Summary
Detta manuskript ger ett tekniskt förfarande som kan användas för att karakterisera C1498 cellkulturer in vitro och akut leukemi inducerades i möss efter deras injektion. Fenotypiska och funktionella analyser genomförs med hjälp av flödescytometri, immunfluorescensmikroskopi, cytokemi och May-Grünwald Giemsa färgning.
Abstract
Intravenös injektion av C1498-celler i syngena eller kongena möss har utförts sedan 1941. Dessa injektioner resultera i utvecklingen av akut leukemi. Emellertid, arten av denna sjukdom har inte blivit väl dokumenterade i litteraturen. Här ger vi ett tekniskt protokoll för karakterisering C1498-celler in vitro och för att bestämma beskaffenheten av den inducerade leukemi in vivo. Den första delen av detta förfarande är inriktad på att fastställa hematopoetisk härstamning och stadiet av differentiering av odlade C1498 celler. För att uppnå detta, är multi-parametrisk flödescytometrisk färgning används för att detektera hematopoetiska cellmarkörer. Immunfluorescensmikroskopi, cytokemi och May-Grünwald Giemsa färgning utförs sedan för att bedöma uttryck för myeloperoxidas, aktiviteten hos esteraser och cellulär morfologi, respektive. Den andra delen av detta protokoll är tillägnad beskriver leukemi sjukdom som induceras ivivo. Det senare kan uppnås genom att bestämma frekvenserna av leukemiska och inneboende celler i blodet, hematopoetiska organ (t ex benmärg och mjälte) och icke-lymfoida vävnader (t ex lever och lungor) med användning av specifik färgning och flödescytometri analyser. Beskaffenheten av den leukemi bekräftas sedan med användning av May-Grunwald Giemsa-färgning och färgning för specifika esteraser i benmärgen. Här presenterar vi de resultat som erhölls med hjälp av detta protokoll i åldersmatchade C1498- och PBS-injicerade möss.
Introduction
Akut myeloisk leukemi (AML) kännetecknas av okontrollerad spridning av hematopoetiska myeloidceller som blockeras i olika stadier av mognad. Denna dysreglering kan påverka granulocytiska, monocytiska, erytrocytiska eller megaryocytic differentieringsvägar 1. AML-celler ansamlas i benmärgen, vilket leder till försämrad hematopoes, vilket resulterar i trombopeni, lymfopeni och anemi. Leukemicellema invaderar också blodet och icke-lymfoida organ.
Den C1498 musmodell har använts i årtionden som en modell för akut leukemi eftersom cancerceller isolerades från en leukemisk 10-månader gamla C57BL / 6 (H-2b) honmus 1941. Litteraturen beskriver invasionen i blodet , hematopoetiska organ (t.ex., mjälte och lymfkörtlar) och icke-hematopoetiska organ (t.ex. lever, lungor, äggstockar och njurar) av mycket proliferativa C1498 celler efter de injicerades via en itravenous, subkutan eller intraperitoneal väg till mottagliga möss 2-4. Emellertid var detta musmodell rapporterats inducera antingen granulocytiska 2,5 eller myelomonocytär 6 leukemi. På senare tid, en studie som publicerades i 2002 beskrev denna typ av cancer som murin NKT cellsleukemi 7. Således skiljer litteraturen om denna typ av C1498 cellinje och tillhörande leukemi det inducerar i möss. Dessa skillnader är främst på grund av en brist på detaljerad och uppdaterad publicerad information om cellerna och leukemisjukdomar i allmänhet, eftersom många studier genomfördes på 1950 - 70-talet.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för att beskriva hur man karaktärisera C1498-celler och analysera arten av den leukemiska sjukdom som induceras genom deras intravenös injektion i möss. Den första delen av detta protokoll är tillägnad en beskrivning av C1498-celler som har odlats in vitro. fluorescerande antiorgan riktade mot ytan och intracellulära hematopoietiska markörer användes för att bestämma deras fenotyp med användning av flödescytometri. Närvaron av myeloperoxidas bedömdes med hjälp immunfluorescensmikroskopi, var deras hematopoetisk härstamning och differentiering skede utvärderas med hjälp cytokemi att bedöma aktiviteten av esteraser, och May-Grünwald Giemsa färgning utfördes. De C1498-celler sedan injicerades i möss, och akut leukemi sjukdom som inducerades beskrivs i den andra delen av detta manuskript. Samma tekniker användes för att bestämma de frekvenser och de fenotyper av leukemiska och inneboende cellerna i benmärgen, perifert blod, mjälte och icke-hematopoetiska organ (lever och lungor).
Detta protokoll är mycket reproducerbar, och de data som presenteras här kommer att hjälpa forskare att bedöma effekterna av nya terapeutiska strategier. Denna leukemi musmodell har redan använts för att testa immunterapi närmar sig ennd olika cancercellgifter 8,9. Deras effektivitet utvärderades genom att bestämma utvecklingen av tumörbördan och överlevnadstal. Protokollet kan användas för att ge ytterligare information om fördelningen och uppehälle av leukemi och andra hematopoetiska cellpopulationer under behandlingen.
Protocol
Djurstallar och alla experimentella förfaranden har godkänts av den lokala Animal Care etiska kommitté, CEEA.NPDC (överenskommelse no.512012), och alla experiment utfördes i enlighet med de franska och europeiska riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
1. In vitro-karakterisering av C1498 cellinje
- Odling in vitro av C1498-celler
- Förbereda fullständigt RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium genom att tillsätta 50 ml fetalt bovint serum (FBS), 5 ml penicillin (100 U / ml) -streptomycin (100 | j, g / ml), 500 fil av 50 mM β-merkaptoetanol , 5 ml N-2-hydroxietylpiperazin-N-2-etansulfonsyra (HEPES), 5 ml av icke-essentiella aminosyror och 5 ml natriumpyruvat till 500 ml RPMI-medium.
- Odla C1498 cellinje i fullständigt RPMI. Skörda cellerna i suspension genom pipettering, och överföra cellerna till ett 50 ml rör. Centrifugera vid 350 xg under 10 minuter, och ta bort den supernatant.
