Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Sommario

Presentiamo un approccio per la visualizzazione di grandi molecole di DNA colorate con peptidi leganti il DNA (FP-DBP) di proteine fluorescenti legate sulla superficie di polietilenglicole (PEG) e vetro rivestito di avidina e allungate con flussi di taglio microfluidici.

Abstract

Grandi molecole di DNA legate sulla superficie di vetro funzionalizzata sono state utilizzate nella fisica dei polimeri e nella biochimica, in particolare per studiare le interazioni tra il DNA e le sue proteine leganti. Qui, riportiamo un metodo che utilizza la microscopia fluorescente per visualizzare grandi molecole di DNA legate sulla superficie. In primo luogo, i vetrini coprioggetti sono biotinilati e passivati mediante rivestimento con glicole polietilenico biotinilato, che lega specificamente il DNA biotinilato tramite i linker proteici avidina e riduce significativamente il legame indesiderato dovuto a interazioni non specifiche di proteine o molecole di DNA sulla superficie. In secondo luogo, le molecole di DNA vengono biotinilate con due metodi diversi a seconda dei loro terminali. Il DNA con estremità smussata è marcato con dUTP biotinilato al suo terminale idrossilico 3', mediante transferasi terminale, mentre il DNA con estremità appiccicosa è ibridato con oligonucleotidi complementari biotinilati mediante DNA ligasi. Infine, un flusso di taglio microfluidico fa sì che le singole molecole di DNA si allunghino per tutta la loro lunghezza di contorno dopo essere state colorate con peptide legante la proteina fluorescente (FP-DBP).

Introduzione

La visualizzazione di grandi molecole di DNA impastoiati sulle superfici di vetro o perline è stato utilizzato per lo studio delle interazioni DNA-proteina, la dinamica delle proteine ​​su substrato di DNA, ^1,2 e fisica dei polimeri. ^3,4 Una piattaforma per le grandi molecole di DNA a singolo tethered ha pochi distinta vantaggi rispetto ad altri metodi di immobilizzazione DNA. ⁵ primo, una grande molecola di DNA legato sulla superficie ha una naturale conformazione random coil senza un flusso di taglio, che è criticamente importante per una proteina di legame al DNA di riconoscere suo sito di legame. In secondo luogo, è molto facile cambiare l'ambiente chimico intorno molecole di DNA per una serie di reazioni enzimatiche in una camera di flusso. In terzo luogo, un flusso di taglio microfluidico induce DNA molecolare estende fino al 100% della lunghezza del profilo completo, che è molto difficile da ottenere con allungamento DNA approcci alternativi come superficie di immobilizzazione ⁶ e nanochannel confinamento. ⁷ Un completamente stretched molecola di DNA fornisce anche informazioni di posizione che può essere utile per il controllo dei movimenti enzimatici sulla mappa genomica.

Tuttavia, l'approccio tethering DNA ha una lacuna critica che tintura del intercalante come YOYO-1 provoca generalmente molecole di DNA legato ad essere facilmente rotto dalla luce di fluorescenza di eccitazione. Generalmente, grandi molecole di DNA devono essere colorato con un colorante fluorescente per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. A questo scopo, YOYO-1 o altri coloranti della serie TOTO sono utilizzati principalmente perché questi coloranti fluorescenti solo quando intercalare DNA a doppia elica. ⁸ Tuttavia, è ben noto che bis intercalanti colorante provoca DNA indotta dalla luce foto-scissione, perché della intercalazione di fluorofori. ⁹ Inoltre, molecole di DNA fluorescente macchiate impastoiati in superficie sono più fragili in quanto i flussi di taglio possono esercitare rottura forze sul liberi di muoversi molecole di DNA. Pertanto, abbiamo sviluppato FP-DBP come un romanzo Ddye proteina NA-colorazione per l'imaging di grandi molecole di DNA impastoiati in superficie. Il vantaggio di utilizzare FP-DBP è che non provoca foto-scissione delle molecole di DNA a cui si lega. ¹⁰ Inoltre, FP-DBP non aumenta la lunghezza del profilo del DNA, mentre bis-intercalanti coloranti aumentano la lunghezza del profilo di circa il 33%.

