Articolo metodologico

Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

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DOI:

10.3791/54682

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10 novembre 2016

 ,  , 
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

I protocolli qui descritti facilitano l'indagine conveniente delle risposte batteriche dell'etilene utilizzando l'acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA). L'etilene viene prodotto in situ attraverso la decomposizione del CEPA in un mezzo acquoso di crescita batterica, eludendo il requisito del gas etilene puro.

Abstract

L'etilene (C2H4) è un fitormone gassoso che è coinvolto in numerosi aspetti dello sviluppo delle piante, svolgendo un ruolo dominante nella senescenza e nella maturazione dei frutti. L'etilene esogeno applicato durante lo sviluppo precoce delle piante innesca il fenotipo a tripla risposta; un ipocotile più corto e più spesso con un uncino apicale esagerato. Nonostante l'intima relazione tra piante e batteri, l'effetto dell'etilene esogeno sui batteri è stato molto trascurato. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di controllare l'etilene gassoso all'interno del laboratorio senza attrezzature specializzate. L'acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA) è un composto che si decompone in etilene, cloro e fosfato in un rapporto molare 1:1:1:1 quando disciolto in un mezzo acquoso con pH 3,5 o superiore. Qui descriviamo l'uso del CEPA per produrre etilene in situ per lo studio della risposta all'etilene nei batteri utilizzando il batterio Komagataeibacter xylinus associato alla frutta e produttore di cellulosa come organismo modello. I protocolli qui descritti includono sia la verifica della produzione di etilene da CEPA tramite il saggio a tripla risposta di Arabidopsis thaliana sia gli effetti dell'etilene esogeno sulla produzione di cellulosa di K. xilinus, sulle proprietà della pellicola e sulla morfologia coloniale. Questi protocolli possono essere adattati per esaminare l'effetto dell'etilene su altri microbi utilizzando appropriati terreni di crescita e analisi del fenotipo. L'uso del CEPA fornisce ai ricercatori un'alternativa semplice ed efficiente al gas etilene puro per la determinazione di routine della risposta batterica all'etilene.

Introduzione

L'etilene olefina (C 2 H 4) fu scoperto come ormone vegetale nel 1901, quando si è osservato che piantine pisello, coltivate in un laboratorio che utilizza lampade a gas di carbone, mostravano una morfologia anomala in cui steli (ipocotili) erano più corte, più spessa e piegato di lato rispetto ai normali piantine di piselli; un fenotipo in seguito definito il 1,2 risposta tripla. Studi successivi hanno dimostrato che l'etilene è un fitormoni vitale che regola numerosi processi di sviluppo come la crescita, la risposta allo stress, la maturazione dei frutti e senescenza 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modello per la ricerca biologia vegetale, è stato ben studiato per quanto riguarda la sua risposta alla etilene. Mutanti risposta Diversi etilene sono stati isolati sfruttando il fenotipo risposta tripla osservato in dark-grown A. piantine thaliana in presenza di etilene 1,4,5. Il precursore biosintetico per la produzione di etilene in piante è 1-aAcido minocyclopropane carbossilico (ACC) 6 ed è comunemente usato per il test di risposta tripla per aumentare la produzione di etilene endogeno che porta alla tripla 1,4,5 risposta fenotipo.

Sebbene la risposta etilene viene ampiamente studiato nelle piante, l'effetto dell'etilene esogeno sui batteri è notevolmente poco studiata nonostante la stretta associazione di batteri con piante. Uno studio ha riportato che alcuni ceppi di Pseudomonas possono sopravvivere con etilene come unica fonte di carbonio e di energia 7. Tuttavia, solo due studi hanno dimostrato che i batteri rispondono all'etilene. Il primo studio ha mostrato che ceppi di Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida e P. syringae erano chemiotattica verso etilene utilizzando un test spina agarosio in cui agarosio fuso è stato mescolato con un buffer chemiotassi equilibrata con gas puro etilene 8. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono stati Furthrapporti er usano gas etilene puro per caratterizzare la risposta di etilene batterica, probabilmente a causa della difficilmente di gestire gas in laboratorio, senza attrezzature specializzate. La seconda relazione di risposta etilene batterica dimostrato che un aumento della produzione di etilene di cellulosa batterica e l'espressione genica influenzato nel batterio frutta-associata, Komagataeibacter (ex Gluconacetobacter) xylinus 9. In questo caso, il composto di etilene-releasing, acido 2-chloroethylphosphonic (CEPA) è stato usato per la produzione di etilene in situ nel mezzo di crescita batterica, bypassando la necessità di etilene puro o attrezzature specializzate.

