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Articolo metodologico

Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat

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DOI:

10.3791/54550

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19 ottobre 2016

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

Questo studio dimostra la preparazione chirurgica del muscolo cremastere di ratto per la visualizzazione dello strato libero da cellule in vivo. In questo studio vengono discussi fattori considerevoli che influenzano l'accuratezza della misurazione della larghezza dello strato libero da celle.

Abstract

Lo strato privo di cellule è definito come lo strato di plasma parietale nel flusso dei microvasi, che è privo di globuli rossi. La misurazione della larghezza dello strato libero da cellule in vivo e delle sue variazioni spazio-temporali può fornire una comprensione completa dell'emodinamica nella microcircolazione. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema microscopico intravitale accoppiato con una videocamera ad alta velocità per quantificare le larghezze degli strati liberi da cellule nelle arteriole in vivo. Il muscolo cremastere dei ratti Sprague-Dawley è stato esteriorizzato chirurgicamente per visualizzare il flusso sanguigno. È stato inoltre sviluppato uno script di imaging personalizzato per automatizzare l'elaborazione delle immagini e l'analisi della larghezza dello strato privo di cellule. Questo approccio consente di quantificare le variazioni spazio-temporali in modo più coerente rispetto alle precedenti misurazioni manuali. L'accuratezza della misurazione, tuttavia, dipende in parte dall'uso di un filtro blu e dalla selezione di un algoritmo di soglia appropriato. Nello specifico, abbiamo valutato il contrasto e la qualità delle immagini acquisite con e senza l'utilizzo di un filtro blu. Inoltre, abbiamo confrontato cinque diversi algoritmi di soglia basati su istogrammi di immagini (Otsu, minimo, intermodale, selezione iterativa e soglia entropica fuzzy) e illustrato le differenze nella loro determinazione della larghezza dello strato privo di cellule.

Introduzione

Gli studi in vivo sugli animali sono fondamentali per la scienza di base per comprendere la fisiologia e la patologia umana. In particolare, studi di microemodinamica in vivo possono chiarire la potenziale compromissione delle funzioni microcircolatorie alterata da condizioni reologiche anomale del sangue. Un certo numero di precedenti studi microemodinamici1 hanno utilizzato il modello di muscolo cremaster di ratto per visualizzare il flusso sanguigno microvascolare. Il muscolo cremastere è un sottile strato di muscolo striato che circonda i testicoli. Pertanto, il flusso sanguigno nel muscolo può essere visualizzato con un microscopio a transilluminazione mediante esposizione chirurgica. Questo ci consente di acquisire le immagini del flusso sanguigno in vivo senza l'uso di agenti di fluorescenza o di contrasto. Inoltre, l'intera perfusione sanguigna della rete muscolare può essere controllata riducendo il flusso sanguigno a monte con l'occlusione dell'aorta addominale2. Grazie a questi vantaggi, il modello di muscolo cremastere è stato ampiamente utilizzato per studiare la formazione di strato libero da cellule (CFL) nei microvasi1,3.

L'ampiezza delle CFL è un importante parametro emodinamico nella microcircolazione, che è stato di grande interesse per il suo importante ruolo nella regolazione delle funzioni del microcircolo. La CFL è formata dalla migrazione trasversale verso l'interno indotta dal taglio dei globuli rossi (RBC) verso il centro di flusso4. Di conseguenza, questa migrazione porta all'esaurimento dei globuli rossi vicino alle pareti dei vasi, risultando infine in uno strato di plasma privo di cellule. Di conseguenza, la CFL parietale diventa naturalmente una barriera di diffusione al rilascio di ossigeno (O2) dal nucleo dei globuli rossi ai tessuti e allo scavenging dell'ossido nitrico (NO) da parte dei globuli rossi5,6. Inoltre, la produzione di NO può essere modulata anche dalle variazioni dinamiche della CFL di larghezza7,8. Pertanto, il ruolo delle CFL sia nel trasporto dei gas che nella regolazione dell'omeostasi nella microcircolazione deve essere completamente accertato per comprendere meglio il flusso sanguigno nella microcircolazione. Studi recenti si sono concentrati sul collegamento tra le funzioni emodinamiche e di trasporto dei gas delle CFL nella microcircolazione9-12. Inoltre, una serie separata di studi ha anche indagato come l'aumento patologico dell'aggregazione dei globuli rossi modula la formazione di CFL e il suo effetto sulla biodisponibilità di O2 e NO nei tessuti13,14.