Questo metodo di video introduce l'approccio sperimentale per legare grandi molecole di DNA ad una superficie PEG-biotina. La Figura 1 illustra i diversi approcci di legare il DNA con estremità smussata ed estremità appiccicose. Così, questo metodo di colorazione può essere applicato a qualsiasi tipo di molecola di DNA. La Figura 2 illustra una rappresentazione schematica del gruppo camera di flusso che può essere controllata da una pompa a siringa per generare flussi di taglio per allungare molecole di DNA e per caricare chimica ed enzimatica soluzioni. la figura 3 mostra micrografie di molecole di DNA completamente allungato impastoiati sul PEGylatdi superficie ed ¹¹ e colorati con FP-DBP.

Protocollo

1. DNA biotinilazione

1. Biotinilazione di blunt DNA ended utilizzando Terminal transferasi (TdT)
   Nota: utilizzare T4 DNA (166 kbp), che è un DNA ended smussato.
   1. Aggiungere 5 ml di 2,5 mM CoCl _2, 5 ml di 10 × tampone di reazione, 0,5 ml di 10 mM biotina-11-dUTP, 0.5 ml di transferasi terminale (10 unità) e 0,5 ml di T4 DNA (0,5 mcg / ml) alla miscela di reazione. Rendere ad un volume finale di 50 ml aggiungendo 38,5 ml di acqua.
   2. Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 1 ora.
      Nota: tempo di reazione totale può produrre DNA a doppia legato, cioè, è possibile che biotins vengono contrassegnati alle due estremità.
   3. Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA, pH 8.
   4. Tenere il tubo a 4 ° C.
2. Biotinilazione di DNA ended appiccicoso Utilizzando DNA Ligase
   Nota: utilizzare λ DNA (48,5 kbp), che è un DNA appiccicoso-end.
   1. Aggiungere 1 ml di T4 DNA ligasi, 5 microlitri di 10 × tampone di legatura, 1 ml di 25 ng / ml DNA λ fago, e aggiungere 43 ml di acqua per fare un volume finale di 50 pl.
   2. Tenere il tubo a 4 ° C.

2. funzionalizzato Derivatizzazione Surface

Nota:. Per legare una estremità di una molecola di DNA sulla superficie di vetro, un gruppo amminico primario è silanizzato su un vetrino seguita da rivestimento biotina-PEG come mostrato in Figura 1 Il processo PEGylation è importante per l'imaging DNA a singola molecola perché può ridurre significativamente il rumore casuale creato da attaccamento di molecole indesiderate sulla superficie.

