Introduction
Compressione portanti tessuti come la cartilagine articolare o dischi intervertebrali sono costituiti da regioni tessuti eterogenei che sono fondamentali sia per la funzione biomeccanica e adeguata meccano-trasduzione nel tessuto. Non solo è l'organizzazione cellulare e funzione distinta in diverse regioni, ma le matrici extracellulari (ECM) sono inoltre variazioni nella composizione e organizzazione. Ad esempio, cartilagine articolare è costituito da tre zone primarie con diversi morfologia cellulare, funzione meccanica e ECM. Le differenze a cambiare ECM al differenziale responsabilità portanti; lo strato superficiale è coinvolto soprattutto in risposta alla trazione per caricare, mentre le zone centrali e profonde sono principalmente responsabili per la risposta alla compressione 1. Allo stesso modo, nel disco intervertebrale, un nucleo polposo simile a gel è circondato da un anello di fibrosi lamellare e le cellule all'interno di queste due aree distinte sperimentare diversi tipi di stimoli biofisici2. In questi tipi di tessuti, cellule e le matrici extracellulari all'interno degli strati di tessuto interagiscono tra loro come il tessuto subisce e risponde a forze meccaniche.
Ricapitolazione di tali strutture dei tessuti eterogenei rimane una sfida in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa, e la nostra comprensione del loro significato biologico è limitato. Vi è la necessità per la coltura piattaforme per analizzare tessuti stratificate nonché co-colture di diverse popolazioni di cellule all'interno di un costrutto. In ingegneria dei tessuti cartilagine articolare, costrutti scaffold meno strati sono stati costruiti sfruttando la capacità dei condrociti zonali per depositare varia ECM per simulare i diversi strati di questo tessuto 3,4. Tuttavia, a strati costrutti idrogel forniscono un'opportunità per indagare l'interazione di diversi tipi di popolazioni di cellule che non hanno la capacità di formare un tessuto robusto in modo indipendente. Ad esempio, pop diversoulations di cellule staminali mesenchimali possono essere co-coltura all'interno di costrutti a strati. Tali ponteggi strati sono stati utilizzati sia con condrociti e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali per migliorare ingegneria tissutale 5. Non solo è possibile diverse popolazioni cellulari essere co-coltura in strati di idrogel simili, ma un unico tipo di cellule possono anche essere coltivati all'interno di strati che sono state manipolate per avere diversa rigidità o il contenuto biochimico per ottenere risposte diverse dalle cellule 6,7.
Molti idrogel biomateriali differenti sono stati utilizzati per sovrapporre popolazioni cellulari per l'ingegneria tissutale cartilagine come quelle realizzate con glicole polietilene o basi alcool polivinilico 7-9. Tuttavia, idrogel alginato sono uno dei biomateriali semplici da cui creare scaffold stratificate per studiare popolazioni cellulari eterogenee in co-coltura. Mentre idrogel agarosio sono anche facilmente formate, idrogel alginato hanno il vantaggio di consentire facile èolation di celle dal costrutto 3-D per l'analisi delle singole celle come è stato descritto in precedenza 10. In studi precedenti, idrogel alginato bi-strati sono stati formati in fogli sottili e da questi fogli, sezioni sono state fette (ad es., Usando un punzone biopsia) per particolari applicazioni come per l'analisi del contenuto biochimica o proprietà di taglio interfacciali 11,12. Un altro metodo per formare fogli sottili alginato è stato descritto con il potenziale per la stratificazione in più strati, ma richiederebbe alterazione del idrogel per l'uso in test meccanici 13.
Qui, vi presentiamo un metodo per la creazione di dischi riproducibile idrogel alginato bi-strati per l'utilizzo in co-coltura di diverse popolazioni di cellule. Questa piattaforma disco alginato possiede diversi vantaggi. Principalmente, la forma riproducibile e piccole dimensioni è favorevole per la stimolazione meccanica delle cellule incorporati senza richiedere una biopsia punch o altra modifica fisica alla idrogel per molte applicazioni. Inoltre, la vitalità cellulare rimane elevato durante il processo di stratificazione, e dopo la formazione del gel netta separazione di due popolazioni di cellule all'interno del gel è visibile senza regione di sovrapposizione iniziale.