I ruoli delle CFL diventano più significativi nella microcircolazione, dove la dimensione relativa della larghezza delle CFL al diametro del vaso è prominente. Ciò richiede un approccio efficace per quantificare il flusso sanguigno CFL in vivo. In particolare, l'acquisizione e l'analisi delle immagini sono i due componenti chiave che determinano l'accuratezza della misurazione della larghezza delle CFL. La corretta visualizzazione del flusso sanguigno tissutale deve essere preceduta da un'appropriata preparazione chirurgica del modello animale. Inoltre, è necessaria un'adeguata tecnica di analisi delle immagini per superare i limiti delle misurazioni manuali convenzionali che sono per lo più indotte da errori umani15,16. Con i progressi nella strumentazione ottica e nella potenza di calcolo per l'elaborazione delle immagini digitali, è ora possibile ottenere una misurazione più accurata e coerente della larghezza CFL17-19. Tuttavia, l'accuratezza di queste misurazioni, essendo basate su immagini, dipende ancora in ultima analisi dalla qualità delle immagini.

Pertanto, questo studio esplora i fattori che influenzano la misurazione della larghezza della CFL in vivo. Ci siamo concentrati in particolare sulla dimostrazione della preparazione chirurgica e dell'analisi digitale delle immagini per la misurazione della larghezza delle CFL nelle arteriole del muscolo cremaster di ratto.

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Protocollo

Questo studio è in accordo con l'Università Nazionale di Singapore Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (protocollo approvato senza. R15-0225).

