistemi di autofocus software controllato su qualsiasi microscopio con un palco motorizzato, e mettere a fuoco direttamente sul campione. Tuttavia, possono limitare la velocità di acquisizione dell&#39;esperimento. Hardware controllato i sistemi di messa a fuoco in continuo funzionano bene per la microscopia time-lapse e migliorare la velocità, consentendo un più posizioni per essere ripreso o un più alto tasso di acquisizione. Tuttavia, essiaffidarsi al rilevamento di all&#39;interfaccia aria-vetro e può perdere la concentrazione del campione con variazioni di spessore del vetro attraverso il pozzo. </li></ol></li><li> Sostituire la metà dei mezzi di comunicazione con i media che contiene la concentrazione di farmaco desiderato che è stato riscaldato a 37 ° C. sostituzione dei supporti parziale aiuta a ridurre la deriva termica. Le condizioni di questo esperimento sono veicolo (DMSO), 1 micron selinexor e 10 micron PD0332991. Nota: Questo passaggio può essere fatto anche dopo l&#39;avvio l&#39;acquisizione mettendo in pausa e riavviare l&#39;esperimento. Questo permette il monitoraggio longitudinale delle risposte pre e post-farmaco di singole cellule. Se la stabilità della droga o il metabolismo è una preoccupazione, fermandosi e sostituzione dei supporti può essere fatto con lo stesso metodo. Per eseguire il test per la degradazione di droga o il metabolismo, i media da cellule trattate possono anche essere collocati sulle cellule naive per testare azione dei farmaci. </li><li> Avviare il time-lapse. </li><li> Come il time-lapse corre, in modo che i campi imaged rimangono a fuoco e l&#39;ChambeR mantiene un umido 37 ° C. <ol><li> Regolare la messa a fuoco in base alle esigenze mettendo in pausa l&#39;acquisizione durante l&#39;intervallo di tempo tra i punti di tempo. </li></ol></li><li> Se necessario, aggiungere acqua alla camera durante gli esperimenti più lunghi. Evitare di raffreddare la camera con l&#39;aggiunta di pre-riscaldato, acqua distillata sterile a 37 ° C. </li></ol> 8. Terminare la Time-lapse <ol><li> Quando l&#39;esperimento è stato eseguito fino al completamento, fermare l&#39;acquisizione se non è stato impostato per interrompere automaticamente. </li><li> Assicurarsi che il time-lapse è stato salvato correttamente sul disco rigido, anche se la maggior parte dei pacchetti software salva automaticamente durante l&#39;acquisizione, se non finito correttamente i dati possono essere persi. </li><li> Rimuovere la camera dal microscopio e smaltire le cellule in rifiuti a rischio biologico seguendo le procedure di biosicurezza istituzionale approvate. </li></ol> 9. longitudinale di monitoraggio e analisi dei dati Time-lapse <ol><li> Scegliere la metodologia di analisi che èappropriato per i processi biologici di interesse. Molti plugin per ImageJ, programmi utilizzando Matlab, e le piattaforme su misura sono stati prodotti per applicazioni specifiche. Il seguente metodologia copre inseguimento di nuclei e analisi di sonde fluorescenti nucleari come dimostrato nelle figure 4 e 