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Protocol
1. Preparazione per la Formazione di alginato di dischi
- Preparare un 4% (w / v) soluzione di alginato a 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di aggiunta di calcio o cloruro di magnesio e posto in un bagno d'acqua 37 ° C. Le concentrazioni di soluzione di alginato può variare, ma 1 - 4% (w / v) sono raccomandati soluzioni di alginato.
- Mescolare la soluzione di alginato con un rapporto di 1: 1 con base mezzi di coltura cellulare caldo (ad esempio, di Dulbecco Modified Eagle Medium.) Per il tipo cellulare desiderato. La concentrazione alginato è ora metà della concentrazione iniziale, cioè., 2% (w / v). Sterilizzare alginato / soluzione multimediale utilizzando sterili 0,2 micron filtri di nylon siringa.
- Preparare un bagno di sterile 102 mM cloruro di calcio diidrato in acqua sterile con soluzione sufficiente per sommergere stampi (~ 200 - 300 ml).
- Raccogliere la sterile "di stampo formazione di gel" (6 mm di diametro x 3 mm pozzi cilindrici alti in un 3 a 3 x in lamiera di alluminio, vedere
- Tagliare carta spessa filtro (carta da filtro assorbente) e la membrana cellulare microsieve (10 micron dimensioni dei pori) per le dimensioni della parte superiore e inferiore piastre laterali e metterli nella vasca da bagno di cloruro di calcio fino a saturazione, circa 1 min. Se lo si desidera, sterilizzare il filtro di carta spessa e la membrana microsieve tramite autoclave o luce ultravioletta per 30 minuti prima dell'uso.
- Set-up metà (la metà inferiore) del costrutto stampo.
- Posizionare i seguenti elementi in cima l'un l'altro nel seguente ordine e lisciare con una spatola sterile: grande endplate (3 x 3), carta da filtro di spessore, e quindi la membrana microsieve.
- Capovolgere e premere lo stampo su una pila di tovaglioli di carta per assicurare la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso.
- Posizionare il "muffe gel" con i pozzetti cilindrici in cima alla cell microsieve membrana e delicatamente fissare lo stampo insieme su due lati con legante clip sui lati destro e sinistro. Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per la placca superiore (1,5 in x 3) per coprire completamente i pozzetti in seguito.
- Allestimento seconda metà (la metà superiore) del costrutto stampo.
- Posizionare i seguenti elementi in cima l'un l'altro nel seguente ordine e levigare: piccola placca motrice, carta da filtro di spessore, a membrana microsieve.
- Invertito e premere questo metà dello stampo su una pila di asciugamani di carta per garantire la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso. Non fissare questo metà dello stampo utilizzando clip legante in questo momento.
Nota: quando si utilizza questo metodoper fare gli strati con differenti tipi di cellule, assicurarsi di cultura due tipi di cellule in parallelo per la stratificazione. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) seminate ad una densità cellulare di cellule 1 x 10 6 / ml sarà utilizzato come esempio per il seguente protocollo. numero di cellulare e numero del disco possono essere scalati per esperimenti, se necessario.
- Una a due settimane prima incorporamento, cellule staminali seme mesenchimali ad una densità cellulare di 3.000 - 5.000 cellule / cm 2 in 10 ml di terreni di crescita basale (Dulbecco Modified Eagle Medium, 10% siero fetale bovino, 2% L-Glutammina, 1 % non-aminoacidi essenziali, 1% penicillina / streptomicina) in T-75 fiaschi.
- Rimuovere media speso ogni 2 - 3 giorni e sostituire con 10 ml di mezzi di crescita basale finché le cellule sono 80 - 90% confluenti.
