Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
Inoltre genoma nucleare, ogni cellula eucariotica contiene anche migliaia di copie di DNA circolare piccolo nella matrice mitocondriale. Mentre il DNA mitocondriale (mtDNA) codifica subunità essenziali della catena di trasporto degli elettroni, la maggioranza del proteoma mitocondriale, compresi tutti i fattori per la replicazione e trascrizione del mtDNA sono codificati dal genoma nucleare. In contrasto con il genoma nucleare che segue le leggi di Mendel dell'ereditarietà, il genoma mitocondriale animale viene ereditato esclusivamente attraverso la linea materna. Pertanto, la comprensione di come mtDNA è proliferato e trasmessa da una generazione a quella successiva attraverso l'ovocita femminile è di fondamentale importanza. Tuttavia, vi è continuo dibattito su come replicazione del mtDNA è regolata nella linea germinale femminile. Inoltre, la teoria collo di bottiglia mtDNA ampiamente accettata per la trasmissione del mtDNA suggerisce che la popolazione di mtDNA in cellule germinali primordiali è un sotto-campione di un numero relativamente piccolo during di sviluppo 1 2. Ciò implica anche che la replicazione del DNA mitocondriale è temporalmente e spazialmente regolamentato durante oogenesis. Quindi, il rilevamento in situ di replicazione del mtDNA durante lo sviluppo germline faciliterà la comprensione del meccanismo di mtDNA ereditarietà.
Drosophila oogenesi fornisce un sistema geneticamente trattabili per studiare la replicazione del DNA mitocondriale e la trasmissione. In ciascuna delle due ovaie Drosophila, ci sono 16-20 stringhe indipendenti di camere uovo chiamati ovarioli 3, che sono le unità funzionali di produzione di uova (vedere Figura 1A). Ogni ovariole contiene un'organizzazione lineare progressiva dell'oogenesi, dove la punta anteriore è composto da una struttura chiamata germarium. Il germarium è ulteriormente suddiviso in quattro regioni che contengono le cellule germinali in fasi di sviluppo differenti. Nella regione 1, le cellule staminali germinali passare attraverso la divisione asimmetrica per produrre cellule figlie noto come cystoblasts. Regione 2a contiene i cystoblasts che hanno completato la loro divisione finale. Cystoblasts sottoposti a quattro cicli di divisione che produce gruppi di 16 cellule. I 16 cellule rimangono collegati tra loro da ponti citoplasmatici chiamati canali anello. Solo una delle celle impegna a differenziazione ovocita, mentre l'altro 15 sviluppano come cellule infermiere poliploidi. Una struttura essenziale citoplasmatica, noto come fusome, si propone di agevolare la formazione di canali anello, determinare la polarità cisti e l'infermiera interazioni cellula-ovociti 4,5. Poiché le cisti muovono verso regione 2b, le strutture cisti coprono l'intera larghezza della germarium, e diventano più associati con cellule follicolari. Le strutture germarium terminano con la regione 3 contenente la prima camera uovo in erba. Successivamente, le camere d'uovo vengono assemblate alla fine posteriore della germarium, che il progresso attraverso il ovariole in 14 tappe morfologicamente distinte. La crescita di ovociti dipende dalle cellule infermiere, which proteine di trasporto, mRNA e strutture endomembrane (ad esempio, Golgi) tramite i canali ad anello nel citoplasma dell'ovocita. Durante Drosophila oogenesi, si è constatato che una frazione dei mitocondri all'interno di ogni cisti di 16 cellule sono stati associati con il fusome, mosso attraverso i canali ad anello e sono stati consegnati nel singolo ovocita in una grande massa chiamato Balbiani corpo 6. Questo fenomeno è stato proposto di contribuire al controllo della qualità di eredità mitocondriale attraverso ovaie femminili.