CEPA produce etilene in un rapporto 1: 1 molare sopra pH 3,5 10,11 attraverso un primo ordine di reazione base-catalizzata 12 - 14. La degradazione del CEPA è correlata positivamente con pH e temperatura 13,14 e risultati nella produzione di etilene, cloruro e fosfato. CEPA fornisce ai ricercatori interessati a studiare le risposte batterici di etilene con una comoda alternativa per l'etilene gassoso.

L'obiettivo generale dei seguenti protocolli è di fornire un metodo semplice ed efficace per studiare la risposta di etilene batterica e comprende la convalida dei livelli fisiologicamente rilevanti di produzione di etilene da CEPA decomposizione in mezzo di crescita batterica, analisi di pH cultura per assicurare CEPA decomposizione non è compromessa durante crescita batterica, e la valutazione degli effetti dell'etilene sulla morfologia batterica e fenotipo. Dimostriamo questi protocolli che utilizzano K. xylinus, tuttavia, questi protocolli può essere adattato per studiare la risposta di etilene in altri batteri utilizzando il terreno di coltura appropriato e analisi fenotipo.

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Protocollo

1. Prodotti chimici

  1. Preparare una soluzione di 500 mM CEPA (144.49 g / mol), e una soluzione costituita sia 500 mM NaCl (58.44 g / mol) e 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137.99 g / mol) in acidificata (pH 2.5) ultra-acqua pura o 0,1 N HCl. Mescolare con un vortice fino a quando le soluzioni sono chiare.
  2. In serie diluire (10x) le soluzioni 500 mm nello stesso solvente per ottenere 5 mm e 50 titoli mm.
  3. Preparare una soluzione di 10 mm 1-aminociclopropano acido carbossilico (ACC; 101.1 g / mol) in acqua ultra-pura.
  4. Filtro-sterilizzare soluzioni di riserva e aliquote conservare a -20 ° C.
  5. Filtro-sterilizzare cellulasi. Aliquote Conservare a 4 ° C.

2. Verifica Etilene produzione da 2-Chloroethylphosphonic acido di decomposizione: Triple Assay Risposta

  1. Surface-sterilizzare Arabidopsis thaliana Ecotipo Columbia Seeds Uso della fase vapore Metodo:
    ATTENZIONE: Il passo successivo produce tgas di cloro ossico. Condurre la sterilizzazione seme in una cappa aspirante.
    1. Ottenere un contenitore sigillabile profondo abbastanza per ospitare un bicchiere di vetro da 250 ml per la sterilizzazione del seme e metterlo in una cappa aspirante.
    2. Aggiungere A. thaliana semi in una provetta e posizionare il tubo in un rack. Posizionare il rack che contiene il tubo aperto nel contenitore richiudibile.
      Nota: Non riempire singoli tubi oltre mezzo pieno per consentire al gas di cloro di penetrare i semi inferiori.
    3. Inserire un becher da 250 ml contenente 100 ml di candeggina commerciale nel contenitore sigillabile. Aggiungere con cautela 3 ml di HCl concentrato alla candeggina e sigillare immediatamente il contenitore con il suo coperchio.
      ATTENZIONE: Bleach e HCl reagiscono per produrre gas di cloro tossico che agisce in superficie-sterilizzare i semi.
    4. Incubare i semi in presenza di cloro gassoso per 4 ore in fumehood.
      Nota: i tempi di sterilizzazione più lunghi ridurre l'efficienza di germinazione.
    5. Dopo la sterilizzazione, consentire cgas hlorine per sfogare la cappa per almeno 1 ora poi sigillare la provetta. Lasciare la candeggina e la miscela HCl nel fumehood per almeno 24 ore prima dello smaltimento.
      Nota: i semi sterilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente per un utilizzo immediato.
    6. Conservare i semi a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Portare i semi a temperatura ambiente prima di aprire la provetta per evitare la formazione di condensa. semi Conservare al buio.
  2. Preparare piastre di agar a 4-settore Petri Piatti (90 x 15 mm):
    1. Preparare 110 ml di terreno di coltura per A. thaliana piantine: 1x Murashige e Skoog (MS) terreno base 15 (4.33 g / L) contenente 1% (w / v) di saccarosio e 0,8% (w / v) di agar. Regolare il supporto MS a pH 6 con NaOH.
    2. Preparare 100 ml di terreno di coltura batterica di CEPA decomposizione: Schramm e Hestrin (SH) medium 16 contenente 1,5% (w / v) di agar. Regolare il medium SH a pH 7 con NaOH.
    3. Sterilizzare i media in autoclave e Temper a bagnomaria C 55 °.
    4. Una volta che l'agar MS ha temprato, aggiungere 40 ml in un pallone sterile. Per preparare il terreno di coltura controllo positivo per A. thaliana piantine, completano l'40 ml aliquota di MS agar con 40 ml di 10 mm secondo per ottenere una concentrazione finale di 10 micron ACC.
    5. Aggiungere 5 ml di terreno ai quadranti appropriate delle piastre Petri settorizzati (Figura 1) e consentire l'agar solidificare. Preparare tutte le lastre in triplice copia.
      Nota: CEPA non viene aggiunto al mezzo di crescita fino al più tardi nel protocollo.

