Presentiamo le linee guida per lo sviluppo di 'trasduttori chimici' sintetici in grado di indurre la comunicazione tra proteine naturalmente non correlate. Inoltre, vengono presentati protocolli dettagliati per la sintesi e il test di uno specifico "trasduttore" che consente a un fattore di crescita di attivare un enzima detossificante e, di conseguenza, di regolare la scissione di un farmaco antitumorale.
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Articolo metodologico
Imitando la funzione di proteine di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le vie di trasduzione del segnale, che controllano la risposta delle cellule a vari segnali ambientali, sono mediate dalla funzione delle proteine di segnalazione che interagiscono tra loro e si attivano a vicenda con elevata specificità. Gli agenti sintetici che imitano la funzione di queste proteine potrebbero quindi essere utilizzati per generare passaggi di trasduzione del segnale innaturali e, di conseguenza, alterare la funzione della cellula. Presentiamo le linee guida per la progettazione di "trasduttori chimici" in grado di indurre una comunicazione artificiale tra proteine native. Inoltre, presentiamo protocolli dettagliati per la sintesi e il test di uno specifico "trasduttore", in grado di indurre la comunicazione tra due proteine non correlate: il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e la glutatione-S-transferasi (GST). Viene anche presentato il modo in cui questa comunicazione innaturale PDGF-GST potrebbe essere utilizzata per controllare la scissione di un profarmaco antitumorale, indicando il potenziale per l'utilizzo di tali sistemi nella "terapia di trasduzione del segnale artificiale". Questo lavoro ha lo scopo di facilitare lo sviluppo di ulteriori "trasduttori" di questa classe, che possono essere utilizzati per mediare la comunicazione intracellulare proteina-proteina e, di conseguenza, per indurre vie di segnalazione cellulare artificiali.
Introduzione
Vie di trasduzione del segnale giocano un ruolo significativo praticamente in ogni processo cellulare e permettono alla cellula di rispondere rapidamente a segnali ambientali. 1 Questi percorsi sono spesso innescati dal legame di una molecola di segnalazione ad un recettore extracellulare, che si traduce in attivazione di enzimi intracellulari. Amplificazione e propagazione di questo segnale all'interno della cellula è mediata dalla funzione di segnalazione proteine che formano una rete di interazioni proteina-proteina in cui gli enzimi sono reversibilmente attivati con elevata specificità. A causa disregolazione di queste reti porta spesso allo sv....
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Protocollo
1. Sintesi della 'chimica trasduttore'
- I preparativi preliminari
- Preparare 2 M trietilammonio acetato (TEAA) tampone mescolando 278 ml di trietilammina con 114 ml di acido acetico e 400 ml di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7 e aggiungere acqua ad un volume finale di 1 L. Conservare in una bottiglia scura.
Nota: Questa soluzione è stabile per anni. - Preparare una soluzione di acido ascorbico 5 mM sciogliendo 18 mg di acido ascorbico in 20 ml di acqua ultrapura. Utilizzare una soluzione fresca; la soluzione è stabile per un giorno.
- Preparare una (II) soluzione 10 mM Cu / Tris (benzyltriazolylmethyl) ammina (TBTA)....
- Preparare 2 M trietilammonio acetato (TEAA) tampone mescolando 278 ml di trietilammina con 114 ml di acido acetico e 400 ml di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7 e aggiungere acqua ad un volume finale di 1 L. Conservare in una bottiglia scura.
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Risultati
La progettazione, la sintesi, e il meccanismo di azione di un 'trasduttore chimica' che può indurre comunicazione artificiale tra PDGF e GST sono rappresentati in Figura 2. La struttura del 'trasduttore' integra un aptamero PDGF DNA ed un ammide bis-ethacrynic (BEA ), che è, rispettivamente, un inibitore noto GST (Figura 2a). 19 Questi leganti consentono 'trasduttore' di impegnare sia PDGF e GST con differenti affinità,.......
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Discussione
Abbiamo presentato un metodo per la progettazione e il test di un "trasduttore chimico" in grado di indurre una comunicazione artificiale tra due proteine naturalmente non correlate, GST e PDGF, senza modificare le proteine native. Le comunicazioni innaturali GST-PDGF potrebbero essere rilevate in tempo reale utilizzando saggi enzimatici che seguono i cambiamenti nell'attività del GST in presenza del "trasduttore chimico" e aumentando le concentrazioni di PDGF. Oltre a rilevare l'attivazione della GST da parte del PDGF, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Minerva, l'Organizzazione HFSP, e un Consiglio di Grant europeo della ricerca (Starting Grant 338.265).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-cloro-2,4-dinitrobenzene | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| Acido acetico | Bio Lab | 01070521 | |
| Acetnitrile | J.T.Baker | 9017-03 | |
| Acido ascorbico | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Solfato di rame (II) pentaidrato | Merck-Millipore | 102790 | |
| Dimetil solfossido | Merck-Millipore | 802912 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-5A | |
| Acido etacrinico | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
| Glutatione-s-transferasi M1-1 | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israele) | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| L-glutatione ridotto | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| cloruro di magnesio | J.T.Baker | 0162 | |
| kit di analisi colorimetrica di nitrati/nitriti | Cayman Chemical | 780001 | |
| oligonucleotidi | W. M. Keck Foundation Biotechnology presso l'Università | ordine personalizzato | |
| PDGF-BB | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israele) | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Colonna di desalinizzazione | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Colonne | |
| di separazione 2695 | |||
| Colonna HPLC | Colonna Waters | XBridgeTM OST C18 (2,5 μ M, 4,6 mm & tempi; 50 mm) | |
| Colonna HPLC | Colonna Waters | XBridgeTM OST C18 (2,5 μ M, 10 mm & tempi; 50 mm) | |
| Lettore di piastre | BioTek | synergy H4 ibrido |
Riferimenti
- Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
- Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
- Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D.
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Ristampe e permessi