- Tillsätt 20 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (1x) lösning, centrifugera vid 350 xg under 10 min och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 10 ml fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) buffert (2,5 g bovint serumalbumin (BSA) pulver och 2 ml 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning i 500 ml PBS-lösning). Räkna celler med hjälp av en Thoma cell räknekammare efter färgning av cellerna med trypanblått.
- Fenotypisk karakterisering av C1498 cellinje med immunfärgning och flödescytometri analys
- Cellytan färgning
- Förbereda FACS-buffert.
- Justera de skördade cellerna i FACS-buffert till 10 7 celler / ml och fördela 10 6-celler (i 100 | j, l) för varje färgningsexperiment in i flödescytometri rör.
- Märka cellerna med 100 | il av följande antikroppar eller deras tillhörande isotypkontroller utspädda i FACS-buffert:
- för markers av prekursor och differentierade celler, märka cellerna med anti-CD11b / anti-CD18 (en), anti-Ly-6G (1), anti-CD19, anti-B220 (2), anti-NK1.1, anti- CD49b, anti-CD4 (1), anti-CD8 (2), anti-CD3 (3), anti-CD21 / 35, anti-CD115 och anti-TCRVβ antikroppar.
- För hematopoietiska stam / progenitorceller markörer, använda en kombination av anti-CD34 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD150 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD117 / anti-CD127 eller anti- CD16 / 32-biotin antikroppar enbart.
- För markörer av cellfunktioner (t.ex. vidhäftning, antigenpresentation, samstimulerande molekyler och receptorer), färgas cellerna med anti-CD18 (2) / anti-CD11a, anti-MHC klass I, anti-MHC klass II, anti- CD31, anti-CD44, anti-CD80-biotin, anti-CD86 och anti-CD274-antikroppar.
- Inkubera alla av flödescytometri rören vid 4 ° C under 30 min.
- Tvätta cellerna två gånger genom att tillsätta 2 ml FACS-buffert till varje rör, centrifugera vid 350 xg under 5 minuter, och avlägsna supernatanten. Tillsätt 100 | il av FACS buffert till varje rör och fortsätt till sekundär färgning genom tillsats av 100 | il fluorescent streptavidin (1/100 i FACS-buffert för en slutlig spädning av 1/200) till de biotinylerade-konjugerade antikroppar. Inkubera rören vid 4 ° C under 30 min.
- Tvätta cellerna två gånger på följande sätt: tillsätt 2 ml FACS-buffert till varje rör, centrifugera rören vid 350 xg under 5 minuter, och avlägsna supernatanten genom pipettering.
- Resuspendera cellerna i 500 pl kall PBS och placera cellerna på is, hålla dem i mörkret genom att använda aluminiumfolie för att täcka rören. Analysera resultat med hjälp av en cytometer 10.
- intracellulär färgning
- Förbereda fixering buffert genom att tillsätta 125 ml av en 4% paraformaldehyd (PFA) lösningen till 375 ml PBS-lösning.
NOTERA: För att framställa 500 ml av 4% PFA, värme 400 ml PBS-lösning till ca 60 ° C på en omrörningsplatta i en ventilerad huv. Tillsätt 20 g av PFA pulver och höja pHtills PFA är upplöst. Låt lösningen svalna, justera pH till 6,9, och göra upp volymen till 500 ml med PBS. - Förbered permeabilisering buffert genom att tillsätta 0,5 g av saponin och 0,5 g BSA till 500 ml PBS-lösning.
- Justera de skördade cellerna i FACS-buffert till 10 7 celler / ml och fördela 10 6 av cellerna (100 | il) för varje färgningsexperiment in i flödescytometri rör. Centrifugera cellerna vid 350 xg under 5 minuter, och avlägsna supernatanten.
- Fixera cellerna i 200 ^ 1% PFA-lösning och inkubera under 10 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 2 ml av permeabilisering buffert till varje rör, centrifugera rören vid 350 xg under 5 minuter, och avlägsna supernatanten genom pipettering. Tillsätt 100 pl av permeabilisering buffert till varje rör.
- Märka cellerna med 100 | il av följande antikroppar eller deras motsvarande isotypkontroller efter späd dem i permeabilisering buffert: anti-CD3 (2) / anti-CD8 (1), anti-CD3 (3) / aNTI-CD4 (2), anti-CD107b och anti-CD3 (3) / anti-TCRVβ.
- Inkubera cellerna vid 4 ° C under 30 min.
- Tvätta cellerna två gånger genom att tillsätta 2 ml av permeabilisering buffert till varje rör. Centrifugera rören vid 350 xg under 5 minuter, och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 100 pl av permeabilisering buffert till cellerna. Fortsätt till nästa färgning genom att tillsätta 100 pl fluorescent streptavidin utspätt i permeabilisering buffert till biotinylerad-konjugerade antikroppar. Inkubera rören vid 4 ° C under 30 min.
- Tillsätt 2 ml av permeabilisering buffert till varje rör, centrifugera rören vid 350 xg under 5 minuter, och avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg en gång.
- Resuspendera cellerna i 500 | il kall PBS, och sedan placera cellerna på is i mörker. Analysera resultaten med hjälp av en flödescytometer 10.
- Förbereda fixering buffert genom att tillsätta 125 ml av en 4% paraformaldehyd (PFA) lösningen till 375 ml PBS-lösning.
- Cellytan färgning
- Beredning av en cellsuspension på objektglas för mikroskopi
- Tvätta 10 6 hektarrvested C1498-celler (erhållna i steg 1.1.4) med 5 ml kall FACS-buffert två gånger, och späd cellerna i 1 ml kall FACS-buffert. Placera rören på is.
- Placera glider in engångs kammare med förmonterad filterkort och placera dessa i en cytocentrifug.
- Tillsätt 100 | il av FACS buffert till varje kammare och filterkort, och snurra dem för 2 min vid 4,52 x g.
- Tillsätt 100 | il av celler till varje kammare och filterkort, och snurra cellerna vid 4,52 xg under 2 min.
- Försiktigt bort bilderna från kamrarna och lufttorka bilderna innan färgning dem med myeloperoxidas (steg 1,4), esteraser (steg 1,5) eller maj-Grünwald Giemsa (steg 1,6).
