Introduction
Om de voedingsstoffen die nodig zijn om te overleven verkrijgen maligne tumoren is toegang tot de bloedstroom van de patiënt. Die toegang krijgen tumorcellen vrijkomen chemische signalen die de groei van nieuwe bloedvaten te stimuleren om de tumor, waardoor kaping het normale fysiologische proces dat angiogenese 2. Het is ook via de bloedvaten aangemaakt via angiogenese dat metastase (dat wil zeggen de verspreiding van kanker naar andere organen) optreden. Omdat het proces van angiogenese is zo belangrijk om de progressie van een dergelijke grote verscheidenheid aan kankers, is een aantrekkelijk doel in antikanker therapie onderzoek 3.
Eén methode gebruikt om angiogenese te kwantificeren het vermogen van de endotheliale progenitor cel buizen vormen meten wanneer geplaatst op een extracellulaire matrix. Vanwege de vorming van deze buizen is een belangrijke eerste stap in angiogenese, testing omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld aan- of afwezigheid van een bepaald compound), die kunnen stimuleren of remmen de vorming van de buis geeft inzicht in de specifieke stappen die kunnen worden gericht op angiogenese te remmen. De endotheelcel buisvorming assay is een van de meest gebruikte 4 in vitro werkwijzen die de cellen in staat buizen te vormen meet. Het is een eenvoudige test, die weinig componenten en een korte kweekperiode 5. Misschien nog belangrijker is echter dat de opgedane dergelijke analysegegevens meetbaar.
Een voorbeeld van het gebruik van de vaatvorming bepaling omvat het vergelijken van de ontwikkeling van buizen uit vasculaire endotheelcellen gekweekt op extracellulaire matrix vs. groeifactor verlaagd (GFR) extracellulaire matrix. De extracellulaire matrix is een basale membraan-materiaal geïsoleerd uit cellen en sarcoom belangrijkste componenten laminine, type IV collageen, groeifactoren en proteoglycanen. Enkele verbindingen hebben verschillende effecten op het vermogen van de cel om buizen te vormen wanneer ineen door verlaging groeifactoren en verminderde heparansulfaatproteoglycanen (HSPG). HSPGs zijn een component van de extracellulaire matrix die aanzienlijk GFR extracellulaire matrix wordt verminderd. Als voorbeeld, indien de hypothese dat angiogenese remmers, zoals SB225002, welke blokken het CXCR2 receptor aanzienlijk zwakker vermogen vaatvorming als HSPGs overvloedig onderbreken, dan een vergelijking tussen buisvorming activiteit in de extracellulaire matrix en GFR extracellulaire matrix belang in het verkennen van de mogelijkheid van angiogenese remming via de controle van HSPGs.
Andere tests die vaak worden gebruikt om de effecten van verbindingen op angiogenese te bepalen in vivo. Bekende voorbeelden hiervan zijn de chick chorion-membraan (CAM) assay 6 met behulp van kippeneieren, en de in vivo Matrigel plug angiogenese assay 7 met behulp van muizen. Terwijl in vivo methoden meten angiogenese in tRIE afmetingen en zijn representatief voor het menselijk lichaam vergeleken met de in vitro assay buisvorming ondervinden zij tekortkoming dat er beduidend meer tijd en aanzienlijk moeilijker uit te voeren. Zowel de CAM-bepaling en de extracellulaire plug assay Neem minstens een week 8 te doen, terwijl in vergelijking, de vaatvorming assay worden uitgevoerd in een enkele dag en het vereist niet het gebruik van dieren.
Het is belangrijk op te merken dat de endotheelcellen die in dit rapport zijn humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Deze cellen spelen een belangrijke rol in vasculaire ontkiemen en groei van bloedvaten en voldoende analoog aan endotheelcellen in kankers worden gebruikt voor anti-angiogenese activiteit evalueren zowel in vitro als in vivo experimenten 9. Andere cellen zoals primaire microvasculaire endotheliale cellen kan ook worden gebruikt.
Het is ook belangrijk op te merken dat naast het hebben lagereHSPGs niveaus van de GFR extracellulaire matrix heeft ook de niveaus van veel componenten in vergelijking met normale extracellulaire matrix. Dit omvat, maar is niet beperkt tot: EGF, IGF-1, PDGF en TGF-beta. Die het uitvoeren van experimenten bestuderen de betekenis van deze verbindingen ten opzichte van angiogenese interessant kunnen gebruik GFR extracellulaire matrix.
Protocol
1. Cultuur van de Cel
- Zaad 3x10 5 HUVEC cellen in 10 ml compleet kweekmedium 10 in een 75 cm kolf.
- Incubeer cellen bij 37 ° C in 5% CO 2 tot 70-80% confluentie.