- Per raccogliere le cellule, rimuovere i supporti spesi, e pipetta da 3 ml di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di calcio aggiunto o cloruro di magnesio per sciacquare le cellule. Rimuovere questa soluzione, pipetta 3 ml di 0,25% TryPSIN-EDTA su cellule in crescita in T-75 fiaschi, e incubare per 5 min a 37 ° C. Dopo che le cellule hanno sollevato dalla superficie di adesione aggiungere 6 - 9 ml di terreni di crescita basale.
- MSC centrifugare a 600 xg per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e risospendere in: 1 - 5 ml di terreni di crescita basale. Contare le cellule utilizzando un emocitometro utilizzando istruzioni del dispositivo.
- Rimuovere 1 x 10 6 cellule dalla risospensione delle cellule totali, centrifugare utilizzando le stesse condizioni, e aspirare il surnatante.
2. Formazione di cellule Seeded alginato dischi
- Risospendere il pellet cellulare con 1 ml di soluzione di alginato / media sterile per ottenere una densità cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml. La miscela di cellule-alginato sarà omogeneamente nuvoloso in aspetto quando le cellule sono mescolati in modo appropriato.
- Pipettare 130 ml di miscela di cellule-alginato in sei diametro di 6 mm x 3 mm pozzi alti nella metà inferiore dello stampocostruire goccia a goccia, in modo da non creare bolle. Un leggero menisco convesso deve essere visibile sopra il bordo di ciascun pozzetto.
- lisciare cautela la metà superiore del costrutto stampo usando una spatola sterile e capovolgerlo, in modo che la membrana microsieve cellulare è in cima pozzetti. Posizionare lo stampo costrutto sopra dei pozzetti, facendo attenzione a coprire i pozzetti contenenti le cellule e la miscela alginato completamente.
- Sollevare il costrutto di stampo caricato e, tenendo premuto con forza sul centro, Fermaglio a molla i restanti due lati (superiore e inferiore) per fissare le due metà superiore e inferiore del costrutto stampo. Le soluzioni cell-alginato devono essere immerso saldamente in pozzetti in questo momento.
- Immergere il costrutto di stampo fissato in 102 mm bagno di cloruro di calcio, facendo in modo che l'intero costrutto è sommerso. Incubare nel cofano coltura cellulare a temperatura ambiente per 90 min.
- Alla fine del 90 min, rimuovere il costrutto stampo dal cloruro di calcio 102 mMbagno e posto su una pila di asciugamani di carta nel cofano coltura cellulare. Rimuovere tutte e quattro le clip legante e separare le due metà del costrutto stampo. Gli idrogel formati in pozzetti non dovrebbero avere eventuali bolle e devono riempire completamente i pozzetti.
- Utilizzando una spatola, accuratamente tracciare il bordo dei pozzetti contenenti gli idrogeli per allentare attentamente e incuneare le idrogel. Dopo aver rimosso i idrogel dal costrutto stampo rilasciare gli idrogeli direttamente in un bagno di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e cloruro di magnesio. Coprire i gel completamente per lavare via la soluzione di cloruro di calcio in eccesso per 1-5 min.
- Trasferire i idrogel nella soluzione basale terreni di crescita in piatto desiderato (ad es., Piastre 6 e) che copre completamente i idrogel. Incubare per almeno 1 ora in incubatrice coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 prima di passare alla fase stratificazione.
Nota: Gli idrogel che contengono le cellule possono essere tenuti inincubatore di coltura cellulare indefinitamente in questo momento fino stratificazione di gel con un'altra popolazione cellulare è desiderato, purché le modifiche di supporto vengono completati ogni 2 - 3 giorni.
3. Stratificazione di alginato di dischi
- Durante l'ultima mezz'ora della incubazione 1 ora, raccogliere e preparare stampi sterili e soluzioni per la ricottura i gel.
- Preparare la "stampo taglio" fissando uno stampo che ha pozzetti la metà dell'altezza della "muffe gel" (da 6 mm di diametro x 1,5 mm pozzi alti in 3 x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro.
