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Medicine

Humanized माउस मॉडल में एचआईवी संक्रमण के खिलाफ स्टेम सेल आधारित इंजीनियर प्रतिरक्षण

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54048
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

एचआईवी के खिलाफ स्टेम सेल आधारित जीन चिकित्सा के तेजी से विकास के साथ, वहाँ hematopoietic भेदभाव और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की प्रतिरक्षा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक पशु मॉडल के लिए आवश्यकता दबाव डाल रहा है। humanized बोन मैरो / जिगर / थाइमस (बीएलटी) माउस मॉडल है जो टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं और monocytes शामिल परिधि में एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली, से भरा पुनर्गठन के लिए अनुमति देता है। मानव थाइमिक प्रत्यारोपण भी ऑटोलॉगस थाइमिक ऊतकों में टी कोशिकाओं की थाइमिक चयन के लिए अनुमति देता है। एचआईवी संक्रमण का अध्ययन करने के अलावा, मॉडल भेदभाव, विकास और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) से ली गई कोशिकाओं की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में खड़ा है। यहाँ हम humanized गैर-मोटे मधुमेह (इशारा) के निर्माण की रूपरेखा तैयार संयुक्त immunodeficient (एस.सी.आई.डी) -common गामा चेन पीटकर (ग γ - / -) -severe transduced एचएससी के साथ -Bone-मज्जा / जिगर / थाइमस (एनएसजी-बीएलटी) चूहों सीडी 4 रिसेप्टर कैमेरिक प्रतिजन के साथ (CD4CAR)lentivirus वेक्टर। हम बताते हैं कि CD4CAR एचएससी सफलतापूर्वक कई प्रजातियों में अंतर और एचआईवी रोधी गतिविधि हो सकती है। अध्ययन के लक्ष्य एचआईवी के खिलाफ इंजीनियर प्रतिरक्षा के लिए एक Vivo में मॉडल के रूप में एनएसजी-बीएलटी माउस मॉडल के उपयोग के प्रदर्शन करने के लिए है। यह ध्यान देने योग्य है कि, क्योंकि lentivirus और मानव ऊतक प्रयोग किया जाता है, प्रयोगों और सर्जरी एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) में विशेष सावधानी (BSL2 +) की सुविधा के साथ किया जाना चाहिए लायक है।

Introduction

संयुक्त एंटी-रेट्रोवायरल थेरेपी की सफलता के बावजूद, एचआईवी संक्रमण अभी भी एक आजीवन बीमारी है। एचआईवी के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एचआईवी प्रतिकृति को नियंत्रित करने में अत्यधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। स्टेम सेल हेरफेर में हाल के अग्रिमों जीन थेरेपी के तेजी से विकास के लिए अनुमति दी गई है एचआईवी उपचार 1-3 के लिए दृष्टिकोण। नतीजतन, यह एक उचित पशु मॉडल है कि एचआईवी के खिलाफ सेल आधारित चिकित्सा की प्रभावकारिता के vivo अध्ययन में अनुमति देता है के लिए महत्वपूर्ण है।

पशु मॉडल में एचआईवी के साथ कार्य तथ्य यह है कि वायरस केवल मानव कोशिकाओं को संक्रमित करता है से जटिल है। इस सीमा को नाकाम करने के लिए, वैज्ञानिकों रीसस मकाक 4,5 में सिमीयन इम्यूनो वायरस (SIV) जैसे रोग मॉडल का उपयोग करने के लिए सहारा है। दुर्भाग्य से, वहाँ प्रजातियों भर में निहित मतभेद और SIV और एचआईवी के बीच मतभेद के कारण इस मॉडल में प्रमुख सीमाएं हैं। इसके अतिरिक्त, केवल अति विशिष्ट सुविधाओं ग रहे हैंगैर मानव प्राइमेट और प्रत्येक मकाक के साथ काम करने का समर्थन करने का apable एक बड़े निवेश की आवश्यकता है। इस प्रकार, वहाँ है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली है, जो एचआईवी संक्रमण / रोगजनन की संभावना है इस्तेमाल करता है, और कम आर्थिक रूप से निषेधात्मक है एक मॉडल के लिए एक दबाने की जरूरत है।

(या एनएसजी) रक्त / एक महत्वपूर्ण उपकरण जिगर / थाइमस (बीएलटी) humanized माउस मॉडल तेजी से साबित हो रहा है गैर-मोटे मधुमेह (इशारा) संयुक्त immunodeficient (एस.सी.आई.डी) -common गामा चेन पीटकर - (- / सी γ) -severe एचआईवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए। Hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) और भ्रूण थाइमस दाखिल करके, चूहों को विकसित करने और एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को 1-3 पुनरावृत्ति करने में सक्षम हैं। स्टेम सेल आधारित जीन थेरेपी का एक प्रकार hematopoietic स्टेम सेल (एचएससी) reprogramming प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं में अंतर करने से एचआईवी निशाना बनाने के लिए 'पुनः निर्देशित' परिधीय टी कोशिकाओं शामिल है। हम पहले से पता चला है कि एक आणविक क्लोन विरोधी एचआईवी विशेष टी सेल के साथ पुन: इंजीनियरिंग एचएससीceptor (TCR) SL9 मिलान (अमीनो एसिड 77-85; SLYNTVATL) के खिलाफ एचआईवी -1 झूठ परिपक्व टी कोशिकाओं कि humanized एनएसजी-बीएलटी माउस मॉडल 6 में एचआईवी प्रतिकृति को दबाने के गठन में स्टेम कोशिकाओं अनुप्रेषित कर सकते हैं। एक आणविक क्लोन TCR का उपयोग करने की चेतावनी है कि यह एक विशिष्ट मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) उप प्रकार है कि इस थेरेपी के आवेदन को सीमित कर देगा करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है। Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर्स (सीएआर), दूसरे हाथ पर, सार्वभौमिक सभी एचएलए उपप्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। प्रारंभिक अध्ययन एक कार intracellular ζ CD3 के डोमेन के संकेत के लिए जुड़े हुए मानव सीडी 4 के बाह्य और transmembrane डोमेन के साथ निर्माण के उपयोग प्रदर्शन किया गया (CD4ζCAR कहा जाता है)। CD4ζCAR CD8 टी कोशिकाओं पर व्यक्त एचआईवी लिफाफा को समझते हैं और एक साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रिया है कि एक टी सेल रिसेप्टर 7 द्वारा मध्यस्थता के समान है ट्रिगर कर सकते हैं। हमने हाल ही में दिखा दिया है कि मानव एचएससी CD4ζCAR, जो तब कई hematopoietic ली में अंतर कर सकते के साथ संशोधित किया जा सकताneages, कार्यात्मक टी कोशिकाओं humanized माउस मॉडल 8 में एचआईवी प्रतिकृति को दबाने में सक्षम भी शामिल है। कैंसर के लिए 9 कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर उपचारों में तेजी से उन्नति, और शक्तिशाली व्यापक उदासीन एंटीबॉडी एचआईवी के खिलाफ 10-12 है कि एकल श्रृंखला एंटीबॉडी कारों के निर्माण की अनुमति के चल रहे लक्षण वर्णन के साथ, यह समझ योग्य है कि कई नए उम्मीदवार निर्माणों, CD4ζCAR के अतिरिक्त है , उत्पन्न होता है और एचआईवी रोग और अन्य बीमारियों के स्टेम सेल आधारित जीन थेरेपी के लिए परीक्षण किया जाएगा। इसके अलावा, humanized एनएसजी-बीएलटी माउस इन विशिष्ट प्रतिजन सीएआर युक्त मॉडल भी बारीकी से vivo में मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात है, हमारे प्रोटोकॉल बीएलटी चूहों कि एचएससी पतला प्रोटीन मिश्रण में भ्रूण जिगर चड्डी 16 के स्थान पर प्रयोग किया जाता है में 13-15 की humanized के निर्माण के लिए पिछले वर्णित विधि से अलग है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन: 1) हमानी के निर्माणजेड बीएलटी चूहों CD4ζCAR के साथ इंजीनियर; और 2) आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के भेदभाव के लक्षण वर्णन; और 3) आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की कार्यक्षमता की विशेषता।