2. buisje Formation Assay
- Ontdooi ofwel de groeifactor verminderde (GFR) extracellulaire matrix of normale extracellulaire matrix overnacht op ijs bij 4 ° C.
Opmerking: Voor kortheidshalve "extracellulaire matrix zullen voortaan worden gebruikt om zowel GFR en normale extracellulaire matrix referentie. De werkwijze te bereiden identiek. - Houd 96 putjes op ijs en voeg 50 ul gekoelde extracellulaire matrix per putje gebruikt voorgekoelde tips. Bereid drievoud van 5 putjes die alleen de normale extracellulaire matrix. Een volgende drievoud van 5 putjes die alleen GFR extracellulaire matrix.
- Incubeer de 96-well plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Was de HUVECseenmaal met fosfaat gebufferde oplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en voeg 1 ml 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 1-5 minuten, het controleren van de cellen elke minuut totdat de meeste cellen ronden. Verjagen de cellen door de kolf een keer te tikken.
- Voeg 5 ml basaal medium (dwz endotheliale celgroei medium zonder iets (bijvoorbeeld toevoegingen) toegevoegd) met 1% foetaal runderserum (FBS). Verzamel de cellen in de kolf door pipetteren en overbrengen naar een 15 ml buis. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min en gooi het supernatant.
- Resuspendeer met 2 ml basismedium tellen van de cellen met een hemocytometer en pas de celconcentratie 2-3 x 10 5 cellen / ml.
- Bereid 100 ul van 10x de volgende concentraties van remmer CXCR2 SB225002 in basismedium: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM en 0 uM (controle).
- Pipet 300 ul van de HUVEC suspensie in elk 5 MICRocentrifuge buizen. Voeg 33 ul van de remmer concentraties (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM en 0 uM) in een buisje elk de HUVECs en vortex.
- Pipetteer 50 ul van elk van de celsuspensies (1-1,5 x 10 4 cellen) naar afzonderlijke putjes van extracellulaire matrix. Op ieder suspensie in drievoud en incubeer gedurende 4-16 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
- Na 4-16 uur, neem 4 foto's van de gevormde per putje met behulp van een omgekeerde microscoop camera 11 (oorspronkelijke vergroting x 100) buizen.
3. buisje Disruption Assay
- Bereid de extracellulaire matrix en platen volgens dezelfde specificaties als de Tube Formation Assay (stappen 2,1-2,3).
- Bereid HUVEC suspensie zoals beschreven in de stappen 2.4- 2.4.2 van de Formatie Assay buis en monster in een 96-well plaat met de extracellulaire matrix bij 50 pl per putje.
Opmerking: Plate genoeg putten so dat er 3 putten per behandeling met geneesmiddelen. - Kweek cellen op extracellulaire matrix gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Neem foto's voordat de start van de behandeling met geneesmiddelen.
- Bereid 2x concentratie van de remmer CXCR2 SB225002 zoals beschreven in stap 2.5 de buisvorming assay en voeg 50 pl van elke concentratie per putje van de plaat met 96 putjes bevattende de HUVEC. Plate elke concentratie in drievoud.
- Incubeer de plaat nog eens 2-12 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Neem 4 beelden van de gevormd in elk putje met behulp van een omgekeerde microscoop camera (oorspronkelijke vergroting x 100) 11 tubes.
4. kwantificeren Gegevens
- Evalueer buisvorming meegenomen in de afbeeldingen door meting van de totale buislengte van buizen vier willekeurige microscopische velden met de microscoop camera software.
- Open de afbeelding in de microscoop camera software, en klik op 'Annotations en Metingen9 ;. Onder de rubriek 'lengte', selecteert u het gereedschap 'eenvoudige lijn'. Klik op de afbeelding, dan trek een lijn langs de lengte van de buis, klik dan rechts op.
Opmerking: de software automatisch de lengte van de lijn in pixels berekenen en zet de gegevens in een bestand. - Herhaal de procedure voor alle metrolijnen in het beeld door het selecteren van de functie 'eenvoudige lijn'. Klik op de afbeelding, dan trek een lijn langs de lengte van de buis, klik dan rechts op.
Opmerking: De software zal de lengte van elke lijn registreren en de gegevens op het scherm. - Na het meten van elke buis in de afbeelding, klikt u op 'Export', dan koos 'Lengte aan spreadsheet'.
Opmerking: De lengte gegevens worden geëxporteerd naar een spreadsheet. - Voeg alle van de buis lengtes van de spreadsheet om de totale lengte van de buis te krijgen. Bereken de gemiddelde lengte van de buizen op te nemen.
Opmerking: vier replicaten aanbevolen met gemiddelde en de standaardafwijking bepaald.