- Preparare la "stampo annealing" fissando uno stampo che è di 3 mm di diametro maggiore del "muffe gel" (diametro di 9 mm x 3 mm pozzi alte in un 3 a x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro.
- Preparare una soluzione di100 mM citrato di sodio / 30 mM EDTA (citrato di sodio diidrato, etilendiamminotetraacetico tetrasodico dell'acido sale diidrato) in acqua sterile.
- Rimuovere gel di popolazioni cellulari desiderato (in questo esempio, due dischi con hMSCs) da parte dei media nel piatto, e il luogo in pozzi "di taglio di muffa". Ogni gel dovrebbe andare bene comodamente nei pozzetti con la metà del gel che sporge sopra lo stampo.
- Usando un bisturi, tagliare il gel lungo la superficie dello stampo (questo intercettato idrogel a metà). Vibrazione la metà superiore del gel e metterlo in un pozzo stampo aperto. La metà del gel dovrebbe adattarsi comodamente nello stampo bene, ma ora entrambi i gel mezzo dovrebbe essere l'altezza dello stampo con la superficie interna tagliata visibile. Ripetere con la seconda gel.
Nota: Attenzione: solo le superfici di taglio interne formeranno dischi sovrapposti. Utilizzando le superfici esterne comporterà la metà di separazione. Si sospetta che trama dalla membrana microsieve trasferito sulla superficie del gel impedisconos successo del processo di ricottura. - Posizionare un pezzo di secca membrana cellulare microsieve sopra dei pozzetti, facendo in modo che la membrana microsieve è in contatto con tutte le metà gel essere ricotto e li copre completamente. Posizionare la carta filtro spesso sulla parte superiore della membrana microsieve, avendo cura di coprire completamente i gel.
- Pipettare una soluzione di 100 mM di sodio citrato / 30 mM EDTA (sodio citrato diidrato, etilendiamminotetracetico tetrasodico dell'acido sale diidrato) sulla carta filtro spesso fino a saturazione. Circa 750 ml è sufficiente per quattro pozzi.
- Incubare i gel per 1 min a temperatura ambiente. Poi, rimuovere la membrana microsieve cellulare e carta da filtro di spessore e gettarli. Rimuovere le clip legante e aprire lo stampo.
- Per ogni gel ricotto, trasferire uno citrato di sodio / trattato con EDTA metà del idrogel al preparato "stampo ricottura" con la superficie di taglio verso l'alto. Questo sarà una metà del const ricottoruct.
- Utilizzando una spatola, sollevare e posizionare un citrato secondo sodio / trattato con EDTA half-gel (può contenere un diverso tipo di cellula) sul gel già nel "muffa annealing", lanciando questa seconda metà gel in modo che la superficie di taglio è in contatto con la superficie di taglio del gel già nel "stampo annealing".
- Premere delicatamente verso il basso le due gel utilizzando una spatola per eliminare eventuali bolle tra le due gel. Inoltre, riposizionare i gel come necessario per assicurarsi che essi sono direttamente sopra l'altro.
- Sollevare delicatamente la "muffa ricottura" e immergerlo nella vasca 102 mm di calcio cloruro per 30 min. Non coprire i pozzetti con una placca motrice.
- Dopo l'incubazione 30 minuti, rimuovere il "muffa ricottura" e posizionarlo sulla carta assorbente. Rimuovere le clip legante e separare lo stampo dalla placca.
- Utilizzando una spatola, raccogliere i gel ricotto e metterli in un 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e mbagno di cloruro di agnesium per lavare i gel. Successivamente, il trasferimento idrogel ricotto per terreni di coltura di cellule in un piatto desiderato (ad es., 6 pozzetti) per la cultura.