5. </li><li> Aprire le pile di immagini .tif per i canali utilizzati in ImageJ. In alternativa, aprire i file nativi del programma di acquisizione direttamente in ImageJ utilizzando il plugin Bioformats. </li><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) all&#39;interno del nucleo di una cellula utilizzando l&#39;immagine campo chiaro o il canale etichetta nucleare (se utilizzato) e aggiungerlo al gestore ROI. Nota: Se le cellule imaged hanno un&#39;etichetta nucleari (ad esempio, istone H2B-EGFP.), Quindi il monitoraggio delle cellule automatica può essere utilizzata per creare regioni di interesse (ROI) che rappresenta i singoli nuclei attraverso il tempo. </li><li> Passare al successivo punto di tempo e posizionare la ROI all&#39;interno della stessa nucleuS. Aggiungere il ROI al gestore ROI. </li><li> Continuare a monitorare e rendere ROI per la singola cella fino a quando c&#39;è un evento cellulare (mitosi, apoptosi, ecc.) O la cellula non può più essere rintracciato (es., Si muove fuori cornice o termine dell&#39;esperimento). </li><li> Quando ROI sono state stabilite per cellule attraverso il tempo che sono nel campo, sovrapporle sui canali fluorescenti di interesse. Misurare l&#39;intensità media della fluorescenza in ciascun canale per ogni punto di tempo. Salvare l&#39;elenco ROI per un uso successivo. <ol><li> Varie misurazioni possono essere effettuate entro il ROI per applicazioni in diversi esperimenti. Clicca Analisi → Imposta Misure ... per far apparire un menu per scegliere il metodo analitico (ad es., Intensità media all&#39;interno del ROI, intensità integrata, ecc.). </li></ol></li><li> Nota destino di singole celle (ad es., L&#39;apoptosi, la divisione, sopravvivenza) tenendo traccia. Ciò consente la creazione di curve di sopravvivenza e furtheanalisi R popolazione. </li><li> Con l&#39;intensità media per entrambi i canali, creare un diagramma a dispersione per visualizzare dinamiche del ciclo cellulare in risposta terapeutica (Figura 5B, C). Nota: trame possono essere creati per singole celle nel tempo o mediate su una popolazione di cellule cingolati. imaging quantitativo può essere fondamentale per la creazione di risposte complesse e relazioni di cellule in risposta a terapie contro il cancro. A lungo termine la microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale e l&#39;analisi dei dati è un processo multi-step, con molte opzioni per il tipo di strumenti di microscopia ed analisi, e segue lo schema generale di figura 1. </li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Vantaggi di Microscopia time-lapse e monitoraggio longitudinale Il microscopio è uno strumento ideale per gli studi longitudinali di risposta ai farmaci in quanto consente ai ricercatori di monitorare le singole cellule e il loro destino, nonché l&#39;intera popolazione. La variabilità della risposta ai farmaci all&#39;interno di una popolazione di cellule è una questione importante per l&#39;anti-cancro disegno terapeutico. monitoraggio longitudinale di singole cellule perm...