5. Herstellen Cellen van de extracellulaire matrix Cultuur
- Cultuur en het uitvoeren van een buis formatie assay (zie punt 2) op een grotere schaal als een plaat met 96 putjes zal niet toegeven voldoende celgetal. Voor 12 putjes Gebruik 500 pi extracellulaire matrix en 500 ul van de celsuspensie HUVEC (1.5x10 5 cellen).
- Incubeer de cellen gedurende 4-16 uur om buizen te vormen. Vervolgens zuig het celkweekmedium. Spoel de cellen met 1 ml koude 1x PBS zonder calcium en magnesium.
- Voeg 1 ml ijskoude PBS-2,5 mM EDTA buffer op de cultuur en houden op ijs gedurende 10 min.
- Los van de cellen en extracellulaire matrix mengsel uit de schotel met behulp van een 1000 ui pipet tip met tip afgesneden, en vervolgens over te dragen aan een koude 15 ml tube, was het goed met 4 ml ijskoude PBS-2,5 mM EDTA en in de buis gebracht .
- Zet de buizen op ijs gedurende 1-4 uur en keer de buis een paar keer totdat alle extracellulairematrix is opgelost.
- Centrifugeer 10 minuten bij 1620 xg bij 0 ° C
- Resuspendeer de cel pellets met 1 ml koud PBS tot een 1.ml buis op ijs.
- Centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten bij 3000 xg bij 0 ° C en afvoeren van het supernatant.
- Bewaar de cellen bij -80 ° C.
Representative Results
Aanzienlijke, gezond endotheel vaatvorming kan eenvoudig worden afgezet geremde buisvorming in het microscopiebeelden. Gezonde vorming buis verschijnt als een georganiseerd netwerk van de capillair-achtige structuren (Figuur 1). Ter vergelijking remde vaatvorming manifesteert zich als verspreide cellen (figuur 2). Vaatvorming analysegegevens wordt gekwantificeerd door meting van de totale buislengte van capillaire buisjes (tabel 1). Naast de totale lengte van de buis, kan de gemiddelde lengte van de buis, het totale aantal buisjes, of het totale aantal tak punten worden gemeten. Gestructureerde buis formatie levert een grotere netto lengte van de buis dan verspreid geremd buis groei. In figuur 3, een dosisresponscurve maakt berekening van IC 50 onder dezelfde omstandigheden op HUVECs GFR extracellulaire matrix en CXCR2 inhibitor SB225002.
Figuur 1. Endotheliale t Ube formatie op extracellulaire matrix en groeifactor verminderde (GFR) extracellulaire matrix. Twee beelden tonen succesvol buisvorming op extracellulaire matrix (A) en GFR extracellulaire matrix (B). Het netwerk van onderling verbonden buizen toont duidelijk aan dat de groei van buizen gezond deze HUVEC. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Remming van de buis formatie op extracellulaire en de groei-factor verminderd (GFR) extracellulaire matrix door een CXCR2 remmer SB225002 (5,6 pm). Twee beelden tonen buisformatie die wordt geremd door een inhibitor CXCR2 SB225002 (5,6 uM) met extracellulaire matrix (A) en GFR extracellulaire matrix (B). De geïsoleerde klompjes HUVEC cellen gezien in dit beeld toont dat de cellen waren niet in staat de noodzakelijke verbinding met elkaar vormen van een koker. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. dosis responscurve groei-factor gereduceerd (GFR) extracellulaire matrix. De x-as geeft buislengte en de Y-as de concentratie van een inhibitor CXCR2. De dosis respons curve blijkt dat de HUVEC reactie op de remmer CXCR2 op GFR extracellulaire matrix is dosisafhankelijk. De IC 50 (helft van de maximale remmery concentratie) werd berekend door software 13 en kan worden vergeleken met een dosis respons curve voor extracellulaire matrix, bijvoorbeeld. IC50 is de concentratie van de remmer die de respons tot 50% afneemt. Fout balken geven standaarddeviatie.