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Protocol

नीति वक्तव्य: मानव भ्रूण ऊतक उन्नत बायोसाइंसेज संसाधन से या Novogenix से प्राप्त हुई थी और जानकारी की पहचान और इसके उपयोग के लिए आईआरबी अनुमोदन की आवश्यकता नहीं किया था के बिना प्राप्त हुई थी। पशु अनुसंधान इस पांडुलिपि में वर्णित सभी संघीय, राज्य के अनुसार, और स्थानीय दिशानिर्देशों में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स, और (यूसीएलए) पशु अनुसंधान समिति (एआरसी) की लिखित स्वीकृति के तहत किया गया था। विशेष रूप से, इन अध्ययनों की देखभाल और राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद की प्रयोगशाला पशु का प्रयोग करें और मान्यता और आकलन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल के प्रत्यायन (AALAC) के लिए एसोसिएशन के दिशा निर्देशों के लिए गाइड में दिशा-निर्देशों के अनुसार कड़ाई के तहत बाहर किया गया इंटरनेशनल यूसीएलए एआरसी प्रोटोकॉल संख्या 2010-038-02B के तहत। सभी सर्जरी ketamine / xylazine और isoflurane संज्ञाहरण के तहत किया गया था और सभी प्रयासों जानवर दर्द और परेशानी को कम करने के लिए किए गए थे।