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Representative Results
La figura 1 illustra la formazione e la stratificazione degli idrogel alginato. Completato gel bi-strati presentano una separazione iniziale completa di popolazioni cellulari come mostrato in Figura 2. La vitalità cellulare di cellule staminali mesenchimali umane) incorporato all'interno di questi idrogel e stratificato rimane elevata e paragonabile a idrogel di massa come mostrato in figura 3. La vitalità è stata valutata dopo ricottura, affettare i gel verticalmente per accedere al centro e poi colorazione delle cellule vive nei gel ricotto con un tracker cellule vive, CMFDA (verde) e le cellule morte (rosso) con etidio omodimero-1 utilizzando le istruzioni del produttore. Confocale Z-stacks sono stati presi della superficie di taglio utilizzando un microscopio a fluorescenza circa 100 micron nel gel. Queste immagini sono state proiettate un'immagine 2D in. cellule vive e morte sono stati poi quantificati utilizzando la funzione di analizzatore di particelle nel software ImageJ.
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Figura 1:. Schema di Layered Hydrogel Formazione A. Immagine dello stampo accatastati per l'aggiunta di miscela di cellule 2% alginato + con una raffigurazione del l'ordine di sovrapposizione per le metà dello stampo inferiore e superiore. B. Schema raffigurante procedura per la stratificazione del gel. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Separazione Rappresentante di popolazioni di cellule nella linea cellulare Layered idrogel Modello cellule 293FT HEK sono stati sia macchiata di Live Tracker cellulare CMFDA (verde) o CMTPX (rosso). Ciascuno di questi gruppi di cellule sono stati incorporati nel 2% (w / v) dischi alginato, quindi metà di questi dischi sono stati stratificati insieme. Un pezzo è stato tagliato dal lato CMTPX per identificarlo durante l'imaging. Barra di scala = 100 & #181;. M Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Vitalità cellulare ad alta all'interno di strati idrogel dopo stratificazione processo è completo cellule staminali mesenchimali umane incorporati in idrogel di massa e bi-layer sono state colorate con cellule vive (verde) inseguitore CMFDA e le cellule morte (rosso) sono state colorate con etidio omodimero-1 . Viabilità è rimasta alta per entrambi i gruppi di idrogel dopo il processo di stratificazione. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
figur. e 4: significativamente differenti tendenze di strati idrogel ciclico compressione Response to ciclico compressione Gli idrogel sono state incubate in un incubatore di coltura cellulare per sette giorni e successivamente sottoposti a 0 - 10% di compressione ciclica non confinato per quattro ore a 1 Hz. sollecitazioni di picco (± SEM) per ciascun ciclo sono stati isolati e le tendenze nel corso del periodo di carico analizzati. Trends in compressione ciclica non confinato 0-10% di deformazione di strati (n = 9) e la massa (n = 8) gel sono significativamente differenti (p = 0,03). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di dischi idrogel alginato stratificate per lo studio co-colture di più popolazioni cellulari, come quelli nei tessuti fisiologicamente strati, ad esempio, la cartilagine. strutture stratificate, come la piattaforma coltura descritto, possono essere utilizzati per esaminare l'interazione tra due distinte popolazioni cellulari sottoposti allo stesso ambiente coltura o sotto carico.
Alginato è un polisaccaride lineare anionico che è stato trovato per essere biocompatibile ed è stato utilizzato con successo per la biologia cartilagine e l'ingegneria dei tessuti di ricerca 12,14. Idrogel alginato sono formati utilizzando cationi bivalenti per reticolazione, ad es., Ioni calcio. Questi legami trasversali possono essere annullate rimuovendo i cationi utilizzando un chelante, come citrato di sodio o EDTA, e questo processo è stato precedentemente utilizzato per isolare i condrociti che sono stati coltivati in gel 3,4,12. Analogamente, lo stesso principioè stato anche applicato con successo per aderire fogli alginato in bistrati o anche gruppi di perline alginato insieme 11,12,15. La piattaforma qui descritto si basa su questo stesso processo, ma è usato per formare piccole idrogel strati a forma di disco. Questo è un processo in due fasi in cui il primo, dischi alginato sono formati utilizzando stampi immersi in un bagno ricca di calcio. Questi sono poi tagliati a metà e trattati con una soluzione chelante calcio per rilasciare localmente gli ioni calcio dal alginato reticolato. Inserendo queste superfici trattate insieme e ri-immergendo i dischi in una soluzione ricca di calcio, legami crociati sono riformati, facendo costrutti bi-strati. Questi piccoli gel strati eliminano la necessità di punzoni biopsia per generare campioni di facile coltura compatibili con saggi ed esperimenti come prove meccaniche, come mostrato in figura 4, minimizzando così spreco di cellule spesso preziosi e materiali di fabbricazione.