- Myeloperoxidas färgning för immunofluorescens
- Fixera cellerna på objektglasen genom nedsänkning av objektglasen i en kall metanol: aceton (1: 1) lösning under 2 min, och sedan lufttorka glasen.
- Att begränsa vätskan till området av bilden som innehåller cellerna, rita en CIrcle runt cellerna med användning av ett vattenavvisande penna.
- Skölj cellerna i 200 pl kall PBS-lösning under 10 min.
- Blockera cellerna i 200 | il 3% BSA / PBS-buffert innehållande 10 | il normal donkey serum och 10 | ig / ml av renade anti-CD16 / 32-antikroppar.
- Applicera 200 | il av anti-mus myeloperoxidas (utspädd till 20 | ag / ml i 3% BSA / PBS-buffert). Inkubera cellerna O / N vid 4 ° C i en fuktkammare.
- Tvätta cellerna med 200 | il kall 0,1% BSA / PBS.
- Applicera 200 pl anti-get-IgG-antikroppar utspädda vid 1/250 i 3% BSA / PBS-buffert. Inkubera cellerna under 2 h vid RT i en fuktkammare.
- Tvätta cellerna 3 gånger med 200 | il av 0,1% BSA / PBS-buffert och två gånger i kall PBS.
- Färga cellkärnorna med 200 | il av Hoechst utspädda vid en / 1000 i PBS (till en slutlig koncentration på 1 | ig / ml) under 2 min vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna med vatten och låt dem lufttorka innan mounting. Applicera en droppe monteringsmedium 1 till cellerna, placera en kant av en täckglas på bilden, och försiktigt sänka den på cellerna med hjälp av pincett. Tryck försiktigt på täckglas för att avlägsna eventuella luftbubblor.
- esteras cytokemi
Obs: Pre-varma alla reagenser till RT.- fixativ beredning
- För att framställa den Citrat-aceton-Formaldehyd (CAF) lösningen, tillsätt 2,5 ml citratlösning, 6,5 ml aceton och 0,8 ml 37% formaldehyd till en glasflaska. Blanda försiktigt och förvara vid 4 ° C.
- Naftol AS-D kloracetatesteras (CAE) aktivitetsanalys
- Varmt avjoniserat vatten till 37 ° C.
- I ett 50 ml rör, tillsätt 1 ml natriumnitritlösning till 1 ml av färglösningen. Blanda försiktigt och låt stå i 2 minuter. Tillsätt 40 ml av förvärmda avjoniserat vatten, 5 ml pH 6,3 buffertkoncentrat och 1 ml naftol AS-D kloracetat lösning. Blanda och överför till ett Coplin-kärl.
- Fixera celler pådiabilder (se avsnitt 1.3) under 30 sekunder med CAF-lösning (se steg 1.5.1.1) och tvätta glasen under 45 sekunder med avjoniserat vatten.
- Överför objektglasen i lösningen som framställdes i steg 1.5.2.2, och inkubera objektglasen vid 37 ° C under 30 min i en fuktkammare i skydd mot ljus.
- Torka glasen och skölj dem via nedsänkning i avjoniserat vatten under 2 minuter.
- Motfärg cellerna genom att tillsätta några droppar hematoxylin-lösning och inkubera dem under en min.
- Tvätta bilderna med neutralt vatten (pH 7) och tillåta dem att lufttorka. Applicera en droppe monteringsmedium 2 till cellerna, placera en kant av en täckglas på bilden och försiktigt sänka den på cellerna med hjälp av pincett. Tryck försiktigt på täckglas för att avlägsna eventuella luftbubblor.
- Alfa-naftyl butyrat esteras (NBE) aktivitetsanalys
- Varm α-naftyl butyrat lösningen till 37 ° C före användning.
- Späd en tablett av natrium nitrit i 6,25 ml avjoniserat vatten.
- I ett 50 ml rör, tillsätt 1,5 ml av en natriumnitrittablettlösning och 1,5 ml av en Pararosanilin lösning. Blanda försiktigt och låt lösningen stå i 5 minuter. Komplettera lösningen med 40 ml fosfatbuffrad lösning. Bringa till pH 6 genom försiktig tillsats av 10 N NaOH droppvis. Tillsätt 5 ml av α-naftyl butyrat lösning, blanda hela lösningen, och överföra den i ett Coplin.
- Fixera cellerna på objektglasen i 10 sek med användning av CAF lösningen vid RT och skölja i 45 sek med avjoniserat vatten.
- Överför objektglasen in i Coplin-kärlet som innehåller den lösning som framställdes i steg 1.5.3.2 och inkubera tillsammans under 1 h vid 37 ° C i en fuktkammare samtidigt som skyddas från ljus.
- Skölj objektglasen i 2 min i neutralt vatten (pH 7) och lufttorka.
- Kontrast cellerna med metylenblått lösning genom att tillsätta några droppar på bilden och inkubera under 4 min.
- Sänk ned objektglasen i deioserad vatten i 2 min och tillåta dem att lufttorka. För att montera bilderna, tillämpa en droppe monteringsmedium 2 till cellerna, placera en kant av täckglas på bilden, och försiktigt sänka den på cellerna med hjälp av pincett. Tryck försiktigt på täckglas för att avlägsna eventuella luftbubblor.
- fixativ beredning
- May-Grünwald Giemsa (MGG) färgning
- Färga cellerna (framställda i avsnitt 1.3) genom nedsänkning av objektglasen i ett Coplin innehållande May-Griinwald-lösning under 3 minuter.
- Överför objektglasen i ett Coplin innehållande pH 6,8 buffertlösning under 1 min.
- Färga objektglasen genom att placera dem i ett Coplin innehållande Giemsa R lösning (utspädd till 1/20 i pH 6,8 buffertlösning) under 10 min. Tvätta bilderna med neutralt vatten (pH 7) under 10 sek.
- Töm och lufttorka bilderna. Mount objektglasen genom att applicera en droppe monteringsmedium 2 på cellerna. Placera en kant av täckglas på bilden och försiktigt sänka den påtill cellerna med hjälp av pincett. Tryck försiktigt på täckglas för att avlägsna eventuella luftbubblor.