1. Humanized चूहे का निर्माण सीडी 4 chimeric एंटीजन रिसेप्टर के साथ इंजीनियर

  1. भ्रूण थाइमस प्रसंस्करण और भ्रूण जिगर से CD34 + एचएससी अलग
    1. थाइमस प्रसंस्करण
      1. धीरे से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.4, में थाइमस धो लें। धो दोहराएँ चरण 3 - 4 बार।
      2. 7 मिलीलीटर RPMI मीडिया + 10% FBS + पेन / स्ट्रेप जोड़ें। एक बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश में सब कुछ छानना।
      3. के बारे में 1 मिमी 2 के छोटे टुकड़ों में थाइमस में कटौती करने की नलियां का प्रयोग करें। एक 96 अच्छी तरह से थाली पर एक भी अच्छी तरह से में हर एक थाइमस टुकड़ा रखें। का प्रयोग करें जब 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए थाइमस टुकड़े स्थानांतरित कुंद संदंश घुमावदार।
        1. कुओं के सभी के लिए - (200 μl 100) इतना है कि ऊतक सूखी नहीं करता है मीडिया की एक छोटी राशि जोड़ें। खुर्दबीन के नीचे कल्पना (thymi पालियों है और कोशिकाओं के बोरे की तरह दिखना चाहिए)।
          नोट: किसी भी टुकड़े कि किसी भी तरह से संदिग्ध लग त्यागें;वहाँ अक्सर संयोजी ऊतक है और इस प्रत्यारोपित नहीं किया जाना चाहिए।
      4. इस बात की पुष्टि-थाइमस टुकड़े निकालें और एक T25 सेल संस्कृति फ्लास्क में उन सभी के लिए जगह है। 7 मिलीलीटर RPMI मीडिया 10% FBS के साथ पूरक और पाइपेरासिलिन / tazobactam और amphotericin बी धीरे रॉक कुप्पी के 450 माइक्रोग्राम / एमएल मिश्रण करने के लिए जोड़ें। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 कुप्पी रात भर।
        नोट: यह कदम ऊतक के जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए आवश्यक है।
      5. (वैकल्पिक कदम) भविष्य में उपयोग के लिए थाइमस रुक। 10 मिनट के लिए 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के साथ 90% मानव अटल बिहारी सीरम में हिस्सा संतुलित करना। उन्हें -50 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से -150 डिग्री सेल्सियस के लिए तो तेजी से ठंडा करने में रुक। जब तैयार पिघलना करने के लिए, तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलना और धीरे DMSO के बिना RPMI पूरा मीडिया में 3x धो लें।
    2. लिवर प्रसंस्करण
      1. धीरे से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पीबीएस में जिगर धो लें। धो दोहराएँ चरण 3 - 4 बार।
      2. 10 मिलीलीटर (Iscove संशोधित Dulbecco के मीडिया) 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब IMDM मीडिया जोड़ें। एक 100 मिमी बाँझ पेट्री डिश में सब कुछ छानना।
      3. दो नलियां का उपयोग कर जिगर ऊतक homogenize। के बारे में 3 मिमी 2 के छोटे टुकड़ों में जिगर में कटौती। बाहर कट और किसी भी सफेद संयोजी ऊतक त्यागें।
      4. एक 16 गेज कुंद सुई के साथ लगे 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग जिगर के टुकड़े और मीडिया को लेने के लिए। तब एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण।
      5. धीरे मीडिया और ऊतक निलंबन resuspend और पूरी तरह से ऊतक homogenize करने के लिए 5-7 गुना अधिक निष्कासित।
      6. 10 मिलीलीटर IMDM मीडिया एंजाइमों के साथ पूरक तैयार: 500 यू / एमएल कोलेजिनेस, 2,400 यू / एमएल hyluronidase, और 300 यू / एमएल DNase के साथ ही 450 माइक्रोग्राम / एमएल पाइपेरासिलिन / tazobactam और amphotericin बी एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से मीडिया फिल्टर तो जिगर निलंबन के लिए मीडिया जोड़ें।
      7. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार जिगर निलंबन युक्त ट्यूब टोपी और ऐसे Parafilm टी के रूप में स्वयं सील फिल्म के साथ कसकर सीलओ लीक को रोकने के। 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक ट्यूब रोटेटर में बारी बारी से।
      8. एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पचा सेल निलंबन फ़िल्टर।
        नोट: निलंबन के लिए पीबीएस जोड़ें 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा को लाने के लिए। 50 मिलीलीटर ट्यूब के प्रत्येक सेल निलंबन के 25 मिलीग्राम से युक्त के दो ट्यूबों में इस विभाजन।
      9. और धीरे धीरे 10 मिलीलीटर घनत्व centrifugation मीडिया (जैसे, Ficoll) के साथ प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं बुनियाद। ब्रेक के बिना 20 मिनट के लिए 1,200 XG पर स्पिन। नोट: सभी centrifugation इस प्रोटोकॉल में उल्लेख कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर किया जाता है।
      10. ध्यान से दो अलग-अलग 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए प्रत्येक ट्यूब और हस्तांतरण से इंटरफेस (अर्थात्।, बफी कोट) को हटा दें। पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर के लिए इंटरफ़ेस के प्रत्येक ट्यूब की मात्रा लाओ। 10 मिनट - 7 के लिए 300 XG पर स्पिन। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला ध्यान से।
      11. दो छर्रों का मिश्रण। 50 मिलीलीटर पीबीएस 2% FBS युक्त के साथ तीन बार धोएं। 10 मीटर - 7 300 XG पर स्पिनप्रत्येक समय में जबकि ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirating।
      12. 50 मिलीलीटर RPMI मीडिया + 10% FBS में गोली Resuspend। सेल छँटाई करने के लिए आगे बढ़ने से पहले इस समय hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
      13. CD34 क्रमबद्ध + कोशिकाओं तुरंत CD34 छँटाई किट (उदा।, CD34 सूक्ष्म मोती), निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार इस्तेमाल करते हैं।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं RPMI मीडिया + 10% FBS में 1 लाख पर / रात भर संवर्धित किया जा सकता मिलीलीटर।