1. Preparazione chirurgica del modello animale

  1. cannulazioni nave
    1. Anestetizzare a ratti maschi Sprague-Dawley (6 - 7 settimane) di pesatura (203 ± 20) g con ketamina (37,5 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) cocktail attraverso intraperitoneale (ip) iniezione (2 ml / kg) . Non ricoprire l'ago o rimuoverlo dalla siringa dopo l'iniezione.
    2. Una volta che l'animale è stato anestetizzato (confermata dalla punta pizzicare), posizionarlo su una piastra elettrica per mantenere la sua temperatura corporea a 37 ° C. radere delicatamente i capelli sulla scapole, collo dell'utero anteriore, basso addome, zampa posteriore mediale e sacco scrotale. frenare delicatamente le gambe utilizzando nastri di carta adesiva.
    3. Eseguire tutte le procedure chirurgiche con le forbici di microdissezione e pinze ad angolo, mentre la visualizzazione attraversouno stereomicroscopio. Mettere tutti gli strumenti chirurgici taglienti su un vassoio resistente alla perforazione per evitare lesioni durante l'intervento chirurgico.
    4. Scrub tutti i siti chirurgici 3 volte con alternanza di iodio e il 70% di alcool prima di eseguire l'incisione. Lavare tutti i cateteri con 30 / soluzione di eparina-salina ml UI.
    5. Fare A 1 - 1,5 centimetri incisione cutanea mediana sulla scapole usando un paio di forbici chirurgiche sopra la vena giugulare destra. Separare la fascia per via smussa per esporre la vena giugulare e cannulate con un tubo di polietilene (PE-50) riempita con eparina-salino con 5-0 punti di sutura in seta. Infondere anestesia supplementare quando necessario (1/3 a 1/2 della dose iniziale, per via endovenosa (iv)) durante tutto il corso della chirurgia e dell'esperimento.
    6. Eseguire tracheostomia per mantenere la pervietà delle vie aeree. Fare un 1 - cm un'incisione 1.5 nella zona cervicale anteriore. Incannulare la trachea utilizzando un tubo di polietilene (PE-205) con 2-0 suture di seta per fissare il catetere in posizione.
    7. Monitorare la pressione sanguignaattraverso incannulamento a livello dell'arteria femorale. Fare un 1 - cm un'incisione 1.5 sulla superficie mediale sinistro della zampa posteriore. Separare l'arteria femorale per via smussa. Incannulare l'arteria femorale con un tubo di polietilene (PE-10) riempito di eparina-salina utilizzando 5-0 suture di seta.
  2. Cremaster muscolare Preparazione e flusso di visualizzazione
    1. Inserire una sutura 5-0 seta attraverso l'apice del sacco scrotale per estenderlo. Fare un'incisione lungo la superficie ventrale del sacco scrotale. Regolarmente applicare soluzione calda isotonica (37 ° C, pH 7,4) al muscolo esposto.
    2. Rimuovere circostante tessuti connettivi attentamente e accuratamente con un applicatore con punta di cotone.
    3. Inserire una sutura 5-0 seta attraverso l'apice del muscolo cremastere. Tagliare la sutura in due parti di uguale lunghezza e un nodo su ogni lato. Tagliare il muscolo tra i due nodi e si estendono su una piattaforma di plexiglas trasparente personalizzato tirando delicatamente la sutura. fissarel'estremità della sutura sulla piattaforma con l'aderenza blu.
      NOTA: la rimozione completa dei circostante tessuto connettivo è di fondamentale importanza per ottenere ottimale contrasto dell'immagine.
    4. Ripetere 1.2.3 passo fino al 5 a 6 fissazioni sono fatti. Rimuovere con attenzione il muscolo cremastere dall'epididimo utilizzando alte temperature cauterizzazione. Superfuse soluzione isotonica calda al muscolo esposto per prevenire la disidratazione del tessuto.
      1. Circondano il muscolo cremastere con pezzi piegati di garza. Coprire il muscolo esposta con un film di polivinile. I pezzi di garza con il film formano un bacino poco profondo per tenere soluzione isotonica calda per l'obiettivo dell'acqua immersione microscopio (Figura 1A).
    5. Trasferire l'animale sul palco animale di un microscopio intravitale (Figura 1C). Collegare l'incannulamento arterioso ad un sistema di acquisizione dati fisiologici per il monitoraggio continuo della pressione (Figura 1E).
    6. Mantenere la temperat muscolareure a 35 ° C con un elemento riscaldante allegata sotto la piattaforma animale (Figura 1B). Inserire una sonda di temperatura vicino al muscolo per fornire un feedback negativo al controllore potenza dell'elemento riscaldante (Figura 1D).
    7. Lasciare l'animale sulla scena per 15 minuti per equilibrare con l'ambiente.
    8. Visualizza il flusso di sangue al microscopio intravitale con un obiettivo di acqua-immersion 40X e un condensatore nel tempo.
    9. Scegliere un arteriole ramificati (<60 micron) basata su una chiara focalizzazione e il contrasto tra il nucleo RBC, CFL e dalle pareti del recipiente, al fine di concentrarsi microscopio sul piano diametrale del vaso sanguigno. Ruotare la fotocamera montata sul microscopio per allineare la parete del serbatoio verticale.
    10. Registrare il flusso di sangue utilizzando una videocamera ad alta velocità ad un frame rate di 3.000 / sec per 1 sec. Salvare il video registrato in formato AVI non compresso in scala di grigi a 8 bit per preservare la qualità delle immagini.
      NOTA: Si raccomanda un frame rate minimo di registrazione di 3.000 fotogrammi / sec per garantire che la misura CFL può essere eseguita almeno una volta al RBC in condizioni di flusso arteriolare fisiologiche.
    11. Utilizzare un filtro blu con trasmissione di picco alla lunghezza d'onda di 394 nm e banda passante spettrale 310 - 510 nm per aumentare il contrasto tra i globuli rossi e plasma.
      NOTA: Assicurarsi che lo spettro di luce che passa attraverso il filtro blu dalla sorgente luminosa microscopica (lampada alogena 100 W) è di bassa intensità della luce per evitare qualsiasi potenziale danno tissutale.
    12. Alla fine dell'esperimento, eutanasia l'animale con una overdose di pentobarbital sodico.