Come mostrato inFigura 3, il processo di formatura e stratificazione idrogel provocato altrettanto elevata redditività come controllo o idrogel rinfusa indica che questa procedura non è eccessivamente tassazione alla popolazione cellulare nonostante la lunghezza e la mancanza di nutrienti ricostituenti. La mancanza di una regione di sovrapposizione iniziale nel gel permette la separazione fisica durante iniziale co-coltura e la capacità di osservare modifiche a tale interfaccia nel tempo. Studi hanno dimostrato che su periodi lunghi di coltura questa interfaccia può perdere definizione a causa di cellulare cross-infiltrazione e la deposizione di matrice extracellulare 11. Mentre il disco stratificato iniziale non contiene molecole di adesione, come matrice extracellulare viene depositato, c'è anche un potenziale per indagare la fusione di popolazioni cellulari e l'interfaccia cambiando tra gli strati.
Questi dischi bi-strati possono essere utilizzati facilmente per la stimolazione compressione dinamica. Siamo stati in grado di confermare che these idrogel sopportare la compressione dinamica senza separazione delle metà. Tuttavia, durante questo processo, carico di punta esibita dai idrogel strati durante la compressione ciclica quattro ore sono risultati essere significativamente diverso dal non-stratificata, bulk, idrogel. Questo risultato suggerisce complesso, trasferimento ceppo non-lineare tra gli strati e rivela la necessità di un gel di controllo fisicamente strati, es., Idrogel bi-strato con la stessa popolazione cellulare / condizione in ogni strato, un dettaglio importante notare durante la pianificazione disegno sperimentale per gli studi riguardanti il carico meccanico. Una migliore comprensione delle differenze osservate potrebbe essere raggiunto attraverso la modellazione computazionale della meccanica spaziali all'interno di questi gel. Non solo sarebbero tali analisi aiutano a chiarire la distribuzione delle deformazioni e trasferimento tra gli strati, ma sarebbe anche strumentali per interpretare il comportamento cellulare in questi gel strati, soprattutto con strati di diverse proprietà meccaniche.
Questa piattaforma wa culturas sviluppato per applicazioni di ricerca per indagare le relazioni tra le diverse popolazioni di cellule in coltura 3D. Così, è limitata dalla sua mancanza di scalabilità per applicazioni cliniche. Metodi alternativi per la creazione di idrogel a strati, come la stampa 3D, possono in definitiva essere più clinicamente rilevante grazie ai progressi di scalabilità futuri attesi, il controllo sulla microstruttura nell'interno del disco, e possibilità di personalizzazione delle caratteristiche geometriche macroscala. Per applicazioni di ricerca, come presentato qui, i dischi alginato non forniscono indipendentemente porzioni di adesione per le cellule, che potrebbero limitare la sua applicazione ad altri tipi di cellule. L'alternativa paragonabile a alginato quando si considera la facilità d'uso è agarosio, che soffre di limitazioni simili. Inoltre, si richiede l'uso di enzimi per rilasciare cellule per l'analisi a valle, mentre reticolazioni alginato possono essere rimossi in modo sicuro mediante agenti chelanti del calcio. In primo luogo, questa piattaforma cultura contribuirà con il miglioramento della understanding dei rapporti tra popolazioni di cellule in idrogel e potenzialmente gli effetti della stimolazione meccanica di questi co-culture. Questa comprensione si informa lo sviluppo di terapie per tessuti eterogenei, in particolare il caricamento di tessuti portanti quali la cartilagine articolare o dischi intervertebrali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
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