figure-protocol-1
Figura 1:. Installazione di piastre di agar utilizzati per il test di risposta tripla con CEPA Uno schema illustra i quadranti specifici per il controllo negativo (A), controllo positivo (B), e piastre sperimentali (C). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Stratify A. thaliana semi di germinazione Assicurarsi sincrono:
    1. Aggiungere circa cinquanta A. semi thaliana viene eseguito su ciascun quadrante contenente MS o MS + ACC agar. Assicurarsi che i semi sono distribuiti in modo uniforme per facilitare la rimozione piantina e l'analisi.
    2. Incubare le piastre contenenti semi al buio a 4 ° C per 3-4 giorni.
  2. Scomporre CEPA su batterica di crescita a medio (SH) ed eseguire Triple test di risposta:
    1. Dopo stratificazione, esporre i semi di luce fluorescente per 2 ore.
    2. Distribuire 10 ml di soluzione stock di 500 mM CEPA sui quadranti delle piastre sperimentali contenenti SH agar (pH 7; Figura 1) per ottenere una concentrazione finale CEPAdi 1 mM.
    3. Sigillare i piatti con pellicola di laboratorio e coprire con un foglio per creare un ambiente scuro per i semi.
    4. Germinare semi incubando le piastre al buio a 23 ° C per 3 giorni con il lato agar giù.
      Nota: Le piastre possono essere impilati, ma controlli negativi dovrebbero essere collocati sul fondo dal etilene è più leggero dell'aria.
  3. Analizzare Triple Risposta Assay dati:
    1. Con una pinza di fiamma sterilizzato, rimuovere singole piantine da una piastra corrispondente ad ogni trattamento e vista sotto un microscopio da dissezione o USB digitale. Assicurarsi che il fondo delle piantine sono allineati e fotografia.
    2. Rimuovere 30 piantine da ogni quadrante (60 piantine per replica biologica e 180 piantine per il trattamento). Allineare su una superficie con uno sfondo nero e la fotografia con un righello.
    3. Misurare la lunghezza hypocotyl (mm) di piantine ripetute utilizzando il software ImageJ 17. Impostare la scala facendo clic e trascinando il * diritta *strumento per selezionare una lunghezza di 10 mm. Selezionare "Set Scale" nella scheda "Analizza" e impostare la distanza nota a 10. Utilizzando lo strumento * * segmentato, fare clic e trascinare per selezionare la lunghezza della dell'ipocotilo e premere M per misurare la distanza. Confronta i mezzi di repliche biologiche con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di un Tukey. Le differenze sono ritenuti significativi se p <0.05.

3. Analisi del pH durante la crescita batterica

  1. Crescere e quantificare Komagataeibacter Culture xylinus Starter in triplice copia:
    1. Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore).
    2. Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml sterile 0,85% (w / v) NaCl soluzione, lavare le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio.
    3. Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser.
  2. Seminare Culture per l'analisi di pH:
    1. Aggiungere 150 ml di brodo SH (pH 7) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione a dodici 500 ml flaconi con coperchi foglio. Seminare palloni con K. colture starter xylinus ad una concentrazione di 10 5 cellule / ml. Utilizzando le tre colture starter, preparare tre repliche biologiche per il trattamento.
    2. culture integrare con 300 ml di soluzioni madre 5, 50, o 500 mm CEPA per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1 e 1,0 mm, rispettivamente. Supplemento colture di controllo non trattati con 300 ml di solvente usato per sciogliere CEPA.
    3. Sigillare beute mediante nastratura ermeticamente i coperchi foglio nei flaconi e incubare culture per 14 giorni a 30 ° C con agitazione a 150 rpm.
  3. Ogni giorno, Asepticarimuovere lly 5 ml campioni provenienti da ciascuno cellule pallone e pellet per centrifugazione (2.000 x g, 4 ° C; 10 min). Trasferire surnatanti in una provetta pulita e misurare il pH di ciascun replicato biologica usando un pH-metro.
  4. Analizzare i dati in tempo portate dalla graficamente il pH media delle repliche biologiche.
    Nota: È importante che il pH coltura non scenda sotto 3,5; un pH cultura 5 riduce significativamente rilascio etilene da CEPA, e un pH inferiore a 3,5 inibisce completamente il rilascio di etilene.
  5. Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente.