      14. सहेजें दोनों CD34 + और CD34- अंश।
        नोट: इस चरण में, CD34 + और CD34- कोशिकाओं Bambanker ठंड मीडिया या अन्य ठंड मीडिया का उपयोग कर जमा किया जा सकता है। 4 में से 1 मिलीलीटर रुक - ट्यूब प्रति 6 एक्स 10 6 CD34 + कोशिकाओं और 1 मिलीलीटर के 40 फ्रीज - ट्यूब प्रति 60 x 10 6 CD34- कोशिकाओं।
  2. CD34 + कोशिकाओं के पारगमन
    1. पारगमन एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के लिए जरूरी कुओं की संख्या की गणना। 1 अच्छी तरह से 8 x 10 6 कोशिकाओं के लिए ऊपर transduce के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के लियेप्रत्येक बीएलटी माउस, 0.5 x 10 6 CD34 + CD34- कोशिकाओं और गुर्दे कैप्सूल के नीचे थाइमस और 0.5 x 10 6 CD34 + कोशिकाओं के साथ साथ प्रत्यारोपित किया जाएगा नसों में इंजेक्शन दिया जाएगा। उपयोग करने के CD34 + कोशिकाओं की संख्या चूहों (माउस प्रति 1 लाख कोशिकाओं) की संख्या से निर्धारित होता है।
    2. कोट एक गैर टिशू कल्चर के कुओं की जरूरत नंबर पुनः संयोजक मानव fibronectin समाधान के 1.25 मिलीलीटर (उदा।, Retronectin) (20 माइक्रोग्राम / पीबीएस में एमएल) प्रत्येक में अच्छी तरह से साथ 6 अच्छी तरह से थाली का इलाज किया। प्लेट कवर और यह एक साफ जैव सुरक्षा कैबिनेट में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. कुओं से महाप्राण fibronectin समाधान और रोकने के लिए एक अच्छी तरह से FACS बफर (4% FBS के साथ पीबीएस) के 1.25 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेट 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर खड़ा करने के लिए अनुमति दें।
    4. महाप्राण FACS बफर और धोने कुओं एक बार पीबीएस के साथ।
    5. लेपित कुओं में पीबीएस रखें जब तक प्लेट इस्तेमाल के लिए तैयार है। 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर में रात भर अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं किया।
    6. Fibronectin समाधान लेपित कुओं में (Yssel के सीरम मुक्त टी-सेल के माध्यम में 2% मानव सीरम albumin) संक्रमण मध्यम में प्लेट CD34 + कोशिकाओं (~ 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. बीच (MOI) संक्रमण की बहुलता पर कुओं के लिए lentiviral वेक्टर जोड़ने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें 2 - 10 धीरे मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
      नोट: lentivirus इस्तेमाल किया वेक्टर के अनुमापांक पहले से निर्धारित किया जाना चाहिए।
    8. धीरे से एक सेल खुरचनी के साथ कुओं के नीचे scraping द्वारा अगली सुबह कोशिकाओं फसल। कोशिकाओं को इकट्ठा और इस समय hemocytometer के साथ गिनती।
    9. प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, बाँझ 1.5 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूबों में माउस, विभाज्य प्रति 4.5 x 10 6 CD34- कोशिकाओं के साथ 0.5 x 10 6 transduced CD34 + कोशिकाओं गठबंधन। , उन्हें गोली महाप्राण सतह पर तैरनेवाला 300 XG पर नीचे कोशिकाओं स्पिन। उन्हें 300 XG पर फिर से स्पिन और एक P10 पिपेट का उपयोग कर किसी भी शेष सतह पर तैरनेवाला aspirate और श्वास बहुत सीएrefully। अध्ययन के दौरान बर्फ पर सूखी छर्रों रखें। नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं व्यवहार्य हैं, pelleted कोशिकाओं का उपयोग करें और 2-3 घंटा के भीतर सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए।
    10. इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, माउस प्रति 0.5 x 10 6 transduced CD34 + कोशिकाओं स्पिन, उन्हें गोली महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। माउस प्रति 100 μl RPMI मीडिया में कोशिकाओं resuspend और बर्फ पर रख।
    11. पारगमन दक्षता की जांच करने के लिए, विभाज्य ~ 1 x 10 5 गैर transduced और हर हालत और 200 μl साइटोकाइन मध्यम (10% FBS के साथ RPMI मीडिया में संस्कृति से CD34 + कोशिकाओं transduced, साथ पूरक 100 एनजी / एमएल मानव आईएल -3, आईएल -6 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिन - 5 के लिए 96 अच्छी तरह से थाली में एससीएफ)।
      नोट: लेकिन है कि पारगमन सुनिश्चित करने के लिए इस चरण में इस्तेमाल किया कोशिकाओं सर्जरी के लिए इस्तेमाल नहीं किया है सफल रहा है और वेक्टर स्टेम सेल अस्तित्व और नवीकरण के लिए विषाक्त नहीं है। पारगमन दक्षता वेक्टर के जीन की अभिव्यक्ति के लिए देख द्वारा जाँच की जा सकता है (उदाहरण के लिए।, GFP और सीडी 4) और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण।
  3. ऊतक प्रत्यारोपण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का निर्माण करने के लिए
    1. उसी दिन सर्जरी से पहले एक सीज़ियम -137 Irradiator और 2.7 Gy (270Rad) की एक खुराक के साथ NOD.Cg- Prkdc एस.सी.आई.डी Il2rg टी m1Wjl / SzJ (एनएसजी) इम्युनो-समझौता चूहों के शरीर के कुल विकिरण प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: एनएसजी चूहों गंभीर रूप से प्रतिरक्षा में अक्षम हैं। इसलिए उनके आवास और रखरखाव के उच्चतम स्वास्थ्य मानक के अनुरूप है और उच्च प्रशिक्षित कर्मचारियों द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    2. एक 60 मिमी डिश में कुप्पी से थाइमस टुकड़े और मध्यम डालो। एक और 60 मिमी पकवान है, जो trochar साफ और गुर्दे गीला रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में पीबीएस डालो।
    3. बर्फ पर खुला 1.5 मिलीलीटर बाँझ पेंच टोपी ट्यूबों में उन्हें रखने के द्वारा सकारात्मक विस्थापन विंदुक युक्तियाँ शांत रहो। सूखे सेल छर्रों और इस तरह के रूप में Matrigel पतला प्रोटीन मिश्रण के साथ बर्फ पर रखें।