| Growth Factor Reduced (GFR) extracellulaire matrix en remmer (4 replica elk) | Totale Tube lengte Average (pixels) (1 pixel = 0,34 pm) | Standaardafwijking | P Waarde |
| GFR extracellulaire matrix controle | 2447 | 168,174 | |
| GFR extracellulaire matrix + 0,56 uM SB225002 | 1422,5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR extracellulaire matrix + 1,1 uM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2.14 x 10 -5 |
| GFR extracellulaire matrix + 5,6 uM SB225002 | 519,25 | 129.6368 | 4.19 x 10 -6 |
| GFR extracellulaire matrix + 11 uM SB225002 | 393,75 | 212.6857 | 1.21 x 10 -5 |
Tabel 1. Kwantificeren totale buislengtes Groei-factor gereduceerd (GFR) extracellulaire matrix onder verschillende omstandigheden. Een gedeelte van een tafel met behulp totale buislengten opgenomen in monsters gekweekt op GFR extracellulaire matrix met variërende concentraties remmer CXCR2. De gegevens geven aan dat de CXCR2 remmer remt vaatvorming. Inbegrepen zijn bijbehorende waarden zoals gemiddelde van vier herhalingen, standaarddeviatie en P-waarde. Gemeten in pixels tonende gegevens die worden geëxporteerd. IC 50 kan worden berekend met behulp van statistische software 13. (1 pixel = 0,34 pm)
Discussion
Bij het uitvoeren van deze test, is het essentieel om de extracellulaire matrix op ijs of bij 4 ° C te allen tijde, tenzij anders vermeld. Als de extracellulaire matrix opwarmen boven 4 ° C, zal polymeriseren, en de test wordt geruïneerd. Het is ook belangrijk dat alles wat in contact komt waarborgen (bijvoorbeeld pipetpunten, de plaat) met de extracellulaire matrix voorgekoeld voor bovengenoemde reden. Het aantal cellen geënt in elk putje slecht is, wordt te weinig cellen niet de verwachte web die in het controlemonster, te veel cellen grote celclusters of een monolaag vormen en de test niet geldig. Een andere belangrijke factor in het succes van deze test is de cel passage nummer van de HUVEC. De passage nummer moet altijd lager zijn dan tien, anders robuuste buis formatie mag niet optreden. Bovendien moet men ervoor zorgen dat het celkweekmedium gebruikt niet is verstreken of de cellen niet levensvatbaar zijn. Alternattend, kan men het medium en zijn onderdelen aliquot en bewaar ze bij -20 ° C te bewaren gedurende een periode na de vervaldatum. Natuurlijk is het nog steeds de voorkeur om het medium vóór gebruik de vervaldatum
Zoals alle procedures, zijn er een aantal nadelen aan het uitvoeren van de endotheelcel vaatvorming assay. Een groot probleem is dat, omdat er verschillende soorten van endotheelcellen en dragermatrices, de resultaten van de test kan sterk variëren afhankelijk van het soort cel en matrix wordt gebruikt. De endotheelcellen gebruikt (HUVECs, HAECs of HMVECs) zijn primaire cellen, ze zijn duur om variabiliteit en hebben in vergelijking met onsterfelijk gemaakte cellen. De primaire cellen beperkt doorgangen voor gebruik, en zijn daarom niet geschikt voor langdurige angiogenese experimenten 14. Voor betrouwbare gegevensopslag moet men altijd dezelfde types voor de test. Net als bij andere in vitro assays, moeten de resultaten van een assay vaatvorming conbevestigd in vivo, omdat de resultaten van gecontroleerde en kunstmatige omstandigheden tweedimensionale weefselcultuur niet altijd worden weerspiegeld in het complex biosysteem van een levend organisme. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat dit type assay kan alleen worden gebruikt om endotheelcellen buisvorming tonen, en mag niet worden gebruikt om andere niet-endotheliale testen buis vormende cellen.
Deze test is een vrij eenvoudige en snelle methode om angiogene potentieel van een verbinding te kwantificeren. Het vormt ook een platform voor verdere experimenten, zoals alleen, is het geen gegevens over de specifieke mechanisme waarmee de verbinding daadwerkelijk het vaartuig vormingsproces beïnvloedt verkregen. Echter, het gebruik van verschillende extracellulaire matrix is een voorbeeld van hoe je een kader voor onderzoek vragen die niet vaak wordt gebruikt verder te creëren. Er zal gaan specifieke biochemische mechanismen van de compound die specifieke remmers die onderdelen van doelgerichte studiede angiogenese route. Een andere benadering kan zijn om RNA te extraheren uit de endotheelcellen en gebruik RT-PCR (Real Time PCR) 12 tot veranderingen in de genexpressie die de groei gedrag waargenomen in de assay kan veroorzaken analyseren. Toekomstige toepassingen van deze methode zijn getransfecteerde HUVEC knock-down assays voor specifieke stappen van de angiogenese route te creëren. Er zijn mogelijkheden om deze benadering van de lymfevatontwikkeling route bestuderen van toepassing. Door het veranderen van extracellulaire matrixcomponenten, kan de interactie tussen matrix en celprocessen ondersteunen angiogenese bij kanker nader worden toegelicht. De extractie van RNA en eiwitten door endotheelcellen onder deze specifieke omstandigheden aanvullende kwantificeerbare corresponderend met dataverwerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