microscopia Live-cell e il monitoraggio longitudinale di singole cellule, non è una nuova tecnica. Fin dai primi microscopi, gli appassionati e gli scienziati hanno osservato e studiato singole cellule e organismi, i loro comportamenti, e lo sviluppo 1-3. Un esempio famoso della fine del David Rogers alla Vanderbilt University nel 1950 mostra un neutrofili umano in uno striscio di sangue a caccia di un batterio Staphylococcus aureus e, infine, il processo di fagocitosi 4. Questo film live-cell è un eccellente esempio di come i processi multipli possono essere osservati e correlati in un singolo esperimento: rilevamento di un gradiente di chimica, la meccanica e la velocità della motilità cellulare, cellule forme dinamiche, l&#39;adesione e la fagocitosi di un agente patogeno. L&#39;avvento di microscopi completamente automatizzati e fotocamere digitali ad alta sensibilità ha portato ad un crescente numero di ricercatori che utilizzano la microscopia di porre domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule che vanno from come le cellule si muovono 5,6 e 7,8 per dividono organelli dinamica e traffico di membrana 9-11. Non fluorescente, in campo chiaro microscopia, tra cui contrasto di fase (PC), che ha ottenuto il premio Nobel per Frits Zernike nel 1953, e il contrasto di interferenza differenziale (DIC) consentire l&#39;osservazione di cellule e nuclei ma anche strutture sub-cellulari, tra cui fasci microtubuli , cromosomi, nucleoli, dinamica organelli, e fibre di actina spessore 12. Geneticamente codificato proteine ​​fluorescenti e lo sviluppo di coloranti fluorescenti contro organelli hanno notevolmente influenzato time-lapse microscopia a 13-15. Pur non essendo il focus di questo articolo, l&#39;imaging in sferoidi di cellule e in situ (microscopia intravitale) utilizzando la microscopia confocale e multiphoton rappresentano un&#39;altra espansione dell&#39;approccio, e non ci sono articoli in sospeso che usano e trattano questi approcci 16-19. Le risposte delle cellule di anti-cancfarmaci er o prodotti naturali sono determinate sulla scala molecolare e cellulare. Comprensione delle risposte cellulari e sorti in seguito al trattamento spesso comporta saggi popolazione della media (ad es., Immunoblotting, misure e integrali), o il tempo-punti fissi con il rilevamento di immunofluorescenza e citometria a flusso, che misurano singole cellule. L&#39;eterogeneità nelle risposte delle cellule singole a farmaci all&#39;interno di una popolazione, in particolare nei tumori, può spiegare alcune delle variabilità nella risposta visto attraverso le linee cellulari e tumori che vengono trattati con lo stesso farmaco a saturazione. A lungo termine approcci longitudinali seguire una determinata cella singola o di una popolazione di cellule è un approccio meno comune ma molto potente che consente lo studio diretto di percorsi risposta molecolare, diversi fenotipi (ad es., Morte cellulare o divisione cellulare), osservazione cella-a-cella di variabilità all&#39;interno di una popolazione, e come questi fattori contribuiscono alla dinamica di risposta della popolazione 20-22. Ottimisticamente, essendo in gradodi osservare e quantificare le risposte delle cellule singole contribuirà a migliorare la nostra comprensione di come funzionano le droghe, il motivo per cui a volte falliscono, e come li utilizzano al meglio. La tecnica di lungo termine microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale, e l&#39;analisi delle risposte farmaco è disponibile per molti ricercatori e può essere semplice, utilizzando solo la luce trasmessa per osservare le risposte fenotipo 20,21. I componenti principali del metodo sono: la corretta preparazione delle cellule di interesse, un microscopio automatizzato con camera ambientale, una fotocamera integrata con un computer per acquisire e memorizzare le immagini, e il software di rivedere il time-lapse e misurare e analizzare le cellule e qualsiasi biosensori fluorescenti. Forniamo un protocollo dettagliato con molti suggerimenti per lo svolgimento di time-lapse microscopia di cellule in coltura per tutto il tempo diversi giorni con campo chiaro e / o la microscopia epifluorescente widefield. Questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi linea cellulare che può essere coltivata in colturaper studiare le loro risposte alle terapie anti-cancro. Forniamo esempi di dati acquisiti e analizzati utilizzando più biosensori fluorescenti geneticamente codificati diversi e un esempio di microscopio a contrasto di fase, discutere brevemente i diversi tipi di sonde, i vantaggi e gli svantaggi di lungo termine time-lapse e il monitoraggio longitudinale, ciò che può essere imparato a questo approccio che è difficile da capire da approcci non-diretti, e alcune variazioni che speriamo essere di interesse e valore per i ricercatori inesperti che non hanno pensato di utilizzare l&#39;approccio, e di ricercatori esperti.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>farmaco stabilizzante dei microtubuli</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>inibitore della topoisomerasi II</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>inibitore XPO1/CRM1, regalo</td></tr><tr><td>Inibitore della chinesina-5</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>regalo, disponibile anche da American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare</td><td>HyClone (Fisher) o Mediatech</td><td></td><td>molte aziende disponibili</td></tr><tr><td>5% CO2/bilancia aria, certificato</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Piatto, 20 mm fondo di vetro</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>molte aziende disponibili</td></tr><tr><td>35 mm 4 pozzetti Piatto, 20 mm fondo di vetro</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>molte aziende disponibili</td></tr><tr><td>Piatto da 35 mm, fondo in vetro grigliato</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>molte aziende disponibili</td></tr><tr><td>Multi-pozzetto, fondo in vetro</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>molte aziende disponibili</td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza invertito Olympus IX81</td><td>Controller Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III tavolino motorizzato</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV camera</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Unità di controllo ambientale</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD con controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lancio laser Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT CAMERA DI ASSOCIAZIONE</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