      नोट: यह पतला प्रोटीन मिश्रण है और किसी भी नलियों या सुझाव रखने के लिए महत्वपूर्ण है कियह सब समय में ठंड को छू जाएगा जब तक प्रत्यारोपण सुई भरी हुई है।
    4. चूहों anesthetize: व्यक्तिगत रूप से चूहों और रिकॉर्ड वजन तौलना; कान उन्हें नंबर करने के लिए चूहों पंच। उन्हें अक्स के 15 μl (खारा में 2.6 मिलीग्राम / एमएल) / xylazine शरीर के वजन के प्रति ग्राम (100 मिलीग्राम / खारा में एमएल)) के साथ intraperitoneally इंजेक्षन। चूहों पिंजरे में वापस डाल दिया है और इसके लिए पूरी तरह से anesthetized जा करने के लिए प्रतीक्षा करें।
      ध्यान दें: एक पंजा फैलाएंगे द्वारा माउस के संज्ञाहरण के स्तर की जाँच करें। माउस reflexively flinches हैं, तो आगे के लिए माउस को anesthetize अक्स / xylazine की मूल राशि का 25-50% प्रशासन। रुको जब तक यह reflexively सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए विमुख होना नहीं है।
    5. Oster क्लिपर (शेवर) का उपयोग करना, पीठ और पेट के केंद्र के बीच कंधे से कूल्हे से प्रत्येक माउस के बाईं ओर दाढ़ी। Subcutaneously जानवर के कंधे या वंक्षण त्रिकोण (पैर गड्ढे) में पतला Carprofen (6 मिलीग्राम / किग्रा) के 0.3 मिलीलीटर इंजेक्षन। एक कपास झाड़ू का उपयोग करना, कृत्रिम आँसू की एक छोटी सी बूंद डालहर आंख पर और अपने पक्ष पर माउस पिंजरे में वापस करना।
      नोट: - एक समय में (5 चूहों लगभग 4) एक पिंजरे में सीमा सर्जरी प्रस्तुत करने का।
    6. 16 गेज कैंसर प्रत्यारोपण सुई (trocar) पीबीएस के साथ की प्रवेशनी फ्लश। कुंद घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, बस खोलने के अंदर trocar साथ प्रवेशनी के उद्घाटन में 60 मिमी पकवान से थाइमस का एक टुकड़ा जगह है, तो trocar पर वापस खींचने प्रवेशनी में ऊतक निकालना।
    7. एक सूखे सेल गोली (प्रत्यारोपित कोशिकाओं के लिए CD34 + और CD34- मिश्रण) के साथ ट्यूब में ठंड पतला प्रोटीन मिश्रण के 5 μl रख दिया और धीरे सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए हलचल करने के लिए एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट और एक ठंडा टिप का उपयोग करें। विंदुक ऊपर और नीचे मत करो। प्रवेशनी के उद्घाटन में पतला प्रोटीन मिश्रण / सेल निलंबन पिपेट और धीरे धीरे सुई लोड करने के लिए trocar पर वापस खींच।
      नोट: यह पिपेट लोड करने के लिए एक manipulates जबकि प्रत्यारोपण सुई एक सहायक की सिफारिश की है।
      8. <li> Povidone आयोडीन के साथ माउस का मुंडा क्षेत्र झाड़ू और बाद में एक शराब के साथ क्षेत्र में तीन बार नीचे पोंछ साफ कर लें। त्वचा के नीचे अंधेरी जगह निर्धारित करते हैं। इस तिल्ली के स्थान को इंगित करता है। गुर्दे लगभग 5 मिमी तिल्ली के लिए पृष्ठीय है। घुमावदार संदंश के साथ त्वचा उठा और तिल्ली के लिए त्वचा समानांतर में शल्य कैंची के साथ एक 15 मिमी लंबा चीरा बनाते हैं। तब पेरिटोनियम में एक समान कटौती परत के नीचे हैं। पुरुषों में, गुर्दे आसानी से दिखाई जानी चाहिए, और पेट पर दबाव द्वारा बस निकाला जा सकता है। आप एक hemostat या घुमावदार कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ गुर्दे का समर्थन कर सकते हैं। महिलाओं में, अंडाशय आसान निकासी से गुर्दे को ब्लॉक करने के लिए करते हैं। एक hemostat का प्रयोग, अंडाशय लेने के लिए और ध्यान से गुर्दे बाहर बेनकाब।
    8. गुर्दे कैप्सूल के पीछे अंत में एक छोटे से छेद बांधना सुई इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें।
      नोट: Biohazard सामग्री को संभालने के लिए इन सुई इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग न करें।
    9. प्रत्यारोपण स्लाइडइस छेद में और गुर्दे के साथ सुई तक प्रवेशनी के उद्घाटन के लिए पूरी तरह से गुर्दे कैप्सूल द्वारा कवर किया जाता है।
    10. धीरे गुर्दे कैप्सूल के तहत ऊतक बाहर निकालना, और सुई बाहर वापस खींच। थाइमस टुकड़े इतने बनाने के लिए एक घुमावदार संदंश का उपयोग सुनिश्चित करें थाइमस टुकड़ा सुई के साथ बाहर नहीं आती है चिपचिपा हो सकता है।
    11. संदंश के साथ पेरिटोनियम उठा और धीरे hemostat का उपयोग गुर्दे की जगह में वापस धक्का। पेरिटोनियम 4-0 vicryl absorbable sutures का उपयोग करने में एक डबल-knotted सिलाई बाँधो। दो autoclips घाव क्लिप का प्रयोग त्वचा बंद हुआ।
    12. Transduced CD34 + कोशिकाओं है कि इंजेक्शन के लिए अलग सेट कर रहे थे मिलाएं और एक इंसुलिन सिरिंज में 100 μl (0.5x10 6 कोशिकाओं) तेज। retroorbital नस इंजेक्शन या नसों में इंजेक्शन के अन्य मार्गों के माध्यम से माउस में इन कोशिकाओं इंजेक्षन। एक कपास झाड़ू का उपयोग करना, कृत्रिम आँसू की एक छोटी सी बूंद हर आंख पर माउस अपने पक्ष पर वापस एक पिंजरे में डाल दिया है और लेट गई।
    13. एक बार सभी चूहों ख हैeen प्रत्यारोपित, इस बात की पुष्टि है कि जानवरों चेतना वापस आ रहा है और उन्हें छोड़ने से पहले सामान्य रूप से ambulating रहे हैं।
    14. पोस्ट-परिचालन की देखभाल: दिन सर्जरी के बाद, subcutaneously प्रत्येक माउस में बाँझ खारा का पतला Carprofen (6 मिलीग्राम / किग्रा) के 0.3 मिलीग्राम और 1.2 मिलीलीटर इंजेक्षन। 2 और 3 दिन बाद सर्जरी, subcutaneously प्रत्येक माउस में बाँझ खारा के 1.5 मिलीलीटर इंजेक्षन। चूहों और सर्जरी के बाद 10-14 दिनों के लिए चीरों मॉनिटर। Autoclips निकालें और 10-14 दिनों के बाद चूहों का वजन। नोट: के बाद विकिरण और खारा के इंजेक्शन निर्जलित बनने से रोकता है जानवरों चूहे सुस्त हैं।
    15. 8 के बाद - 10 सप्ताह, चूहों खून बह रहा है और परिधीय रक्त पर FACS विश्लेषण प्रदर्शन, इस तरह के CD45, CD3, सीडी 4, सीडी 8, और किसी भी जीन वेक्टर व्यक्त करना चाहिए के रूप में मार्करों के लिए धुंधला द्वारा engraftment की जाँच करें।