4. Colony Morfologia

  1. Grow K. Culture xylinus Starter in triplice copia:
    1. Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. incubaculture te a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore).
    2. Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare le cellule e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio.
  2. Preparare 24 piastre di agar contenenti 25 ml di SH (pH 7) medie con 1,5% (w / v) di agar.
  3. Una volta che l'agar è solidificato, diffusa 50 ml di 5, 50, e 500 soluzioni madre mM CEPA su agar per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Impostare placche di comando trattato e del solvente, che consistono di alcuna modifica e la diffusione di 50 ml di solvente usato per sciogliere i composti di prova.
  4. Piastre di scansione per gli colonie isolate con un ciclo-completo (~ 5 ml) di K. xylinus coltura starter e sigillarli con la pellicola di paraffina. Seminare tutte le lastre in triplice copia. Incubare le piastre per cinque giorni a 30 ° C.
  5. Photcolonie ograph a 20X di ingrandimento utilizzando un microscopio digitale USB e qualitativamente valutare la morfologia e la cellulosa di produzione coloniale su terreno solido.
    Nota: Cellulosa appare come sostanza nebuloso lungo il margine della colonia.
  6. Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente.

5. Pellicle Assays

  1. Crescere e quantificare K. Culture xylinus Starter in triplice copia:
    1. In triplice copia, inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore).
    2. Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare tlui le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio.
    3. Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser.
  2. Preparare Master Mix per inoculare piastre da 24 pozzetti:
    1. Supplemento 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di 5, 50, e 500 mM scorte CEPA avere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Supplemento altri 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di solvente usato per sciogliere CEPA. Vortex per miscelare.
    2. Dividere ogni 60 ml di CEPA contenente mezzo in quattro 14 ml aliquote. Inoculare tre dei 14 ml aliquote con repliche biologiche di coltura starter alla concentrazione di 10 5 cellule / ml. Mantenere i tubi con le cellule in ghiaccio per evitare la produzione di cellulosa.
      Nota: Il restante 14 ml un'aliquota sarà utilizzato per pozzetti di controllo sterili.
  3. Seminare piastre da 24 pozzetti:
    1. Testare ogni trattamento nel proprio piatto con tre file di repliche biologiche euna fila di controlli sterili (Figura 2).

figure-protocol-2
Figura 2:. Flow-chart che illustra il protocollo utilizzato per il saggio pellicola e l'analisi della CEPA supplementato medio SH pH 7 (60 ml) è aliquotati per tre inoculazioni replicati biologica separati e un controllo sterile (14 ml ciascuna). Tali colture sono poi aliquotati in sei repliche tecniche (2 ml) in una piastra ben 24 e quindi sigillati con parafilm. Dopo incubazione per 7 giorni a 30 ° C, pellicole vengono raccolte e caratterizzati determinando peso umido, spessore, peso a secco, e cristallinità dal FT-IR. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura

  1. Utilizzando il master mix 14 ml, aggiungere 2 ml in each di sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti sterili. Completare per le tre repliche biologiche e controllo sterile (Figura 2). Ripetere l'operazione per ogni trattamento.
  2. piastre di tenuta con la pellicola di paraffina e incubare staticamente per 7 giorni a 30 ° C.
  1. Raccolta e Misura Pellicle Wet peso, spessore, asciutto Peso (cellulosa Yield) e cristallinità (Figura 2):
    1. Premere un lato della pellicola di elevare il bordo pellicle avversaria e rimuovere singole pellicole con una pinza. Pur mantenendo la presa, metterli su un tovagliolo di carta fresca per 3 secondi per rimuovere eccesso di terreno prima della pesatura per determinare il loro peso umido.
    2. Allineare pellicole adiacenti ad un righello e fotografia dal lato utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione.
    3. Utilizzando il software ImageJ 17, misurare lo spessore pellicola sulla spalla sinistra, spalla destra e al centro di ogni pellicola. Medio Tutti i replicati tecnici per ogni Replicat biologicae.
    4. trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di un 6-pozzetti. Trattare pellicole con 12 ml di 0,1 N NaOH a 80 ° C per 20 minuti per lisare le cellule.
    5. Rimuovere il NaOH e neutralizzare pellicole mediante lavaggio con acqua ultra pura per 24 ore con agitazione. Cambiare l'acqua ogni 6 ore.
      Nota: pellicole dovrebbero essere bianco al termine della fase di lavaggio.
    6. Inserire pellicole stuoie silicio e asciutto a 50 ° C per 48 ore fino a peso costante. Una volta asciutto, togliere dal stuoie e misurare pesi pellicle su una bilancia analitica per determinare il rendimento di cellulosa batterica.
    7. Analizzare pellicola cristallinità mediante trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FT-IR) utilizzando 32 scansioni e una risoluzione di 4 cm -1 nell'intervallo 4000 a 650 cm -1. Calcolare l'indice di cristallinità, CI (IR), utilizzando un 1437 / A 895; il rapporto di assorbanza del "banda cristallina" e "banda amorfa" come descritto in precedenza 18.
  2. Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente.
  3. Analizzare Pellicle dati:
    1. Calcolare pellicola idratazione determinando la differenza tra pellicola peso umido e il peso secco.
    2. La media dei valori di tutti i replicati tecniche per ottenere un singolo valore per ciascun replicato biologico per l'analisi statistica. Confronto trattamenti con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di Tukey. Le differenze sono significative se p <0.05.
    3. Normalizzare i dati come la percentuale dei controlli non trattati e riportare i mezzi di repliche biologiche.