2. In vivo utveckling och karakterisering av akut leukemi
OBS: Fyra veckor gamla kvinnliga kongena C57BL / 6J-Ly5.1 möss hölls under specifika patogenfria betingelser (det vill säga i en steril miljö). Mössen injicerades när de var mellan 5 och 6 veckor gammal.
- Intravenös injektion med C1498-celler
- Skörda odlade C1498-celler i suspensioner genom att pipettera. Överföra cellerna till ett 50 ml rör och centrifugera vid 350 xg under 10 min. Tvätta cellerna i 10 ml kall PBS två gånger, och förbereda en cellsuspension av 10 7 celler / ml i PBS. Placera den cellulära suspensionen på is innan du utför injektionen.
- Placera musen i en restrainer och utför injektionen under sterila betingelser i ett dragskåp med laminärt flöde.
- Använd en 29G nål med en spruta för att injicera celler isvansvenen. Ta tag i svansen vid den distala änden, och desinficera den med en gasbinda svamp indränkt i 70% etanol. Kontrollera att vara säker på att det inte finns några luftbubblor i sprutan, och sedan långsamt injicera 100 pl av C1498 cellsuspensionen (10 6 celler) i svansvenen.
- Efter injektionen, ta bort nålen från svansen och styra blödning genom att applicera tryck med en steril gasbinda svamp vid injektionsstället. Tillbaka djuret till sin bur och noggrant kontrollera sin hälsa under de närmaste timmarna och dagarna.
- Retro orbital bloduppsamling
- Övervaka beteende PBS och C1498-injicerade möss tecken på leukemi sjukdom (t.ex. piloerektion, isolering från gruppen, och minskad eller ingen rörelse i buren).
OBS: Detta inträffar vanligtvis mellan 17 till 19 dagar efter det att cellerna injiceras. - Utföra retroorbitala bloduppsamling strax före eutanasi (se steg 2.2.7) under sterila förhållanden i ett laminärt flödehuva och under en värmelampa för att förhindra hypotermi.
- För anestesi, använder ketamin vid 150 mg / kg och xylazin vid 10 mg / kg. Förbereda den anestetiska lösningen genom att späda 1,5 ml av ketamin och 0,5 ml xylazin i 18 ml PBS-lösning.
- Söva kontroll och leukemimöss. Gå vidare med en intraperitoneal injektion av 200 ul av den anestetiska lösning per 10 g mus med användning av en 26G nål och en 1 ml spruta. Kontrollera om förlusten av pedal reflexen att bekräfta anestesi.
- Infoga ett kapillärrör i mediala ögonvrå av ögat. Blod kommer att stiga från orbital sinus in i kapillärröret. Styr blödning genom att försiktigt sätta press på ögat med en steril gasbinda svamp.
ANMÄRKNING: En volym av 100 till 200 | il blod kan samlas in med hjälp av denna teknik. - Samla blod i ett EDTA-rör, och lagra provet på is innan isolera mononukleära celler.
- Euthanize musen med halsdislokation, ochfortsätta att isolera organ (avsnitt 2.3).
- Övervaka beteende PBS och C1498-injicerade möss tecken på leukemi sjukdom (t.ex. piloerektion, isolering från gruppen, och minskad eller ingen rörelse i buren).
- Organ och celler isolering
- organ isolering
- Placera euthanized musen på rygg på en plastskiva och använda nålar för att fästa djurets fötter för att underlätta organ isolering. Desinficera musen med 70% etanol innan du utför ett snitt.
- Med användning av steril sax, utför en ventral incision från bukhuden till halsen. Skär genom bukväggen för att komma åt levern. Skär genom bröstkorgen och membranet för att komma åt lungorna. Flytta tarmen åt sidan och avlägsna mjälten med användning av steril sax och tång.
- För isolering av benmärg, skär benen på toppen av lårbenen ovanför skarven med användning av sterila saxar. Koppla skenbenet från lårbenet genom att dra försiktigt och ta bort hud och muskler från ben med hjälp av pincett och sax.
- Placera varje organ och ben i en 50 ml rör innehållande kall PBS, och placera dem på is.
- Isolering av celler från organ
- Väg mjälten innan störa cellerna. Mekaniskt störa mjälte, lungor och lever genom att trycka dem genom en 70 | im sil med användning av en sprutkolv i ett 50 ml rör, och samla upp cellerna i 30 ml kall PBS.
- För att samla benmärgsceller, sätta lårben och skenben i en petriskål på is, klippa extremiteter med hjälp av steril sax, och spola ut benmärgen genom att sätta in en 26G nål fäst vid en 10 ml spruta innehållande 5 ml kall PBS.
- Störa benmärgsceller genom att passera cellsuspensionen genom nålen / sprutan, och filtrera cellsuspension genom en 70 | j, m sil i ett 50 ml rör.
- Centrifugera alla rören innehållande vart och ett av de organ och de benmärgsceller vid 350 xg under 10 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna som samlats in från lungorna och benmärg i 2 ml lysbuffert (1x) och cellens som isolerats från levern och mjälten i 5 ml lyseringsbuffert (1 x) genom att försiktigt pipettera blandningen upp och ned. Fyll rören till 50 ml med kall PBS.
- Centrifugera cellerna vid 350 xg under 10 min. Resuspendera cellerna i FACS-buffert för flödescytometri analys eller för att förbereda cellerna för mikroskopi. Räkna celler med hjälp av en Thoma cellräkning kammaren efter färgning dem med trypanblått.
- organ isolering
- Cellytan färgning av celler isolerade från organ för flödescytometrianalys
- I en flödescytometri rör, etikett 10 6 celler som isolerades från organ med 10 | ig / ml av renade anti-CD16 / 32-antikroppar i 100 pl FACS-buffert.
- Till 10 6 benmärgsceller, tillsätt 100 | il av följande antikroppar eller kombinationer av antikroppar och deras motsvarande isotypkontroller utspädda i FACS-buffert: anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD115 / anti-CD3 (1) / enti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), anti-CD11b, anti-CD115 eller anti-CD19 ensam för kompensationsinställningarna.