2. भेदभाव की विशेषता और जीन संशोधित कोशिकाओं के विकास

  1. की विशेषतापरिधीय रक्त से जीन संशोधित प्रकोष्ठों
    1. 8 - रेट्रो कक्षीय खून से माउस रक्त के 100 μl - 10 सप्ताह प्रत्यारोपण के बाद, 50 प्राप्त करते हैं। microcentrifuge EDTA के 10 μl युक्त ट्यूबों में रखें। 3 मिनट के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। प्लाज्मा लीजिए। एलिसा विश्लेषण या प्लाज्मा वायरल लोड परख के लिए -80 पर रुक अगर माउस एचआईवी संक्रमित है।
    2. 2 मिलीलीटर एनएच 4 सीएल (83%) समाधान लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए जोड़ें। कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, 10 मिलीलीटर RPMI 10% FBS जोड़ने ट्यूब को भरने के लिए। 5 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला ध्यान से। प्रकोष्ठों इम्युनो-धुंधला के लिए तैयार कर रहे हैं और विश्लेषण और अन्य assays प्रवाह cytometry।
      नोट: विभिन्न hematopoetic सेल प्रजातियों, सक्रियण, और भोले या स्मृति कोशिकाओं के लिए प्ररूपी मार्करों के लिए मार्कर हर 2 सप्ताह के पहले और प्रवाह cytometry द्वारा एचआईवी संक्रमण के बाद मापा जा सकता है। गेट्स निर्धारण नियंत्रण के साथ कोशिकाओं को धुंधला द्वारा बनाई गई हैं। यह healt दाग की सिफारिश की हैहरियाणा मानव PBMCs और उपयोग करें कि के रूप में सकारात्मक नियंत्रण। वैकल्पिक रूप से, माउस euthanized जा सकता है और परिधीय रक्त की अप करने के लिए 1 मिलीलीटर कार्डियक पंचर जो प्रवाह विश्लेषण 17 के कई पैनलों के लिए पर्याप्त कक्षों प्रदान करेगा से प्राप्त किया जा सकता है।
  2. प्लीहा, थाइमस और अस्थि मज्जा से जीन की विशेषता संशोधित प्रकोष्ठों
    1. हार्वेस्ट प्लीहा, थाइमस और humanized बीएलटी चूहे से अस्थि मज्जा
      1. isoflurane की अधिक मात्रा का उपयोग करके चूहों euthanize। माध्यमिक ग्रीवा अव्यवस्था के साथ इच्छामृत्यु की पुष्टि करें। 70% इथेनॉल के साथ शव की सतह स्प्रे ऊतकों से चिपके हुए फर रखने के लिए। एक मोम विच्छेदन ट्रे पर अंग नीचे पिन।
      2. शल्य कैंची का प्रयोग करें, कट त्वचा को खोलने, और फिर शरीर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए पेरिटोनियल परत के माध्यम से कटौती।
      3. संदंश का उपयोग तिल्ली निकालें। गुर्दे संदंश और कैंची का उपयोग करने पर थाइमिक प्रत्यारोपण निकालें। लेबल नलियों conta में थाइमिक प्रत्यारोपण और तिल्ली रखोining पीबीएस के 5 मिलीलीटर।
      4. मध्य पेट में कटौती और निचले अंगों को कवर करने के लिए माउस के बाहर का भाग से त्वचा को हटाने से।
      5. कैंची का उपयोग कम extremities से मांसपेशियों को काट दिया और ध्यान से कूल्हे से ऐसीटैबुलम हटाना। फीमर और टिबिया निकालें और उन्हें एक ट्यूब पीबीएस के 5 मिलीलीटर युक्त में जगह है।
    2. Splenocytes का अलगाव
      1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 100μm सेल झरनी रखें। 10% FBS और पेन / स्ट्रेप (RPMI पूरा मीडिया) के साथ पूरक RPMI मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ झरनी गीले।
      2. सेल झरनी पर तिल्ली रखें। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का रबर सवार का प्रयोग, झरनी के माध्यम से इसे अलग कर देना करने के लिए 50 मिलीलीटर ट्यूब में तिल्ली मैश।
      3. 5 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया 4 से 5 बार के साथ सेल झरनी कुल्ला।
      4. 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
      5. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 5 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका lysis बफर में resuspend गोली। कमरे तापमान पर सेते10 मिनट के लिए संरचना। 7 मिनट के लिए 300 XG पर 20 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया और स्पिन जोड़ें।
      6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 10 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया में resuspend गोली और एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिर से फिल्टर। hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
        नोट: प्रकोष्ठों, पूर्व vivo assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रवाह विश्लेषण और viably बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है। सेल गिनती से पहले, Trypan नीले व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. प्रत्यारोपण से मानव thymocytes का अलगाव
      1. पीबीएस के 5 मिलीलीटर में थाइमस एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में रखें। का उपयोग करते हुए साफ कुंद संदंश और कैंची छोटे टुकड़ों में थाइमस काटा।
      2. अच्छी तरह से में एक निष्फल स्टेनलेस स्टील के जाल वर्ग रखें। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का रबर सवार का प्रयोग, थाइमस अलग तोड़ने के लिए स्टेनलेस स्टील के जाल पर थाइमस टुकड़े मैश।
      3. एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से अच्छी तरह से और तनाव कोशिकाओं Resuspend। 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन।10 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया में कोशिकाओं को निलंबित। झुरमुटों दिखाई दे रहे हैं, तो फिर एक सेल झरनी के माध्यम से resuspended कोशिकाओं से गुजरती हैं।
      4. hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
        नोट: कोशिकाओं प्रवाह विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और viably बाद में उपयोग के लिए जमे हुए।
    4. अस्थि मज्जा से कोशिकाओं के अलगाव
      1. स्वच्छ और बाँझ मोर्टार और 70% इथेनॉल के साथ मूसल। फीमर और मोर्टार में टिबिअ रखें। ठंड पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। हड्डियों को कुचलने के लिए जब तक पीबीएस हल्के गुलाबी और बादल बदल जाता मूसल का प्रयोग करें।
      2. एक 50 माइक्रोन सेल एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर रखा झरनी के माध्यम से मोर्टार और फिल्टर से तरल पदार्थ को पिपेट। 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ मोर्टार से धो लें और जब तक पीबीएस स्पष्ट हो जाता है पाँच बार दोहराएँ।
      3. 7 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन कोशिकाओं। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 10 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया में resuspend।
      4. hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
        नोट: कोशिकाओं पूर्व vivo assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रवाह विश्लेषण और viably जमे हुए च हो सकता हैया बाद का उपयोग करें।

3. जीन संशोधित कोशिकाओं के कार्यात्मक विशेषता

  1. एचआईवी संक्रमण और वायरल प्रतिकृति समय ओवर की निगरानी
    1. मानव प्रतिरक्षा प्रणाली पुनर्गठन की पुष्टि के बाद, रेट्रो कक्षीय नस एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग इंजेक्शन के माध्यम से एचआईवी वायरस के वांछित राशि इंजेक्षन। एचआईवी संक्रमण के बाद, रेट्रो कक्षीय हर 2 सप्ताह खून बह रहा है के माध्यम से 100 μl परिधीय रक्त इकट्ठा।
    2. 2.1.2 - फसल काटने वाले हिस्से 2.1.1 में चरणों का पालन करके प्लाज्मा। एचआईवी वायरल लोड परख के लिए, निर्माता अनुदेश के अनुसार शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर निकालने वायरल शाही सेना और 4,8,18,19 इस्तेमाल किया एचआईवी वायरस के लिए उपयुक्त प्राइमर और जांच सेट के साथ वास्तविक समय आरटी पीसीआर द्वारा वायरल लोड उपाय।
    3. सेल जुड़े एचआईवी आरएनए मापने के लिए और कोशिकाओं है कि सक्रिय रूप से एचआईवी से संक्रमित हैं की पहचान करने के लिए, पहला कदम 2.1.2 निम्नलिखित आरबीसी सेल प्रदर्शन
    4. 1 में Resuspend सेल निलंबन; मिलीलीटर पीबीएस, दो ट्यूबों में समान रूप से विभाजित। 5 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
    5. सेल जुड़े आरएनए मापने के लिए, निर्माता अनुदेश के अनुसार शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर और उचित प्राइमर और जांच सेट का उपयोग कर वास्तविक समय आरटी पीसीआर प्रदर्शन आरएनए निकाल सकते हैं।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि प्राइमर / जांच स्टेम कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल lentivirus नहीं पहचानता है
    6. एचआईवी प्रवाह से संक्रमित कोशिकाओं को मापने के लिए, 50 μl FACS में अन्य ट्यूब में resuspend कोशिकाओं बफर और इस तरह के विरोधी CD45, विरोधी सीडी 4 और विरोधी CD3 के रूप में वांछित एंटीबॉडी के साथ सतह दाग प्रदर्शन करते हैं। सतह दाग के बाद, ठीक है और विरोधी चुप एंटीबॉडी (क्लोन KC57) का उपयोग कर झूठ अभिव्यक्ति के लिए intracellularly कोशिकाओं और दाग permeabilize। फ्लो का प्रदर्शन करते हैं।
  2. जीन के पूर्व vivo साइटोकाइन परख Splenocytes से संशोधित प्रकोष्ठों
    1. चूहों से फसल splenocytes धारा 2.2.2 में वर्णित है।
    2. लक्ष्य कोशिकाओं को तैयार है। कार्यात्मक परीक्षण करने के लिएसीडी 4 रिसेप्टर कैमेरिक प्रतिजन संशोधित टी कोशिकाओं की अल्पसंख्यक, लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में एचआईवी संक्रमित T1 कोशिकाओं का उपयोग करें। , साइटोकाइन परख करने के लिए एचआईवी के साथ टी 1 कोशिकाओं को संक्रमित 3 दिन पहले विरोधी एचआईवी चुप एंटीबॉडी (क्लोन KC57) के साथ intracellularly कोशिकाओं धुंधला द्वारा एचआईवी संक्रमण की पुष्टि करें। नियंत्रण लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में असंक्रमित टी 1 कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    3. रात भर 1: 1 के अनुपात में सह-सेते लक्ष्य या नियंत्रण कोशिकाओं के साथ splenocytes। सबसे अच्छा परिणाम के लिए, एक अनुमापन बाहर ले जाने के (1: 1: 1, 3, 1: 9) प्रेरक की (splenocytes) लक्ष्य कोशिकाओं बनाम (संक्रमित T1s)। उदाहरण के लिए, 0.25 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया में 0.9 मिलियन splenocytes resuspend, 0.25 मिलीलीटर RPMI पूरा मीडिया में resuspended 0.9, 0.3 या 0.1 मिलियन संक्रमित T1 या असंक्रमित T1s जोड़ें।
    4. 6 घंटे प्रोटीन परिवहन को बाधित और बाह्य मार्करों और के रूप में 8 में पहले से वर्णित साइटोकिन्स के intracellular अभिव्यक्ति के लिए धुंधला हो जाना प्रदर्शन करने के लिए अगली सुबह, प्रोटीन परिवहन अवरोध जोड़ें।