attraverso lo specchio: time-lapse microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo studio therapeutics anti-cancro

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

La risposta di singole cellule di farmaci anti-cancro contribuiscono a determinare la risposta della popolazione, e quindi è un importante fattore nel risultato complessivo. Immunoblotting, citometria a flusso e esperimenti sulle cellule fisse sono spesso utilizzati per studiare come le cellule rispondono ai farmaci anti-cancro. Questi metodi sono importanti, ma hanno diversi difetti. La variabilità della risposta ai farmaci tra il cancro e cellule normali, e tra le cellule di origine diversa cancro, e transitori e le risposte rare sono difficili da capire usando saggi popolazione calcolo della media e senza essere in grado di monitorare direttamente e analizzarli in senso longitudinale. Il microscopio è particolarmente adatto a cellule vive di immagine. Gli avanzamenti nella tecnologia ci permettono di ordinariamente celle di immagine con una risoluzione che consente non solo di inseguimento cellulare, ma anche l&#39;osservazione di una varietà di risposte cellulari. Descriviamo un approccio in dettaglio che permette di imaging continuo time-lapse dicellule durante la risposta ai farmaci essenzialmente per il tempo desiderato, in genere fino a 96 ore. Utilizzando varianti dell&#39;approccio, le cellule possono essere monitorati per settimane. Con l&#39;impiego di organismi geneticamente codificati biosensori fluorescenti processi numerosi, i percorsi e le risposte possono essere seguite. Mostriamo esempi che includono il monitoraggio e la quantificazione della crescita cellulare e la progressione del ciclo cellulare, la dinamica dei cromosomi, danni al DNA, e la morte cellulare. Discuteremo anche le variazioni della tecnica e la sua flessibilità, e mettere in evidenza alcuni problemi comuni.

A lungo termine time-lapse microscopia e di monitoraggio longitudinale diretta consente per lo studio di molti effetti anti-cancro durante la risposta ai farmaci. Seguendo lo schema generale della figura 1, più esempi di cellule sono mostrati esprimere reporter fluorescenti convalidati trattata con farmaci antitumorali, cingolati e analizzati utilizzando approcci diversi. Fase microscopio a contrasto da solo è...

Qui, descriviamo un metodo di microscopia time-lapse a lungo termine per tracciare longitudinalmente singole cellule in risposta a terapie antitumorali.

Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la risposta terapeutica antitumorale in singole cellule in coltura. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, tra cui la risposta terapeutica eterogenea e il destino cellulare. Per iniziare, all'interno di una cappa a flusso laminare sterile certificata, preparare le cellule HT1080 in piatti idonei alla coltura cellulare seguendo il protocollo descritto e incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari umidificato.Due giorni prima dell'acquisizione delle immagini, seminare 50.000 cellule HT1080 FuGENE per pozzetto nel numero desiderato di pozzetti di una piastra da 12 pozzetti con fondo in vetro no. 1,5. Regolare il numero di cellule seminate in base al loro tasso di crescita e alla piastra utilizzata, in modo da ottenere circa il 60% di confluenza all'inizio dell'esperimento.Impostare la camera ambientale a un'umidità di circa l'80% e una temperatura di 37 gradi Celsius nella posizione del campione. Assicurarsi che il serbatoio dell'acqua sia riempito con acqua distillata sterile seguendo le istruzioni del produttore. Accendere quindi la camera ambientale impostandola alla temperatura desiderata, posizionarla sullo stage del microscopio e configurarla.Se c'è spazio libero tra la camera superiore del palco e l'incastro del palco, posizionare pezzi di pellicola di paraffina sui bordi dell'apertura dell'incastro del palco, prima di inserire la camera, per accoppiare la camera al palco. Assicurarsi che nessun collegamento tiri sulla camera, poiché ciò potrebbe introdurre artefatti di movimento. Inserire una capsula fittizia contenente acqua nella camera e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio a 37 gradi Celsius, quindi mantenerla a una temperatura stabile.Per prepararsi all'acquisizione delle immagini, accendere il microscopio, il computer e tutte le periferiche necessarie. A seconda della sorgente luminosa, attendere ad accenderla fino al momento del bisogno. Con la torretta degli obiettivi in posizione bassa, selezionare l'obiettivo 20x con apertura numerica 0.7.Posizionare quindi il campione sopra l'obiettivo, in modo da facilitare l'individuazione delle cellule quando il campione si trova nella camera. Dopo aver trasferito le cellule da sottoporre a imaging nella camera ambientale, secondo il protocollo descritto, sigillare la camera per mantenere un ambiente stabile e accendere il gas atmosferico. Successivamente, selezionare le condizioni di imaging che prevengano la fototossicità limitando i tempi di esposizione e utilizzando una luce di intensità inferiore.Per individuare i piani X, Y e Z e le lunghezze d'onda desiderate per ciascuna posizione da acquisire. Per acquisizioni a lungo termine della maggior parte dei processi cellulari, registrare un'immagine ogni dieci o venti minuti. Una risoluzione temporale maggiore fornisce più punti dati e un tracciamento cellulare più accurato, ma comporta un'esposizione cumulativa alla luce più elevata e insiemi di dati più grandi.Dato che le HT1080 FuGENE esprimono proteine fluorescenti verdi e rosse dinamiche, utilizzare i seguenti tempi di esposizione e impostare un binning 2x2. Nelle impostazioni avanzate, abilitare la messa a fuoco automatica controllata dal software utilizzando le impostazioni predefinite. Definire un intervallo di messa a fuoco automatica di 10 micrometri con l'incremento raccomandato.Nella piastra sperimentale, per ridurre la deriva termica sostituire metà del mezzo con del mezzo contenente il farmaco desiderato, riscaldato a 37 gradi Celsius. Infine, avviare l'acquisizione a intervalli di tempo e raccogliere le immagini seguendo il protocollo descritto nel testo. Questi filmati mostrano esempi di una coppia di linee cellulari di carcinoma mammario MCF7, abbinate tra loro, che differiscono soltanto per lo stato del p53 e che sono state trattate con un farmaco antitumorale in grado di inibire la chinesina-5, provocando un arresto mitotico.Come si può osservare in questa figura, quando il p53 viene eliminato mediante silenziamento stabile di p53, invece di arrestarsi dopo l'uscita dalla mitosi, le cellule attraversano cicli ripetuti in cui entrano in un secondo giro di mitosi anziché arrestarsi, e abbandonano la mitosi senza divisione. Qui sono mostrate cellule di carcinoma della cervice di derivazione Hela che esprimono stabilmente il marcatore della cromatina Istone 2b fuso all'mCherry e la beta tubulina fusa all'EGFP. Quando trattate con il farmaco stabilizzante dei microtubuli paclitaxel, l'allineamento e la segregazione dei cromosomi risultano alterati durante la mitosi, portando alla formazione di rigonfiamenti nucleari e micronuclei che sono soggetti a danni del DNA.Questa linea cellulare esprime stabilmente i due indicatori fluorescenti dell'ubiquitina per il ciclo cellulare per CDT1, in arancione, e la geminina in verde, e progredisce normalmente attraverso il ciclo cellulare. Quando le stesse cellule vengono trattate con l'inibitore CDK46, le cellule progrediscono attraverso la fase G2 e si dividono normalmente, quindi si arrestano fortemente nella fase G1, indicando il potenziale di effetti citostatici efficaci nei tumori in crescita. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile seguire direttamente, in tempo reale e per diversi giorni, la risposta di una singola cellula, piuttosto che dedurla indirettamente.

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Questo video dimostra un metodo per tracciare il traffico di cellule T indotte da anticorpi bispecifici ai tumori in un modello murino. Le cellule T effettrici trasdotte dalla luciferasi vengono iniettate in un topo con uno xenotrapianto di cellule tumorali sottocutanee. Vengono quindi introdotti anticorpi bispecifici, legandosi alle cellule T e alle cellule tumorali. La localizzazione delle cellule T viene tracciata utilizzando l'imaging bioluminescente, con l'entità del segnale che indica...

Una tecnica in vivo per tracciare il traffico di cellule T indotte da anticorpi bispecifici nei tumori

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

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Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4- cellule T primarie.

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In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

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Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro (Video) | JoVE Journal

Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

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