- Till splenocyter, tillsätt 100 | il av följande antikroppar och deras motsvarande isotypkontroller utspädda i FACS-buffert: en kombination av anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (en ) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), anti-CD11b eller anti-CD19 för kompensationsinställningarna.
- Till lung- och leverceller, tillsätt 100 | il av anti-CD45.2 antikroppar och dess motsvarande isotypkontroll utspätt till 1/100 i FACS-buffert.
- Inkubera alla celllösningar för 30 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 ml FACS-buffert till varje rör. Centrifugera rören under 5 min vid 350 xg och kasta supernatanten genom pipettering. Upprepa detta steg en gång.
- Resuspendera de märkta cellerna i 500 | il kall PBS. Håll celler på is och skyddas från ljus innan du utför flödescytometri för acförvärvs och analys 10.
- Isolering av mononukleära blodceller och immunofluorescerande färgning för flödescytometrianalys
- Innan du startar protokollet, före värma separationslösning till RT.
- Överföra blodprovet (100 till 200 pl; erhållen från steg 2,2) i ett mikrocentrifugrör, och tillsätt PBS / 1 mM EDTA-lösning, tills lösningens volym är 500 | il. skikt noggrant 500 pl separera lösningen under den lösning som innehåller blod med användning av en 30G nål och en 1 ml spruta. Blanda inte blodet och separationslösningen.
- Centrifugera rören vid 800 xg (utan broms) under 20 min vid RT. Efter centrifugering uppsamlades den cellulära ringen (det opaka vita skiktet) med användning av en pipett. Överföra celler till ett mikrocentrifugrör.
OBS: Det opaka vita skiktet innehåller lymfocyter såväl som monocyter och verkar mellan det nedre skiktet - separationslösningen - och det övre skiktet. - Tillsätt 1 mlPBS-lösning, och centrifugera röret vid 350 xg under 10 min. Resuspendera cellerna i 600 | il FACS-buffert.
- Tillsätt 10 | j, g / ml av renade anti-CD16 / 32-antikroppar och distribuera 100 pl av cellsuspensionen i sex separata rör (100 pl vardera).
- Märka cellerna med 100 | il av följande antikroppar eller deras tillhörande isotypkontroller utspädda i FACS-buffert: en kombination av anti-CD3 (1) / anti-B220 (1) /anti-CD45.2 och anti-Ly6C / anti-CD115 /anti-CD45.2 eller anti-CD45.2 och anti-CD115 enbart för kompensationsinställningarna.
- Inkubera alla rören vid 4 ° C under 30 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 ml FACS-buffert till varje rör, och sedan centrifugera rören under 10 minuter vid 350 xg, och kassera supernatanten med användning av en pipett.
- Resuspendera de märkta cellerna i 500 | il kall PBS. Håll celler på is och skyddas från ljus innan du utför flödescytometri och analys 10.
- Framställning av benmärgs cellsuspensioner på objektglas för mikroskopi
- Följ stegen som beskrivs i avsnitt 1.3, men i steg 1.3.1, använder 10 5 benmärgsceller, och i steg 1.3.4, snurra cellerna i varje kammare vid 72,26 xg under 10 minuter.
- Esteras aktivitetsanalyser med användning av benmärgsceller
- För att utföra benmärgs esteras cytokemi analyser utgår från steg 1,5 till 1.5.3.7.
- May-Grunwald Giemsa-färgning av benmärgsceller
- Att färga benmärgsceller, följer det protokoll som beskrivs i avsnitt 1.6, men i steg 1.6.1 Inkubera glasen i maj-Grünwald lösning för 5 min.
Representative Results
För att karakterisera C1498 musmodell fortsatte vi med två stora steg. Först var de C1498 celler karakteriseras för att bestämma deras hematopoetisk härstamning och mognad skede in vitro (Figur 1). Dessa celler injiceras sedan i kongena möss, och arten av den inducerade leukemi sjukdom bedömdes att bestämma olika funktioner: leukemicellinfiltration, deras fenotyp, en kvantifiering av de hematopoetiska cellerna (mogna och progenitorceller / prekursorer) i benmärgen, frekvenserna av C1498-celler och mogna hematopoetiska celler i blodet och en utvärdering av organ svullnad (i mjälte, lever och lungor) och cellulära sammansättning.
Att karakterisera C1498 cellfenotyper in vitro, märktes cellerna med antikroppar riktade mot molekyler som uttrycks av hematopoetiska prekursorer och mogna celler (tabell 1), och resultaten analyserades med användning flödes cytometry. De C1498-celler var positiva för cellytan uttryck av Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), och de visade intracellulär expression av CD3s, T-cellsreceptor (TCR) Vp kedjor och Mac -3 (figurerna 2A och B). Cellerna var negativa för cellytmarkörer Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 och pan-NK-molekyler och för intracellulär expression av CD4 och CD8 (data visas ej) . De undersöktes därefter för markörer av hematopoietiska stamceller och progenitorer (tabell 1). De var också negativ till cellytan uttryck av CD117, CD34, Sca-1, CD150 och CD16 / 32 (data visas ej). Dessa leukemiceller testades sedan för att bestämma uttrycket av vidhäftning, antigenpresentation och samstimulerande molekyler. Cellerna uttryckte de ytmarkörer LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), och H-2D B och var negativa för MHC klass II, CD80, CD86 och CD274 (data visas ej). C1498-celler thärför uttryckte både myeloid (Mac-1, Mac-3) och lymfoida markörer (B220, CD3, TCR).
För att bättre karaktärisera deras hematopoetisk härstamning, var myeloperoxidas uttryck utvärderas med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Alla cellerna var positiva för myeloperoxidas, som kontrollerat deras myeloid ursprung (figur 3A). En majoritet av cellerna färgades också positivt för α-naftyl butyrat esteraser (Figur 3B, vänstra panelen), och några av dem färgas för naftol som-D kloracetat esteraser (svarta pilar) (Figur 3B, högra panelen). Resultaten tyder på att de celler innehöll blandningar av monocytiska och granulocytiska celler. Efter May-Grünwald Giemsa färgning utfördes ades C1498 celler observer visa en viskning liknande morfologi med en hög Nucleo-cytoplasma förhållande, tre till fem nukleolerna i kärnan, en perinukleär halo, många vakuoler och basofila cytoplasma (Figur 3C ). thoss är C1498-cellinje bestående av monoblasts och myeloblaster.