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Representative Results

चित्रा 1 संशोधित स्टेम सेल के साथ humanized बीएलटी चूहों के निर्माण की एक रूपरेखा से पता चलता है। 10 सप्ताह प्रत्यारोपण सर्जरी के बाद, चूहों भेदभाव और जीन संशोधित कोशिकाओं के विकास का मूल्यांकन करने के लिए बलिदान किया गया। चित्रा 2 में दिखाया गया है, कई लसीकावत् ऊतकों (रक्त, तिल्ली, थाइमस और अस्थि मज्जा) एक माउस है कि CD4ζCAR के साथ संशोधित किया गया था से काटा गया। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल CD4ζCAR सीडी 4 रिसेप्टर कैमेरिक प्रतिजन और GFP कि विरोधी सीडी 4 एंटीबॉडी और GFP 8 की अभिव्यक्ति से पता लगाया जा सकता है। कोशिकाओं को अलग और मानव CD45 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ ही विरोधी CD4 एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। GFP और सीडी 4 डबल सकारात्मक कोशिकाओं का पता चला रहे थे, कई लसीकावत् ऊतकों में CD4CAR + कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है।

जीन संशोधित कोशिकाओं के भेदभाव की जांच करने के लिए, splenocytes मानव CD45 (लिम्फोसाइट), CD3 (टी कोशिकाओं), CD19 (बी कोशिकाओं), CD14 (monocyte और मैक्रोफेज) और CD337 (एन.के. कोशिकाओं) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, CD4ζCAR hematopoietic स्टेम कोशिकाएं कई प्रजातियों में अंतर है।

यदि CD4CAR संशोधित कोशिकाओं कार्य कर रहे हैं की जांच करने के लिए, हम लक्ष्य कोशिकाओं है कि CD4CAR कोशिकाओं (एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं T1 या नियंत्रण के रूप में असंक्रमित T1 कोशिकाओं) को मान्यता देंगे साथ splenocytes coincubated। प्रकोष्ठों रात भर सह-incubated रहे थे और प्रोटीन परिवहन अवरोध एक अतिरिक्त 6 घंटे के लिए जोड़ा गया है। बाद में, कोशिकाओं को ठीक किया और IFNΓ और TNFα के रूप में साइटोकिन्स के intracellular अभिव्यक्ति के लिए दाग permeabilized थे। के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, कार व्यक्त कोशिकाओं को संक्रमित कोशिकाओं के साथ T1 IFNΓ और TNFα की उच्च राशि का उत्पादन किया।

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चित्रा 1:। भ्रूण थाइमस: के संशोधित स्टेम कोशिकाओं के साथ humanized बीएलटी चूहों के निर्माण एफटी को रेखांकित करें। फ्लोरिडा:। भ्रूण जिगर यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। सीडी 4 रिसेप्टर कैमेरिक प्रतिजन संशोधित कोशिकाओं CD4CAR संशोधित एचएससी के साथ माउस कई लसीकावत् ऊतकों में पता लगाया जा सकता सर्जरी और कई लसीकावत् ऊतकों के बाद 10 सप्ताह बलिदान किया गया काटा गया और कोशिकाओं विरोधी मानव CD45 और विरोधी मानव सीडी 4 एंटीबॉडी के साथ दाग थे और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।


चित्रा 3:।। CD4 कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर संशोधित कोशिकाएं कई प्रजातियों में अंतर कर सकते CD4CAR संशोधित चूहों से Splenocytes काटा गया और मानव CD45, CD3, CD19, CD14 और CD337 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह से विश्लेषण cytometry यहाँ एक बड़ा देखने के लिए क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4:। CD4 कार + टी कोशिकाओं के पूर्व vivo साइटोकाइन परख एचआईवी से संक्रमित Splenocytes CD4CAR चूहों या तो एचआईवी संक्रमित या असंक्रमित टी 1 कोशिकाओं और साइटोकाइन का उनके intracellular उत्पादन दिखाया गया है साथ प्रेरित किया गया। होड़ करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

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Discussion

कार और नैदानिक ​​अध्ययन की दिशा में एचएससी आधारित इंजीनियर प्रतिरक्षा को गति प्राप्त कर रहा है, यह एक उचित पशु मॉडल बारीकी से भेदभाव और इन इंजीनियर कोशिकाओं के समारोह की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में हम निर्माण और आनुवंशिक रूप से संशोधित स्टेम कोशिकाओं को एचआईवी के खिलाफ इंजीनियर के साथ humanized चूहों के परीक्षण के लिए तरीकों का वर्णन किया। यह प्रत्यारोपण के लिए पहले स्टेम कोशिकाओं के कुशल पारगमन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, टी सेल की क्षमता लक्ष्य कोशिकाओं की मान्यता पर पैदा करने के लिए की वजह से, स्टेम सेल संशोधन के निम्न स्तर एचआईवी प्रतिकृति 8 के खिलाफ एक मजबूत प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त थे।

