Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat
19 ottobre 2016
Questo studio dimostra la preparazione chirurgica del muscolo cremastere di ratto per la visualizzazione dello strato libero da cellule in vivo. In questo studio vengono discussi fattori considerevoli che influenzano l'accuratezza della misurazione della larghezza dello strato libero da celle.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le variazioni spaziotemporali della larghezza dello strato acellulare in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'emodinamica microvascolare, migliorando la comprensione del ruolo della cell-filia nella microcircolazione. Il principale vantaggio di questo metodo è che la larghezza dello strato acellulare in vivo può essere quantificata in modo più consistente e agevole rispetto alle precedenti tecniche di misurazione manuale, che erano molto lunghe e dispendiose in termini di tempo.
Prima di iniziare la misurazione della larghezza dello strato privo di cellule, eseguire il file dello script pre-MatLab per lo strato privo di cellule. Successivamente, fare clic su apri file per selezionare il file video da analizzare e regolare il cursore di rotazione per allineare verticalmente le pareti del singolo vaso, utilizzando il cursore di zoom per regolare il livello di ingrandimento secondo necessità. Quando il vaso è nella posizione corretta, fare clic su conferma modifica, quindi fare clic su imposta ROI per ritagliare e definire la regione di interesse.
L'immagine allineata verrà visualizzata in una finestra pop-up. Regolare il rettangolo dell'obiettivo sull'immagine secondo necessità e fare doppio clic sull'obiettivo per confermare l'area di interesse. Quindi fare clic su Estrai immagini per estrarre tutti i fotogrammi del video modificati in immagini bitmap consecutive, che si troveranno nella cartella con lo stesso nome del file video selezionato.
Per misurare la larghezza dello strato acellulare, fare clic su Seleziona cartella e quindi sul cartella delle immagini. Il primo fotogramma dell'immagine apparirà nel pannello dell'immagine in scala di grigi insieme all'istogramma corrispondente delle intensità di grigio nel pannello dell'istogramma dell'immagine. Selezionare il fotogramma desiderato dall'elenco per eseguire l'analisi e fare clic su Trova pareti del vaso per identificare la parete interna del vaso nell'immagine, determinata come la posizione in cui il picco del profilo di intensità luminosa passa da scuro a chiaro su due pixel.
Selezionare il filtro mediano per applicare un filtro mediano all'immagine al fine di ridurre il rumore a sale e pepe. Selezionare il contrasto automatico per regolare digitalmente le intensità dell'immagine e migliorarne il contrasto. Quindi, scegliere un algoritmo di sogliatura nell'apposita casella di selezione per determinare automaticamente il valore di sogliatura che divide i livelli di grigio in due classi: pixel bianchi con livelli di grigio superiori al valore di sogliatura e pixel neri con livelli di grigio inferiori al valore di sogliatura.
Per misurare la variazione spaziale delle larghezze dello strato privo di cellule, inserire la risoluzione in pixel nel campo risoluzione dei pixel. Quindi fare clic su Calcola per ottenere la variazione spaziale delle larghezze dello strato privo di cellule e fare clic su Esporta .csv per esportare i dati della larghezza dello strato privo di cellule in un formato tabulato.
Per misurare la variazione temporale delle ampiezze dello strato acellulare in corrispondenza di una specifica linea di analisi lungo il vaso, fare clic su Variazione Temporale e inserire le informazioni relative alla frequenza dei fotogrammi. Immettere rispettivamente nei campi fotogramma iniziale e fotogramma finale i primi e gli ultimi fotogrammi delle immagini da analizzare. Regolare la barra di scorrimento della linea di analisi per selezionare la posizione della linea di analisi lungo il vaso e confermare la posizione della linea di analisi come illustrato sia sulle immagini in scala di grigi che su quelle binarie.
Quindi fare clic su Calcola per ottenere la variazione temporale delle ampiezze dello strato acellulare e fare clic su Esporta csv per esportare i dati relativi all'ampiezza dello strato acellulare in un formato tabulato. Qui viene mostrato un tipico flusso di globuli rossi attraverso un'arteria non ramificata nel muscolo cremaster del ratto, in cui lo strato acellulare può essere osservato tra il nucleo dei globuli rossi e la parete interna del vaso.
Un buon contrasto tra questi componenti è fondamentale per garantire l'accuratezza delle misurazioni della larghezza dello strato privo di cellule. La fase iniziale dell'analisi dell'immagine ha comportato il rilevamento della parete interna del vaso. Acquisendo il profilo dell'intensità luminosa lungo la linea di analisi perpendicolare al vaso, la posizione viene approssimata al picco che passa da scuro a chiaro su due pixel.
Successivamente, i confini del nucleo dei globuli rossi vengono rilevati mediante l'algoritmo di sogliatura dell'immagine e le larghezze dello strato privo di cellule possono quindi essere calcolate. Poiché i globuli rossi nello strato privo di cellule presentano diverse trasmissioni luminose, la differenza nei livelli di grigio può essere suddivisa in due classi. Tuttavia, l'identificazione di un valore di soglia accurato tra i due picchi dell'istogramma dell'immagine potrebbe essere limitata da una scarsa qualità e contrasto dell'immagine.
Per migliorare il contrasto tra i globuli rossi e lo strato privo di cellule, è possibile utilizzare un filtro blu. Questo effetto è ancora più evidente in queste immagini, in cui i confini dei nuclei dei globuli rossi sono stati identificati con maggiore precisione grazie al filtro blu. L'algoritmo di sogliatura può influenzare anche la misurazione della larghezza dello strato privo di cellule, come appare chiaro in queste immagini, in cui diversi algoritmi di sogliatura hanno portato all'individuazione di confini diversi per i nuclei dei globuli rossi e, di conseguenza, a differenti larghezze dello strato privo di cellule.
La misurazione della larghezza dello strato privo di cellule in vivo è molto sensibile alla qualità delle immagini. Pertanto, è fondamentale eseguire l'intervento chirurgico con attenzione e utilizzare un ausilio ottico adeguato per ottenere immagini di buona qualità. Inoltre, è essenziale selezionare l'algoritmo di sogliatura dell'immagine appropriato per garantire una misurazione accurata e coerente della larghezza dello strato privo di cellule.
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Panoramica
Questo studio illustra la preparazione chirurgica del muscolo cremasterio del ratto per la visualizzazione dello strato privo di cellule in vivo. Il metodo consente una quantificazione costante e agevole dell'ampiezza dello strato privo di cellule, affrontando questioni fondamentali nell'ambito dell'emodinamica microcircolatoria.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microemodinamica
- Cellulofilia nella microcircolazione
Sfondo
- Lo strato acellulare è fondamentale per comprendere la dinamica del flusso sanguigno.
- Le tecniche di misurazione precedenti erano lunghe e meno accurate.
- Le tecniche di visualizzazione in vivo migliorano l'affidabilità delle misurazioni.
Scopo dello studio
- Quantificare le variazioni spaziotemporali della larghezza dello strato acellulare in vivo.
- Migliorare la comprensione del ruolo della cellulo-filia nella microcircolazione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione chirurgica del muscolo cremasterico del ratto.
- Utilizzo di uno script pre-MatLab per l'analisi.
- Analisi video per la misurazione della larghezza dello strato privo di cellule.
- Ritaglio della regione di interesse (ROI) per misurazioni mirate.
Risultati principali
- La larghezza dello strato acellulare in vivo può essere misurata con maggiore precisione.
- Il metodo fornisce un'alternativa più efficiente rispetto alle tecniche manuali.
Conclusioni
- La tecnica di preparazione chirurgica è efficace per la visualizzazione.
- Questo metodo migliora la comprensione della microemodinamica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione quantitativa dello strato privo di cellule nei microvasi consente un'analisi precisa dell'emodinamica microcircolatoria, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici in biologia vascolare e nella scoperta di farmaci. La misurazione automatizzata e riproducibile della larghezza dello strato privo di cellule migliora l'affidabilità predittiva nella validazione precoce dei bersagli e fornisce informazioni per modelli traslazionali del flusso sanguigno. Questa capacità è strategicamente rilevante per i team biofarmaceutici che cercano endpoint robusti e quantitativi nei percorsi di ricerca microvascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una valutazione quantitativa della dinamica del flusso microvascolare per la validazione mirata degli obiettivi.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica chiarificando il ruolo dello strato privo di cellule nella microcircolazione.
- Fornisce misurazioni riproducibili e automatizzate per guidare la selezione precoce del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce flussi di lavoro validati per l'analisi delle immagini, finalizzati a una quantificazione coerente dei parametri dei vasi.
- Facilita la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso algoritmi automatizzati di sogliatura.
- Genera output quantitativi adatti per analisi successive e studi comparativi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli endpoint delle misurazioni microvascolari a modelli rilevanti per la malattia nella ricerca preclinica.
- Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo letture emodinamiche robuste.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, fondate su dati quantitativi sulla microcircolazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo misurazioni microvascolari quantitative standardizzate che forniscono informazioni sia per la scoperta precoce che per la ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella ricerca sulla microcircolazione.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili dei vasi per la preparazione dei saggi.
- Analisi dati: Produce dati spaziali e temporali sulla larghezza dello strato privo di cellule per confronti statistici solidi.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta scientifica e i modelli preclinici attraverso endpoint emodinamici costanti.
- Riutilizzo aziendale: Offre una pipeline di analisi delle immagini riutilizzabile e automatizzata per diversi studi vascolari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi microvascolari.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità delle misurazioni dei vasi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo endpoint quantitativi robusti.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione regolata sul rischio di bersagli e modelli vascolari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia intravitale e analisi delle immagini.
- È fortemente dipendente da sistemi di imaging di alta qualità e da infrastrutture computazionali per l'analisi automatizzata.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di imaging e gli algoritmi di sogliatura.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi di vasi o modelli animali.
- L'accuratezza delle misurazioni è sensibile alla qualità delle immagini, alla scelta dei filtri e al metodo di sogliatura.