De C1498-celler (CD45.2 +) sedan intravenöst injiceras i CD45.1 + möss. Mössen dukade under 17 till 19 dagar efter det att cellerna injicerades. Dessa möss offrades så att deras leukemi typ kunde analyseras innan de dog av sjukdomen. Kontrollmössen, som injicerades med PBS, analyserades vid samma tidpunkter för jämförelse. Den C1498 cell-injicerade möss visas massiv infiltration av C1498-celler i deras benmärg, vilket framgår av den blast-liknande utseende av cellerna efter maj-Grunwald Giemsa-färgning utfördes (Figur 4A). De bevarade också deras monocytiska och granulocytiska fenotyper (figur 4B och C), vilket visar en ackumulering av monoblastic och myeloblastisk celler som är kännetecknande för akut myelomonocytisk leukemi.
till determine om medullär hematopoetiska celler siffror var lägre efter leukemiceller invasion, CD45.2 + C1498-celler, B lymfocytisk, monocytisk och granulocytiska populationer (inklusive stamceller, prekursorer och mogna celler), kvantifierades med hjälp av immunofluorescerande färgning och multi-parametrisk flödescytometrianalys. Leukemiceller representerade 16-36% av de hematopoetiska cellerna (data visas ej). De andra celltyper var alla närvarande i signifikant lägre numren på C1498-injicerade möss än i de PBS-injicerade möss (genom 5-faldig i genomsnitt för B-cellsunderuppsättningar, 4-faldigt i genomsnitt för granulocytiska celler och 3-faldigt i genomsnitt för monocytiska delmängder) (Figur 5A till C).
En undersökning av frekvenserna av mononukleära celler i leukemi och muskontroll blodprov visade att de innehöll en jämförbar andel av lymfocyter (Figur 6A) men en högre frekvens av monocytiskoch leukemiska celler. Dessa egenskaper är representativa för akut myelomonocytär leukemi 11 (Figur 6B).
Bland andra funktioner i akut myelomonocytär leukemi 12, de C1498-injicerade möss presenteras med svullna levrar (hepatomegali), lungor och mjälte (splenomegali) (Figur 7A). Olika frekvenser av CD45.2 + C1498-celler detekterades i dessa organ med hjälp av immunofluorescerande färgning och flödescytometri analys (Figur 7B). Som splenomegali kan bero på ett stort antal infiltrerade monocyter, uppskattade vi också proportionerna av mjälten populationer. Antalet celler i B lymfatisk, monocytisk och granulocytiska cellfraktioner var betydligt större, med i genomsnitt två gånger, 2,5 gånger och tre gånger, respektive, i leukemi mjältar än i kontroll mjältar (Figur 7C).
tunn-page = "1"> 
Figur 1. Schematisk representation av protokollet Konfigurera för att karakterisera in vitro odlade C1498 cellinjer och in vivo Beskrivningar av akut leukemi. Den hematopoetisk härstamning och differentiering skede av vävnads odlade C1498-celler bestämdes först. C1498-celler injicerades sedan i kongena möss för att inducera utvecklingen av akut leukemi. Isolering av benmärg, perifert blod, mjälte, lever och lungvävnader utfördes för att bestämma de frekvenser, fenotyper och morfologiska förändringar efter C1498-celler infiltration. IV: Intravenös MGG:. May-Grünwald Giemsa klicka god här för att se en större version av denna siffra.
ad / 54270 / 54270fig2.jpg "/>
Figur 2. Fenotypisk analys av C1498-celler efter odling. In vitro Representant flödescytometri dot tomter och histogram av cellytan (A) och intracellulära (B) C1498-uttryckt molekyler som var förknippade med hematopoetisk mogen celldifferentiering visas. C1498-celler skördades från odlingar, tvättas och märks med fluorescerande antikroppar som var specifika för cellytan CD11b, CD18 och B220 markörer eller deras isotypkontrollerna. För intracellulär färgning, fixerades cellerna, permeabiliserades och märkas med användning av antikroppar riktade mot Mac-3, CD3s, och en gemensam epitop av TCR (T-cellreceptor) Vp-kedja eller deras isotypkontroller. Analyser utfördes med hjälp av grind med levande celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Funktions och morfologisk karakterisering av Cultured C1498 Cells. C1498-celler skördades från kulturer och centrifugerades på objektglas för mikroskopi. (A) Färgning för myeloperoxidas expression utfördes med användning av immunofluorescens. (B) cytokemiska reaktioner användes för att analysera α-naftyl butyrat esteras (NBE) och naftol AS-D kloracetatesteras (CAE) aktiviteter i C1498-celler. Celler ansågs vara positivt för varje etikett när brun och röd-lila, stora cytoplasmiska granuler, respektive, observerades. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) färgning av C1498-celler. För varje färgningsexperiment, är mikroskopi objektivförstoring anges. Varje bild är representativa för tre separata experiment.large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Benmärgs morfologier i PBS och C1498-injicerade möss. Benmärgsceller isolerades från PBS och C1498 cell injicerade möss och centrifugeras på objektglas för mikroskopi. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) färgning. (B ) α-naftyl butyrat esteras (NBE) och (C) naftol AS-D kloracetatesteras (CAE) funktioner utvärderades med användning cytokemi. I panel A, bandet (omogna) eller segmente (mogna) neutrofiler är mindre synliga i benmärgen av C1498-injicerade möss än PBS-injicerade möss. Panel B och C indikerar att det fanns en ansamling av monocytiska och granulocytiska celler i leukemisk benmärg jämfört med antalet som observerades i kontroll benmärgen. Alltmikroskopiska analyser genomfördes med hjälp av en 100 gångers förstoring mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kvantitativ analys av Medullary populationer i PBS och C1498-injicerade möss. Benmärgsceller isolerades från PBS och C1498 cell injicerade möss och beräknas efter cellräkning genomfördes. Frekvenserna av de olika cellpopulationer bestämdes efter immunfärgning och levande cell gated flödescytometrianalys. (A) B-cellsundergrupper ingår CD19 + B220 + celler i etapper från pro-B-celler att mogna B-lymfocyter (B) granulocytiska celler i CD3 - och CD11b + Ly6G + linjer, som ingår prekursorer a. nd omogna och mogna granulocyter (C) De monocytiska grupper definierades som