बहरहाल, स्टेम सेल संशोधन के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए, हम ऑटोलॉगस बजाय थाइमस जिगर और चूहों सर्जरी के लिए थाइमस हिस्सा है कि कहीं और 13-15 में वर्णित किया गया था के साथ पतला प्रोटीन मिश्रण में transduced CD34 + कोशिकाओं का उपयोग करना चाहिये। पतला प्रोटीन मिश्रण एक solubiliz हैएड ऊतक तहखाने झिल्ली बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन में समृद्ध है। सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, पतला प्रोटीन मिश्रण को एक पुनर्गठन, जैविक रूप से सक्रिय और स्थिर मैट्रिक्स है कि स्टेम सेल 20 के प्रभावी लगाव और भेदभाव की अनुमति होगी उत्पादन करने के लिए भाजन। मानव कोशिका पुनर्गठन रेट्रो कक्षीय खून बह रहा द्वारा जाँच की जा सकती है और cytometry 6 प्रवाह - 8 सप्ताह के बाद सर्जरी। कि वेक्टर स्टेम सेल अस्तित्व और नवीकरण के लिए विषाक्त नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए, यह 1.2.6 में वर्णित के रूप में प्रयोग करने से पहले CD34 + कोशिकाओं में वेक्टर अनुमापांक की सिफारिश की है।

एनएसजी-बीएलटी माउस मॉडल की क्षमता श्लैष्मिक संक्रमण, लगातार viremia और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का समर्थन करने के लिए यह एचआईवी प्रतिरक्षा विकृति और सेल आधारित चिकित्सा अध्ययन करने के लिए एचआईवी संक्रमण के इलाज के लिए 1 एक बेहद उपयोगी मॉडल बनाता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, एनएसजी-बीएलटी चूहों से उत्पन्न टी कोशिकाओं ऑटोलॉगस थाइमिक ऊतकों में चयन किया जाता है, भाग्य का अध्ययन करने के शोधकर्ता की इजाजत दीथाइमिक चयन 8,21 के बाद जीन संशोधित स्टेम कोशिकाओं की। वर्णित विधि के साथ, हम लगातार 40% -90% मानव प्रतिरक्षा सेल पुनर्गठन प्राप्त करने में सक्षम हो गया है। मानव कोशिका पुनर्गठन के निम्न स्तर व्यक्ति सर्जरी और प्रत्यारोपण के लिए ऊतकों की गुणवत्ता का प्रदर्शन करने में कौशल सहित कई कारकों से परिणाम कर सकते हैं। मानव कोशिका पुनर्गठन के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए, यह प्रत्यारोपण सुरक्षित रूप से गुर्दे कैप्सूल के नीचे रखा जाता है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह अत्यधिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सर्जरी के लिए तैयार प्रत्येक थाइमिक प्रत्यारोपण की जांच करने और किसी भी संदिग्ध टुकड़े त्यागने के लिए सिफारिश की है।

हालांकि humanized बीएलटी माउस मॉडल एचआईवी के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता इंजीनियर (1,15,22 में समीक्षा) के अध्ययन के लिए एक आशाजनक उपकरण है, यह अपने आप सीमाएँ हैं। अर्थात्, इस मॉडल को पूरी तरह एक मानव परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की नकल नहीं है। अध्ययन हाइपर-उत्परिवर्तित, वर्ग-स्विच्ड आईजीजी antibo का बिगड़ा विकास से पता चला हैवि 1,23। इसके अतिरिक्त, प्रतिरक्षा की कमी चूहों का उपयोग करते हुए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और इन चूहों को स्वस्थ रखने के काफी संसाधन और प्रशिक्षण की आवश्यकता है। सूक्ष्म अवसरवादी संक्रमण के नमूने भर में महत्वपूर्ण के रूप में मतभेदों को प्रकट करने और संभावित प्रयोग पर नकारात्मक परिणाम हो सकते हैं। इसलिए यह अच्छी तरह से तैयार की सुविधा और उचित रूप से प्रशिक्षित कर्मचारियों की भविष्य में डेटा 1,24 की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। मन में इन सीमाओं के साथ, humanized एनएसजी-बीएलटी माउस मॉडल अभी भी स्टेम सेल आधारित इंजीनियर प्रतिरोधक क्षमता के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, क्योंकि ये उदाहरण 4,8 द्वारा प्रदर्शन किया है प्रदान करता है।

कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स के विकास की प्रवृत्ति एचआईवी व्यापक आधार पर एंटीबॉडी 10 और अधिक कुशल कार 25 संकेतन डोमेन के संशोधन को निष्क्रिय करने के साथ, इस मॉडल और प्रोटोकॉल विशेषताएँ और जीन संशोधित सेल की कार्यक्षमता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताकारों की एक नई पीढ़ी के साथ रास। इसके अलावा, इस मॉडल संभावित इंजीनियर उन्मुक्ति के साथ संयोजन के रूप में (जैसे निरोधात्मक रिसेप्टर नाकाबंदी के रूप में) प्रतिरक्षा आधारित चिकित्सा पर अध्ययन समायोजित कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 microbead kit Miltenyi 130-046-702 For sorting human CD34+ progenitor cells
Bambanker Wako 302-14681 For freezing cells
QIAamp Viral RNA kit  Qiagen 52904 For measuring viral load in the serum
MACSQuant Flow Cytometer Miltenyi For flow analysis
BD LSRFortessa™ BD biosciences For flow analysis
Hyaluronidase Sigma H6254-500MG  For tissue digestion
Deoxyribonuclease I       Worthington LS002006  for tissue digestion
Collagenase Life technology 17104-019  for tissue digestion
CFX Real time PCR detection system Biorad For measuring viral load and gene expression
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Thermo Fisher Scientific 10378016 For culturing cells
Piperacillin/tazobactam Pfizer Zosyn Anti-fungal
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) Thermo Fisher Scientific 15290-018 Anti-fungal
Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units Becton Dickinson 427631  For surgery
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case       Medline DYNJP2707  For surgery
Sutures, 4-0, vicryl           Owens and Minor 23000J304H   For surgery
Alcohol prep pads           Owens and Minor 3583006818 For surgery
Gloves, surgical, 6 1/2 Owens and Minor 4075711102 For surgery
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium Gemini Bio-products 400-102 For CD34+ cell transduction
Human Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9511 For CD34+ cell transduction

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References

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चिकित्सा अंक 113 Humanized बीएलटी माउस chimeric प्रतिजन रिसेप्टर एचआईवी गैर-मोटे मधुमेह मानव ल्युकोसैट प्रतिजन hematopoietic स्टेम सेल
Humanized माउस मॉडल में एचआईवी संक्रमण के खिलाफ स्टेम सेल आधारित इंजीनियर प्रतिरक्षण
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Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, J., Lam, B., Chang, N., Zack, J., Kamata, M., Kitchen, S. Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (113), e54048, doi:10.3791/54048 (2016).

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