Rilevazione della sintesi del DNA mitocondriale si basa sulla costituzione dei precursori del DNA marcati nel DNA cellulare. Tradizionalmente, un analogo nucleosidico della timidina 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per etichettare la replicazione del mtDNA in cellule di coltura dei tessuti 7,8. Tuttavia, l'etichettatura BrdU a base di anticorpi presenta diverse limitazioni, soprattutto per tutto il montaggio colorazione dei tessuti. Uno dei principali svantaggi di etichettatura BrdU è che richiede denaturazione del DNA per esporrel'epitopo BrdU, in modo che possa essere rilevato dal anticorpo anti-BrdU. Il campione deve essere trattato in condizioni denaturanti duri quali sostanze chimiche (ad esempio, acido cloridrico o miscele di metanolo e acido acetico), calore o digestione con DNasi che potrebbero interrompere la struttura del campione e complicare la seguente procedura di colorazione 9, 10.
Qui, in alternativa timidina analogico 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) viene utilizzato per etichettare il DNA mitocondriale replicare in Drosophila ovaie adulte. Questo metodo è più veloce e altamente sensibile. EdU è facilmente incorporato nel DNA cellulare durante la replicazione del DNA. La seguente rilevamento si basa su una reazione "click", un Cu (I) -catalyzed reazione covalente tra il gruppo alchino terminale e una azide fluorescente 10. Poiché la reazione non richiede la denaturazione del campione, permette una buona conservazione strutturale. Inoltre, la dimensione di colorante unZide è soltanto 1/500 di quella di una molecola anticorpale 10, che consente la penetrazione veloce ed efficiente dei tessuti tutto il montaggio. Abbiamo usato questo metodo per rilevare la replicazione del mtDNA durante Drosophila oogenesis e ha trovato un modello spaziale sorprendente nella regione germarium di Drosophila dell'ovaio 11, che ci portano a proporre un meccanismo di ereditarietà del mtDNA selettivo replica-dipendente. Presentiamo qui un protocollo dettagliato sull'etichettatura EdU di replicazione del mtDNA in ovaie di Drosophila. Per dimostrare l'applicazione del protocollo, abbiamo provato anche la replicazione del mtDNA in un mtDNA mutante Drosophila (mt: COI T300I) 11, nonché con il trattamento diversificato di uncouplers mitocondriali, che dissipano il potenziale di membrana mitocondriale e potenzialmente interrompono replicazione del mtDNA.
etichettatura EdU è un nuovo metodo ed efficiente per rilevare la sintesi del DNA in cellule proliferanti, che si basa sulla costituzione e la colorazione di analoghi nucleosidici nel DNA di nuova sintesi. Questo metodo è superiore al metodo di etichettatura BrdU in quanto è più veloce e altamente sensibile. Ancora più importante, permette di buona conservazione strutturale e penetrazione edu-dye efficiente di tutto il montaggio tessuti 9, 10. Storicamente, come un'alternativa superiore per l'etichettatura BrdU, etichettatura EdU è stato utilizzato per studiare la replicazione del DNA nucleare durante la fase S del ciclo cellulare. Afidicolina è un inibitore della DNA polimerasi α, che è la polimerasi principale per la replicazione del DNA nucleare in fase S 12 15. replicazione del mtDNA viene effettuata da DNA polimerasi γ, che è insensibile ai afidicolina trattamento. Quindi, il trattamento con afidicolina prima e durante l'incubazione EdU significativamente inibito EdU incorporazione nel DNA nucleare. Dovrebbenotato che afidicolina può essere stabile per diverse settimane se opportunamente conservato, e l'efficacia di afidicolina nell'inibire la replicazione del DNA nucleare era variabile nelle nostre mani. I ovarioli o camere d'uovo con una forte etichettatura DNA nucleare dovrebbero essere esclusi dalla analisi di ulteriori dati.