1. Piranha Pulizia
   Nota: Le soluzioni Piranha reagire violentemente con materiali organici, pertanto, deve essere maneggiato con cura, seguendo le linee guida di sicurezza adeguate.
   1. Luogo coprioggetto su un politetrafluoroetilene (PTFE) cremagliera, e tenere premuto By PTFE nastro sigillante filo longitudinale, metà sul bordo delle superfici e per metà sul rack. Dopo il confezionamento, lascia un lungo pezzo (~ 5cm) di nastro per la movimentazione della rastrelliera durante la procedura di pulizia.
   2. Riempire un bicchiere di vetro 1 L con 350 ml di H ₂ SO ₄ e 150 ml di H ₂ O ₂ per rendere soluzione piranha in una cappa aspirante. Inserire la griglia in soluzione piranha per 2 ore.
   3. soluzione Piranha vuoto dal bicchiere, e coprioggetto risciacquo con acqua deionizzata fino a che il pH dell'acqua nel bicchiere raggiunge neutra. Utilizzare strisce di carta pH.
   4. Sonicare i rack di vetrini in acqua bicchiere contenente, per 30 min. acqua vuota dal bicchiere appena prima che amino silanizzazione. Utilizzare 75 W di potenza sonicazione per pulire e derivatize i substrati di vetro.
2. Aminosilanization sulla superficie di vetro
   1. Aggiungere 2 ml di N - [3- (trimethoxysilyl) propil] etilendiammina e 10 ml di acido acetico glaciale a 200 mldi alcool metilico in un contenitore di polipropilene pulito per la preparazione della soluzione aminosilanization.
   2. Mettere vetrini puliti nel contenitore in polipropilene. Agitare a 100 rpm e temperatura ambiente per 30 min.
   3. Sonicare il bicchiere con derivatizzati vetrini per 15 minuti a 75 W. scuoterli a 100 rpm e temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
   4. Svuotare la soluzione dal bicchiere, e risciacquare coprioggetto con attenzione, una volta con alcool metilico, e due volte con alcol etilico. coprioggetto Conservare in alcool etilico e utilizzarli entro due settimane.
3. PEGylation del vetrino
   1. Rendere 10 ml di 0,1 M sodio bicarbonato (NaHCO _3). Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron.
   2. Sciogliere 2 mg di carbonato di biotina-PEG-succinimidile (biotina-PEG-SC) e 80 mg di PEG-succinimidyl valerato (MPEG-SVG) in 350 ml di NaHCO _3. Utilizzare un tubo di protezione dalla luce.
   3. Agitare la provetta con forza per 10 sec e centrifugare a 10.000 g per 1 min per rimuovere le bolle.
   4. Risciacquare un vetrino con acetone, seguito da risciacquo con alcool etilico. Lasciare che il vetrino all'aria asciugare completamente.
   5. Mettere una goccia (50 ml) di soluzione di PEG sul vetrino pulito. Coprire la goccia delicatamente con un amino silanizzata copertura di slittamento, senza generare eventuali bolle.
   6. Collocare i vetrini per 3 ore per una notte in un buio, ben livellato camera umida a temperatura ambiente. Utilizzare un titolare di punta della pipetta vuoto come la camera, con acqua sul fondo. Sigillare soluzione residua PEG nel tubo e la tiene a 4 ° C.
   7. Sciacquare il vetrino PEGylated accuratamente con acqua deionizzata. Conservare in un luogo buio e asciutto fino al momento dell'uso.

3. Assemblare una camera di flusso

1. Realizzare un supporto acrilico perforato, come in Figura 2. Assicurarsi che il diametro dell'inserto tubo è 0,762 millimetri e designare un foro è un ingresso e l'altro èuna uscita (figura 2).
2. Posizionare nastri biadesivi Nastro adesivo (larghezza 5-6 mm) su un supporto acrilico (Figura 2), allineando perpendicolarmente ad un foro di ingresso e di uscita, senza perturbare fori canale. Utilizzare queste strisce di nastro come pareti multi-canale per rendere camere. Scrub il nastro utilizzando una punta di pipetta.
3. Posizionare un vetrino PEGylated sulla parte superiore per fare camere di flusso, con il lato rivolto verso il basso PEGylated.
4. Per evitare qualsiasi soluzione fuoriuscita, premere la parte superiore di un coprioggetto sopra la zona in cui vengono inseriti nastri biadesivi. Aggiungere colla quick-dry epossidica per chiudere i bordi della camera in alto e in basso (colore giallo nella figura 2).
5. Collegare un breve brano (2,5 cm) di tubo (diametro esterno, OD, 0,042 ") per una siringa a tenuta di gas e sigillare il giunto con colla epossidica.
6. Collegare un lungo tubo flessibile (OD: 0.03 ") per il tubo collegato alla siringa e sigillare il giunto con colla epossidica.
7. Riempire il tubing collegato alla siringa con acqua deionizzata. Assicurarsi che non vi è alcuna bolla d'aria.
8. Inserire il tubo nel foro della camera di flusso sigillato con colla epossidica.
9. Mettere una punta gialla (200 microlitri punta), dall'altro foro come un serbatoio.

4. Esempio Caricamento in camera di flusso

Nota: neutravidina può essere sostituito con altre proteine ​​avidina come streptavidina. Tutte le reazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente, che sono menzionate. Prendere soluzione campione in una punta di colore giallo, e installare la punta con la soluzione sul foro del supporto acrilico (Figura 2b).

1. Impostare la portata della pompa a siringa a 50 ml / min. Carico 20 ml di proteina avidina (25 ug / ml in soluzione T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e tenerlo per 10 min.
2. Carico 20 l di oligonucleotidi biotinilati (100 micron di 1 × TE), e tenerlo per 10 minuti. Se si utilizza transferasi terminale, saltare il caricodi oligonucleotidi.
3. Carico 20 ml di soluzione di DNA dal punto 1 nella camera di flusso ad una portata di 10 ml / min, e tenerlo per 30 min.
4. Lavare la camera di flusso con 1 × TE, e caricare 40 ml di FP-DBP ¹⁰ (~ 80 Nm).
5. Osservare DNA sotto un microscopio a fluorescenza con flusso continuo di molecole di colorazione in 1 × TE su una lente obiettivo 60X. Utilizzare 488 nm laser a stato solido per l'eccitazione di FP (eGFP) -DBP. Per la piena tratto di molecole di DNA, si applicano diverse portate a seconda delle lunghezze di DNA utilizzati. Ad esempio, applicare 50 microlitri / min 48,5 kbp di DNA λ, e 100 microlitri / min per 166 kbp di T4 DNA.
   1. Per il riciclaggio del titolare acrilico, immergere camere a flusso assemblati in una soluzione detergente per la casa ^12. Rimuovere nastri e resina epossidica con una lama di rasoio e strofinare con le mani per prendere completamente fuori. Sbloccare fori con aghi da siringa. Mantenere i titolari in acqua deionizzata fino a nuovo uso.

Risultati

La Figura 1 mostra due diversi metodi tethering DNA seconda strutture terminali della molecola di DNA. Figura 1a illustra come i appiccicose molecole di DNA ended sono ibridate con oligonucleotidi biotinilati complementari, che sono immobilizzati sulla superficie PEG avidina-rivestita. Figura 1b mostra l'aggiunta di biotinilato ddNTP o dNTP al gruppo idrossilico 3 'di un DNA ended smussato da transferasi terminale. Abbiamo aggiunto linke...

Discussione

Qui vi presentiamo una piattaforma per la visualizzazione di molecole di DNA lunghe biotinilati per l'ancoraggio sulle superfici. Abbiamo riportato un approccio per molecole di DNA impastoiati su una superficie rivestita proteina avidina con biotinilato albumina sierica bovina. ⁶ Nell'approccio in precedenza, abbiamo trovato una questione cruciale del DNA foto-scissione causata da coloranti bis-intercalazione che macchiano molecole di DNA legato alla superficie. Poiché questi fluorofori continuamente ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1. Biotinilazione del DNA
1.1) Biotinilazione del DNA con estremità smussata utilizzando la transferasi terminale (TdT)
Terminal Transferasi	New England Biolabs	M0315S	Fornito con 10x tampone di reazione, 2,5 mM di cloruro di cobalto
Biotina-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotina-ddNTP È disponibile anche
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinilazione del DNA appiccicoso utilizzando DNA ligasi
T4 DNA ligasi	New England Biolabs	M0202S	Fornito con 10x tampone di reazione
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Disponibile anche presso New England Biolabs
2. Derivatizzazione della superficie funzionalizzata
2.1) Pulizia Piranha
Vetrino coprioggetti	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, n. 1 Spessore
Rack			Fabbricazione personalizzata
Nastro sigillante per filettatura in PTFE	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon & trade; nastro
Acido solforico	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, purezza 95%
Perossido di idrogeno	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% in acqua
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Pulitore
2.2) Aminosilantizzazione sulla superficie del vetro
N-[3-(Trimetossisilil)propil] etilendiammina	Sigma-Aldrich	104884
Acido acetico glaciale	Duksan Chemicals	414	99% Purezza
Alcool metilico	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99,9% Purezza
Polipropilene Contenitore	Qorpak	PLC-04907
Alcool etilico	Jin Chemical Co., Ltd.	A300202	99,9% Purezza
2.3) PEGilazione del vetrino coprioggetti
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Filtro per siringa	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co., Ltd.	A300129	con purezza del 99%
	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1  mm
3. Assemblaggio di una camera di flusso
Supporto acrilico			Fabbricazione personalizzata
Nastro biadesivo	3M		Tipo trasparente
epossidica ad asciugatura rapida	Tubi
	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
A tenuta di gas 250 &; l Siringa	Hamilton	81165
Pompa a siringa	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Caricamento del campione nella camera di flusso
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	con base Trizma
	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Laser a stato solido (488  nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.