Analisi 2. Immagine

  1. Pre-elaborazione per la misura della larghezza CFL
    1. Aprire MATLAB ed eseguire il file 'CFL_pre.m'. (Questo ed altri file MATLAB può essere trovato nelip "> Supplemental MATLAB Archive.)
    2. Fare clic su 'Apri file' per selezionare il file video da analizzare.
    3. Regolare il dispositivo di scorrimento 'rotazione' di allineare le pareti dei vasi in verticale.
      NOTA: Gli utenti possono visualizzare le linee della griglia assistenza per l'allineamento nave selezionando il pulsante di opzione 'griglia su', e regolare il livello di zoom dell'immagine facendo scorrere il cursore 'Zoom'.
    4. Fare clic sul pulsante 'Conferma Modifica' per confermare l'allineamento nave.
    5. Fare clic sul pulsante 'Imposta ROI per ritagliare' per definire la regione di interesse (ROI). L'immagine allineata verrà visualizzato in una finestra pop-up. Regolare l'obiettivo rettangolare sull'immagine, e fare doppio clic per confermare il ROI. Ignorare questo passaggio se non è richiesto il ritaglio dell'immagine.
      NOTA: includere solo una singola nave in ROI per analizzare la larghezza CFL dalla nave. Fare clic sul pulsante 'Reset immagine' per ripristinare l'immagine alla sua forma originale, se necessario.
    6. Clicca il9; Estrarre 'pulsante per estrarre tutti i fotogrammi video modificati in immagini po' mappa consecutivi (8-bit in scala di grigi 'immagini in formato bmp'). Le immagini estratte possono essere trovate nella cartella con lo stesso nome del file video selezionato.
  2. La misura della larghezza CFL
    1. Aprire MATLAB ed eseguire il file 'CFL_measure.m'.
    2. Fare clic su 'Seleziona cartella' per selezionare la cartella contenente le immagini estratte.
    3. Fare clic sulla cartella contenente le immagini e cliccare su 'Seleziona cartella'. Il primo fotogramma immagine nella cartella verrà caricato e mostrato nel pannello 'Scala di grigi immagine', insieme con il suo colore grigio istogramma intensità nel pannello 'immagine Istogramma'.
    4. Selezionare la cornice immagine desiderata dalla casella di riepilogo per effettuare l'analisi, in caso contrario verrà selezionato il primo fotogramma dell'immagine.
    5. Fare clic su 'Trova nave Walls' per identificare la parete del vaso interno nell'immagine, che è determinata nel punto in cui illuce profilo di intensità transiti di punta dal buio alla luce più di due pixel.
    6. Controllare 'filtro mediano' applicare un filtro mediano l'immagine per ridurre il rumore 'sale e pepe'.
    7. Controllare 'Contrasto automatico' per regolare l'intensità dell'immagine digitale per migliorare il contrasto dell'immagine.
    8. Selezionare un algoritmo di soglia nella casella di riepilogo che determina automaticamente un valore soglia (τ) che divide i livelli di grigio in due classi - pixel bianchi con livelli di grigio sopra τ (CFL), e pixel neri con livelli di grigio inferiori τ (core RBC).
      NOTA: Come metodo alternativo, utilizzare soglia manuale se nessuno di algoritmi automatizzati-soglia fornisce un adeguato soglia immagine. Fare clic sul pulsante 'Manuale' radio e regolare il cursore per definire il valore soglia manuale.
    9. Per misurare la variazione spaziale delle larghezze CFL, inserire la risoluzione in pixel nella casella 'Pixel Resolution' (la risoluzionecon questa configurazione sperimentale era 0,42 micron / pixel).
    10. Fare clic sul pulsante 'Calcola' per ottenere la variazione spaziale delle larghezze CFL. Fare clic su 'Esporta .csv' per esportare i dati di larghezza CFL in forma di tabelle.
    11. Per misurare la variazione temporale delle larghezze CFL ad una specifica linea di analisi lungo il vaso, cliccare sul pulsante di opzione 'temporale Variation' e inserire le informazioni frame rate (il tasso di frame utilizzato in questa configurazione sperimentale era 3.000 fotogrammi / sec).
    12. Inserisci il primo fotogramma e l'ultimo fotogramma delle immagini per l'analisi dei 'Frame Start' e scatole 'ultimo fotogramma', rispettivamente.
    13. Selezionare la posizione della linea di analisi lungo il vaso facendo scorrere il 'Analisi Line' barra di scorrimento. Conferma la posizione della linea di analisi, che è illustrato sia sul 'immagine in scala di grigi' e 'immagine binaria'.
    14. Fare clic su 'Calcola' per ottenere la variazione temporale delle larghezze CFL. Click 'Export .csv' per esportare i dati di larghezza CFL in forma di tabelle.