replicazione del mtDNA può essere facilmente visualizzato come puncta nel citoplasma, che offre anche un modo semplice per quantificare il livello di replicazione del mtDNA contando il numero di EdU puncta, normalizzata al volume totale di citoplasma. software di imaging può essere applicato a identificare automaticamente EdU puncta nelle immagini microscopiche, il che è particolarmente utile per le analisi computazionali di grandi insiemi di dati. Tuttavia, dovrebbero essere prese precauzioni, in quanto l'inibizione incompleta della replicazione del DNA nucleare può portare alla costituzione EdU in loci distinti sul cromosoma e visualizzare come puncta all'interno del nucleo. Anche in altri casi, l'intensità della EdU incorporazione in replicolata mtDNA potrebbe essere debole, mentre lo sfondo e il rumore potrebbe essere elevato. Pertanto, i singoli parametri per analisi automatica delle immagini devono essere attentamente definiti. Si raccomanda inoltre che le immagini devono essere esaminati con gli occhi addestrati per fare in modo che una corretta puncta EdU sono identificati.
Visualizzazione di nuova sintesi mtDNA durante Drosophila oogenesis offre l'opportunità di indagare come la replicazione del DNA mitocondriale è regolata in condizioni fisiologiche o patologiche, svolgendo l'esperimento in mosche sottoposti a una serie di perturbazioni farmacologici o genetici. In uno studio precedente, saggio di incorporazione EdU è stato eseguito in un mtDNA mutante Drosophila mt: COI T300I 11. Inoltre, per interrompere il potenziale di membrana mitocondriale, ovaie sono state trattate con varie concentrazioni di mitocondriale FCCP disaccoppiatore o 2,4-dinitrofenolo (DNP) prima EdU incorporazione. A seconda dei fini sperimentalie le caratteristiche di droga, metodi diversi potrebbero essere adottate per la consegna efficace. Per mosche adulte, farmaci possono essere presentati in forma di vapore (per esempio, etanolo e cocaina) 16,17 o farmaci possono essere iniettati nell'addome, dove diffonde rapidamente in tutto il corpo 18. La pratica più comune è che i farmaci siano aggiunti all'alimento mosca o una carta da filtro di saccarosio / farmaco-saturo. Ad esempio, l'inibitore di assemblaggio dei microtubuli, colchicina, è stato alimentato a mosche per 2-3 giorni prima della dissezione ovaio 19. Quindi, è importante valutare il metodo drug delivery e selezionate concentrazioni appropriate.
Per garantire il successo di imaging di replicazione del mtDNA in ovaie di Drosophila, diversi passaggi critici devono essere eseguiti con cura. Primo, preservando la vitalità e la salute delle ovaie durante la dissezione e EdU incorporazione è essenziali (punti 1 e 2). Medio Drosophila della Schneider con FBS ha bisogno di essere riscaldato a RTprima dell'uso. Uno dovrebbe ridurre al minimo il contatto diretto tra le camere d'uovo e strumenti di dissezione o puntali delle pipette. Le ovaie dovrebbero essere immerso sotto soluzioni tutti i tempi per evitare la disidratazione. Cattiva gestione i tessuti possono facilmente portare a svenire o segnali fluorescenti. Durante la fase di montaggio dei tessuti, ovarioli dovrebbero essere separati l'uno dall'altro e sparsi sul vetrino da microscopio. Assicurarsi che le camere di uova non sono impilati uno sopra l'altro. Abbiamo notato che le camere a base di uova al di là di fase 14 visualizzati po 'incorporazione edu. Inoltre, a causa delle grandi dimensioni, le camere di uovo fase avanzata spesso causano vicine camere uovo più giovani di essere fuori fuoco. Pertanto si raccomanda che le camere fase tardiva uovo essere scartati.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'etichettatura replicare mtDNA in Drosophila ovaie adulte. Questo metodo consente la semplice quantificazione di replicazione del mtDNA sotto varie perturbazioni genetiche e farmacologiche,e sarà utile per la dissezione meccanismi alla base dello sviluppo biogenesi mitocondriale e mtDNA eredità.
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |