Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat
19 ottobre 2016
Questo studio dimostra la preparazione chirurgica del muscolo cremastere di ratto per la visualizzazione dello strato libero da cellule in vivo. In questo studio vengono discussi fattori considerevoli che influenzano l'accuratezza della misurazione della larghezza dello strato libero da celle.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le variazioni spazio-temporali nella larghezza dello strato libero da cellule in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microemodinamica, per comprendere meglio il ruolo della filia cellulare nella microcircolazione. Il vantaggio principale di questo metodo è che la larghezza della filia cellulare in vivo può essere quantificata in modo più coerente e conveniente rispetto alle precedenti tecniche di misurazione manuale, che richiedevano molto tempo.
Prima di iniziare la misurazione della larghezza dello strato senza celle, eseguire il file di script pre-MatLab dello strato senza celle. Quindi, fare clic su Apri file per selezionare il file video per l'analisi e regolare la diapositiva di rotazione per allineare verticalmente le pareti del singolo recipiente utilizzando la diapositiva di zoom per regolare il livello di zoom secondo necessità. Quando l'imbarcazione si trova nella posizione appropriata, fare clic su Conferma modifica, quindi fare clic su imposta ROI su ritaglio per definire la regione di interesse.
L'immagine allineata verrà visualizzata in una finestra pop-up. Regolare l'obiettivo rettangolare sull'immagine in base alle esigenze e fare doppio clic sull'obiettivo per confermare la regione di interesse. Quindi fare clic su Estrai immagini per estrarre tutti i fotogrammi video modificati in immagini bitmap consecutive, che si troveranno nella cartella con lo stesso nome del file video selezionato.
Per misurare la larghezza del livello libero da celle, fare clic su Seleziona cartella e fare clic sulla cartella delle immagini. Il primo fotogramma dell'immagine apparirà nel pannello dell'immagine in scala di grigi insieme all'istogramma dell'intensità del grigio corrispondente nel pannello dell'istogramma dell'immagine. Selezionare il fotogramma dell'immagine desiderato dalla casella di riepilogo per eseguire l'analisi e fare clic su Trova pareti del recipiente per identificare la parete interna del recipiente nell'immagine determinata come posizione in cui il picco del profilo di intensità della luce transita dal buio alla luce nell'arco di due pixel.
Controlla il filtro mediano per applicare un filtro mediano all'immagine per ridurre il rumore di sale e pepe. Controllare il contrasto automatico per la regolazione digitale dell'intensità dell'immagine per migliorare il contrasto dell'immagine. Selezionare quindi un algoritmo di soglia nella casella di riepilogo per determinare automaticamente il valore di soglia che divide i livelli di grigio in due classi, pixel bianchi con livelli di grigio superiori al valore di soglia e pixel neri con livelli di grigio inferiori al valore di soglia.
Per misurare la variazione spaziale delle larghezze dei livelli liberi da celle, immettere la risoluzione in pixel nella casella Risoluzione in pixel. Quindi fare clic su Calcola per ottenere la variazione spaziale delle larghezze dei livelli liberi da celle e fare clic su Esporta. CSV per esportare i dati sulla larghezza del layer senza celle in un formato tabulato.
Per misurare la variazione temporale delle larghezze degli strati liberi da celle in corrispondenza di una linea di analisi specifica lungo il recipiente, fare clic su Variazione temporale e immettere le informazioni sulla frequenza dei fotogrammi. Immettere il primo e l'ultimo fotogramma delle immagini per l'analisi rispettivamente nelle caselle fotogramma iniziale e ultimo fotogramma. Regolare la barra di scorrimento della linea di analisi per selezionare la posizione della linea di analisi lungo il recipiente e confermare la posizione della linea di analisi come illustrato sia nell'immagine in scala di grigi che in quella binaria.
Quindi fare clic su Calcola per ottenere la variazione temporale delle larghezze dei livelli liberi da celle e fare clic su Export. csv per esportare i dati della larghezza dei livelli liberi da celle in un formato tabulato. Qui, viene mostrato un tipico flusso di globuli rossi attraverso un'arteria non ramificata nel muscolo cremastere del ratto, dove si può osservare lo strato libero da cellule tra il nucleo dei globuli rossi e la parete interna del vaso.
Un buon contrasto tra questi componenti è fondamentale per garantire l'accuratezza delle misurazioni della larghezza dello strato senza celle. La fase iniziale dell'analisi delle immagini ha riguardato il rilevamento della parete interna del vaso. Acquisendo il profilo di intensità della luce lungo la linea di analisi perpendicolare al recipiente, la posizione viene approssimata al picco che transita dal buio alla luce nell'arco di due pixel.
Successivamente, i confini del core RBC vengono rilevati utilizzando l'algoritmo di soglia dell'immagine e le larghezze CFL possono quindi essere calcolate. Poiché i globuli rossi nello strato libero da cellule possiedono diverse trasmittanze della luce, la differenza nei livelli di grigio può essere suddivisa in due classi. Tuttavia, l'identificazione di un valore di soglia accurato tra i due picchi nell'istogramma dell'immagine può essere limitata da una scarsa qualità dell'immagine e da un contrasto inadeguati.
Per migliorare il contrasto tra i globuli rossi e lo strato privo di cellule, è possibile utilizzare un filtro blu. Ciò è ancora più evidente in queste immagini in cui i confini dei nuclei dei globuli rossi sono stati identificati in modo più accurato con un filtro blu. L'algoritmo di soglia può anche influenzare la misurazione della larghezza dello strato libero da cellule, come evidente in queste immagini in cui i diversi algoritmi di soglia hanno portato all'identificazione di diversi confini del nucleo dei globuli rossi e quindi di diverse larghezze dello strato libero da cellule.
La misurazione della larghezza dello strato libero da cellule in vivo è molto sensibile alla qualità delle immagini. Pertanto, assicurarsi di eseguire l'intervento chirurgico con attenzione e di utilizzare un assistente ottico appropriato per ottenere una buona qualità dell'immagine. Inoltre, è essenziale selezionare l'algoritmo di soglia dell'immagine appropriato per garantire una misurazione accurata e coerente della larghezza dello strato senza celle.
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Panoramica
Questo studio dimostra la preparazione chirurgica del muscolo cremastere del ratto per la visualizzazione dello strato privo di cellule in vivo. Il metodo permette una quantificazione coerente e conveniente della larghezza dello strato privo di cellule, affrontando questioni chiave nell'emodinamica microcircolatoria.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Emodinamica microcircolatoria
- Cellofilia nella microcircolazione
Contesto
- Lo strato privo di cellule è cruciale per comprendere la dinamica del flusso sanguigno.
- Le tecniche di misurazione precedenti erano dispendiose in termini di tempo e meno accurate.
- Le tecniche di visualizzazione in vivo migliorano l'affidabilità della misurazione.
Obiettivo dello studio
- Quantificare le variazioni spaziotemporali della larghezza dello strato privo di cellule in vivo.
- Migliorare la comprensione del ruolo della cellofilia nella microcircolazione.
Metodi utilizzati
- Preparazione chirurgica del muscolo cremastere del ratto.
- Utilizzo di uno script pre-MatLab per l'analisi.
- Analisi video per misurare la larghezza dello strato privo di cellule.
- Riduzione dell'area di interesse (ROI) per una misurazione focalizzata.
Risultati principali
- La larghezza dello strato privo di cellule in vivo può essere misurata con maggiore accuratezza.
- Il metodo fornisce un'alternativa più efficiente alle tecniche manuali.
Conclusioni
- La tecnica di preparazione chirurgica è efficace per la visualizzazione.
- Questo metodo migliora la comprensione dell'emodinamica microcircolatoria.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of the cell-free layer in microvessels enables precise interrogation of microcirculatory hemodynamics, supporting mechanistic de-risking in vascular biology and drug discovery. Automated, reproducible measurement of cell-free layer width enhances predictive confidence for early-stage target validation and informs translational models of blood flow. This capability is strategically relevant for biopharma teams seeking robust, quantitative endpoints in microvascular research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of microvascular flow dynamics for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of the cell-free layer in microcirculation.
- Provides reproducible, automated measurements to inform early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers validated image analysis workflows for consistent quantification of vessel parameters.
- Facilitates assay standardization and reproducibility through automated thresholding algorithms.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microvascular measurement endpoints with disease-relevant models in preclinical research.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by providing robust hemodynamic readouts.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microcirculatory data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative microvascular measurements that inform both early discovery and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in microcirculatory research.
- Screening: Provides reproducible, quantitative vessel measurements for assay readiness.
- Analytics: Outputs spatial and temporal cell-free layer width data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical models with consistent hemodynamic endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, automated image analysis pipeline for diverse vascular studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microvascular studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of vessel measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy and image analysis.
- Depends on high-quality imaging systems and computational infrastructure for automated analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and thresholding algorithms.
- Adaptation may be needed for different vessel types or animal models.
- Measurement accuracy is sensitive to image quality, filter selection, and thresholding method.