CD3 - CD115 + och ingår celler i stamfader till mogna monocyt steg. n = 7 möss / grupp och data presenteras som histogram som visar medelvärden ± SEM. *** P <0,0001 och ** p <0,01, oparat Students t- test som jämförde PBS och C1498-injicerade möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Blod Analys av mononukleära cellundergrupper i PBS och C1498-injicerade möss. Representativ flödescytometri punktdiagram av (A) T- och B-lymfocyt-procentsatser, vilka respektive definierade som CD3 + och B220 + -celler i PBS och C1498 cell injicerade. möss (B) monocytisk cell frekvenser i C1498 leukemi och kontroll (PBS) möss bestämdes genom att analysera CD115 + Ly6C - och CD115 + Ly6C höga celler. Analysen utfördes genom grind levande celler. Att jämföra leukemi och kontrollmöss, CD45.2 + C1498-celler uteslöts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Uppskattning av Mjält populationer i Leukemi och kontrollmöss. (A) Representativa fotografier av lever, lunga och mjälte svullnad i leukemiska möss jämfört med kontrollmöss. Mjältar samlades och vägdes, och splenocyter räknades efter avbrott vävnad. (B) histogram representerar leukemicellfrekvenser i difftekniker när organ efter immunfärgning utfördes under CD45.2 + celler och resultaten analyserades med användning av flödescytometri. (c) beräkningar av mjält-B, granulocytiska och monocytiska cellantal efter immunfärgning och flödescytometrianalys gating utfördes för att identifiera levande CD19 + B220 + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - och CD3 - CD11b + Ly6C höga celler. Skalstaplar som visas för lungor, mjälte och lever anger 1 cm. .. n = 5-8 möss / grupp, och data är representerade i histogram som medel ± SEM *, p <0,05, **, p = 0,0033, oparade Students t- test som jämförde PBS och C1498-injicerade möss Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| celltyp | Membran eller intracellulära molekyler |
| Prekursorer och mogna celler | |
| NK-celler | NK1.1 +, pan-NK + |
| NKT-celler | NK1.1 +, pan-NK +, TCR vbeta + (8,2), CD3 + |
| T-lymfocyter | TCR vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + |
| B-celler prekursorer och B-lymfocyter | B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + |
| granulocytiska prekursorer och granulocyter | Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + |
| monocytiska prekursorer och monocyter / makrofager | CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi |
| progenitorer | |
| multipotenta progenitorer | CD117 + Sca-1 + CD34 + (Lin- CD150-) |
| lymfoida-primas multi stamceller | CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-) |
| vanliga lymfoida stamfäder | CD117lo Sca-1lo CD127 + (Lin-) |
| gemensamma myeloida stamceller | CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- Sca-1) |
| granulocyt-makrofag stamceller | CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- Sca-1) |
| megakaryocyt-erytroida progenitorer | CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- Sca-1) |
| Hematopoetiska stamceller | CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34-) |
Tabell 1. Markörer för hematopoetiska cellinjer och differentiering.
CD: kluster av differentiering; Lin: markörer för mogna celler; lo:låg expression; hej: hög uttryck; int: mellan uttryck; NK: naturliga mördarceller; TCR: T-cellreceptor.
Discussion
I tidigare studier var det C1498-cellinjen beskrivs som en inducerare av akut granulocytisk 5, myelomonocytisk 6 eller NKT 7 celleukemi. Men demonstrativa data i litteraturen var antingen frånvarande eller ofullständig. Protokollet presenteras här använder olika tekniker, såsom flödescytometri, immunofluorescens, MGG färgning och cytokemiska analyser, att karakterisera odlade C1498-celler och för att fastställa vilken typ av leukemi som induceras i möss när de injiceras.
När vi fenotypades i C1498 vitro odlade celler efter immunfärgning och flödescytometri analyser utfördes, observerade vi vissa begränsningar, eftersom dessa celler uttryckte några cellyte hematopoetiska markörer som tidigare har beskrivits i litteraturen 6,7. I överensstämmelse med våra resultat, gjorde Labelle et al. Inte observera cellytan uttryck av mogen TCR på C1498-celler med hjälp av flödes cytometry färgning. Däremot ansåg de att de är en NKT cellinje efter att de upptäckt CD3s och TCRVβ8.2 mRNA 7. Vi observerade också intracellulär expression av TCRVβ kedjor och CD3s molekyler i de flesta av cellerna (> 70%), men deras hematopoetiska härstamningar kunde inte fastställas eftersom det fanns också samtidig intracellulär expression av Mac-3-molekylen.
Myeloperoxidas, MGG färgning och bedömningar för att analysera funktionella esteraser använder cytokemi visade att C1498 cellinje hade en myeloid ursprung och bestod av monoblasts och myeloblaster. Dessa resultat var samstämmiga med andelen Mac-3 + celler som erhölls i flödescytometri färgning analys. Även om det inte kvantitativ, dessa steg utgör viktiga experiment som ska utföras. De är i, så långt, den bästa existerande metoder för att karakterisera den härstamning och differentieringsstadiet av hematopoietiska celler som uttrycker ingen eller few specifika fenotypiska markörer.
Flödescytometri färgning var till hjälp för att visa utvecklingen av akut leukemi i kongena möss efter C1498-celler injicerades intravenöst. De CD45.2 + C1498-celler som infiltrerade in i perifert blod och olika organ isolerades och deras frekvenser bestämdes. Kvantifiering genomfördes också för att analysera inneboende medullär och mjältceller efter immunfenotypning. Begränsningar påträffades när C1498 cellfenotyp undersöktes i organ som de uttryckte några hematopoetiska markörer (endast ett fåtal av dem var B220 +). För att definiera vilken typ av observerade akut leukemi, May-Grünwald Giemsa färgning och en analys av verksamheten monocytiska och granulocytiska esteraser utfördes med användning av benmärg. Resultaten visade att C1498 celler bevarat sin myeloblastisk och monoblastic morfologi och funktion, avslöjar uppkomsten av myelomonocytär leukemi.