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Risultati

La visualizzazione del CFL in vivo dipende in larga misura le preparazioni chirurgiche dell'animale. eccessiva perdita di sangue o la durata intervento chirurgico esteso possono sottoporre l'animale a urti e le aberrazioni del flusso sanguigno. Mantenimento della temperatura del tessuto utilizzando una piastra elettrica, nonché una piattaforma personalizzata durante l'intervento chirurgico e esperimento è cruciale per mantenere le condizioni fisiologiche del ratto. Utilizzando una lampada alogena da...

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Discussione

La misura della larghezza CFL è essenziale per una migliore comprensione delle emodinamica del microcircolo. In particolare, la misurazione delle larghezze CFL è stata eseguita in mesenterica 6, spinotrapezius 24 e cerebrali 25 microcircolazione. La misura convenzionale in vivo larghezze CFL è stato limitato a stime mediante ispezione manuale dei fotogrammi video registrati. Le misurazioni manuali necessari la media di diversi fotogrammi video successivi prima di identificare vi...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio IntravitalOlympusBX51WIAttrezzatura
Fotocamera ad alta velocitàPhotron1024PCIAttrezzatura
Filtro bluHOYAB390Apparecchiatura
Sensore di pressione e sistema biopacBiopacTSD104A, MP100Attrezzatura
Regolatore di temperaturaShimadenSR 1Attrezzatura
Plasma Lyte ABaxterNDC:0338-0221Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Soluzione salina 0,9%Braun
Eparina (5.000 UI/ml)LEO
PE-10 tubo in polietileneBecton Dickinson427400.024" OD x .011" ID 
Tubo in polietilene PE-50Becton Dickinson427411.038" OD x .023" ID
Tubo in polietilene PE-205Becton Dickinson427446.082" OD x .062" ID
2-0 sutura di seta non assorbibileDeknatel113-S
5-0 sutura di seta non assorbibileDeknatel106-S
Termoforo a circolazione d'acquaGaymar
Bagno d'acquaFisher ScientificIsotemp 205Attrezzatura
Garza di cotone sterile Fisher Scientific22-415-468
Applicatori con punta in cotoneFisher Scientific23-400-124
Dumont ForcipeKent ScientificINS14188Strumento chirurgico
Pinza per microdissezioneKent ScientificINS15915Strumento chirurgico
Pinze per iride 1 x 2 dentiKentScientific INS15917Surgical strumento
Pinze per incannulamento dei vasiKent ScientificINS500377Strumento chirurgico
Micro forbiceKent ScientificINS14177Strumento chirurgico
Forbice dell'irideKent ScientificINS14225Strumento chirurgico
Clip per vasiKent ScientificINS14120Strumento chirurgico
Sistema di cauterizzazione GeminiBraintree ScientificGEM 5917Strumento chirurgico
Sistema

Riferimenti

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