(t.ex., blod, benmärg och mjälte-celler) förvaras på is under förfarandet. Om ingen färgning observeras i flödescytometri och / eller immunofluorescens experiment referens av antikropparna, deras lagrings rebör kontrolleras commendations och deras spädningar. Referenserna anges i material / utrustning tabellen har valts ut för flödescytometri eller immunofluorescens applikationer. De primära / sekundära antikroppar eller deras konjugerade fluoroforer kan ha förlorat sin verksamhet på grund av olämplig förvaring (t.ex. exponering för ljus eller värme), felaktig utspädning, omfattande frysning / upptining eller användning av förorenade buffertar. Kör positiva kontroller för att säkerställa att de fungerar korrekt. Använd musen benmärg eller mjälte härledda celler som är kända för att uttrycka proteiner av intresse. För att undvika hög bakgrund och icke-specifik färgning, se till att cellerna tvättas ordentligt och hålls vid hög luftfuktighet (för immunofluorescens) och att antikropparna späds enligt anvisningarna. Använd samma koncentration och utspädning för isotypkontrollantikropp och den primära antikroppen för att noggrant bestämma bakgrundsnivån i provet. För esteras cytokemi experimentreagens kan testas med hjälp av positiva och negativa kontrollobjektglas som innehåller renat mus mjälten granulocytiska (Ly6G +) och monocytiska (CD115 +) celler.
Det förfarande som beskrivs i denna studie visade att många av de leukemi funktioner som observerats hos möss efter injektion av C1498-celler delade gemensamma kännetecken med humant akut myelomonocytär leukemi 11,12. De invaderade leukemiceller resulterade i en minskning av mogna och omogna (progenitorceller och prekursorer) medullär hematopoetiska celler. C1498-celler är närvarande vid hög frekvens (> 20%) i det perifera blodet, som är monocytiska celler. Hepatomegali och splenomegali observerades att resultatet av infiltration av leukemiceller, och signifikanta ökningar i B-lymfocyter och myeloidceller observerades också att följa med splenomegali. Trombocytopeni observerades också när blodplättar tal uppskattades med hjälp av en hematologianalysator.
Det var shown, med hjälp av in vitro-experiment, som C1498 celler hämmar normal murin hematopoes genom att utsöndra lösliga faktorer 13. I flera modeller tumör mus har omogna myeloidceller (inklusive monocytiska och granulocytiska celler) också visat att migrera från benmärgen till mjälten, där de hämmar antitumörspecifika T-cellsaktivering och proliferation 14. Sålunda kunde minskningen av hematopoietiska celler som observerades i benmärgen har resulterat från antingen en brist i hematopoes och / eller från deras emigration. Denna senare mekanism skulle kunna förklara förekomsten av monocytosis i perifert blod eller observation av förstorade myeloida fraktioner i mjälten. Det är också tänkbart att dessa celler kan ha härletts från förbättrad mjälten blodbildningen. Faktiskt, under stationära betingelser, var några undergrupper av mjält-B-celler som prekursorer av mogna B-lymfocyter 15. Inom ramen inflammatoriska tillstånd, Medullary stam- och progenitorceller har visat att flytta till mjälten för att inducera produktionen av mogna monocyter 16. Detta protokoll tillåter oss inte att dra slutsatser om de mekanismer som är involverade i utvecklingen av leukemi, och ytterligare funktionella samt molekylära analyser bör användas för att göra det. Dessa uppgifter omfattar detaljerad information om de kliniska särdragen i akut myelomonocytär leukemi och hjälper forskare att utvärdera och förstå effekterna av nya läkemedel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
| C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
| Cells culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
| HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
| Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
| Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
| Flow cytometry staining reagents | |||
| anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
| anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
| anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
| anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
| anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
| anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
| anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
| anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
| anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
| anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
| purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
| anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
| anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
| anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
| anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
| anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
| anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
| anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
| anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
| anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
| anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
| anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
| anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
| anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
| anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
| anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
| anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
| anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
| anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
| anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
| anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
| anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
| streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
| Immunofluorescence staining reagents | |||
| Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
| anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
| Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
| Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
| Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Esterase cytochemical staining reagents | |||
| Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
| Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
| pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
| Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
| Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
| Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
| mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
| May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
| May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
| Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
| pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
| Others materials, reagents and equipment | |||
| Ketamine 1000 (100 mg/ml) | VIRBAC | 3597132111010 | |
| Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml) | CEVA | ||
| Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
| PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
| Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
| Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10x) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
| NaOH 10 N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
| 50 ml tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
| Microscope Cover Glasses, 24 x 24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
| Slides (Starfrost - ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
| EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
| Pasteur Pipette 150 mm (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
| 26 G needle | Terumo | NN-2613R | |
| insulin syringe and needle 29 G | Terumo | BS05M2913 | |
| 30 G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
| Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
| Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
| Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
| Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
| Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
| Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cylindrical Restrainer 15 - 30 gm | Stoelting | 51338 | |
| Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
| 10 ml syringe | Terumo | SS-10L | |
| 1 ml syringe | Terumo | SS-01T | |
| Ethanol | Merck | 1.08543 | |
| Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |
References
- Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia. Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).
- Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice. Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).
- Tanaka, K. K., Roberts, E. Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice. Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).
- Law, L. W. Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice. Cancer Res. 4, 257-260 (1944).
- Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498. Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).
- Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia. Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).
- Labelle, J. L., Truitt, R. L. Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia. Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).
- Bradner, W. T., Pindell, M. H. Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents. Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).
- Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside. Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).
- Robinson, J. P. Handbook of Flow Cytometry Methods. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).
- Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation. Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).
- Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features. J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).
- Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. N.Engl.J. Med. 299 (2), 71-75 (1978).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).
- Loder, F., et al. B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals. J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