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Risultati

Una configurazione schematica piatto per la verifica dell'etilene liberazione dal CEPA in terreno SH (pH 7) con il test triplice risposta è illustrato in Figura 1A - C. Un diagramma di flusso illustrante il protocollo pellicola è mostrato in Figura 2. Dark-grown A. thaliana piantine mostrano il fenotipo triplice risposta (hypocotyl più breve e più spesso di un gancio apicale esagerata) in presenza di ACC e in presenza di eti...

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Discussione

I metodi qui descritti illustrano la produzione in situ di etilene da CEPA per lo studio della risposta etilene batterica usando l'organismo modello, K. xylinus. Questo metodo è molto utile come etilene può essere prodotto da integrare qualsiasi mezzo acquoso che ha un pH superiore a 3,5 10,11 con CEPA eliminando la necessità di etilene puro o di laboratorio specializzato. Questo metodo non è limitato a studiare gli effetti di etilene CEPA derivato sui batteri, ma può essere anche essere...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Dario Bonetta per aver fornito i semi di Arabidopsis thaliana e per l'assistenza tecnica per quanto riguarda il test di tripla risposta, così come Simone Quaranta per l'aiuto con FT-IR. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per la scoperta del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC-DG) a JLS, da una borsa di studio per laureati dell'Ontario (OGS) a RVA e da una borsa di studio per laureati Queen Elizabeth II in Scienza e Tecnologia (QEII-GSST) a AJV.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido carbossilico 1-amminociclopropano (ACC)SigmaA3903Precursore biosintetico dell'etilene nelle piante
Piastra di Petri a 4 settoriPhoenix BiomedicalCA73370-022Per testare la tripla risposta
AgarBioShopAGR001.1Per solidificare il mezzo
Canon Rebel T1i Fotocamera DLSRCanon3818B004Per le immagini delle pellicole
Cellulasi da Trichoderma reesei ATCC 26921 SigmaC2730Soluzione acquosa
Acido citricoBioShopCIT002.500Per SH medium
Candeggina commercialeLife Brand57800861874Candeggina per la sterilizzazione dei semi
HCl concentratoBioShopHCL666.500Acido cloridrico per la regolazione del pH
Microscopio digitale USBCollegabileN/APer immagini di colonie
Ethephon (≥ 96%; Acido 2-cloroetilfosfonico)SigmaC0143Composto di rilascio di etilene
GlucosioBioBasicGB0219Per SH medio
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582ATCC53582Batterio alfaproteobatterico batterico produttore di cellulosa
Provetta per microcentrifugaLifeGeneLMCT1.7B1,7 ml provetta per microcentrifuga
Murashige e Skoog (MS) basale medio Mezzo di crescita SigmaM5519Arabidopsis thaliana
Na2HPO4· 7H2O BioShopSPD579.500Fosfato di sodio, eptaidrato bibasico per SH medio
NaClBioBasicSOD001.1Cloruro di sodio per soluzione salina e di controllo
NaH2PO4· H2O BioShopSPM306.500Fosfato di sodio, monobasico monoidrato per soluzione di controllo
NaOHBioShopSHY700.500Idrossido di sodio per la regolazione del pH
Film di paraffinaParafilmPM996Per sigillare piastre e matracci
Peptone (batteriologico)BioShopPEP403.1Per
SH medium Petroff-Hausser camera di conteggioHausser scientific3900Camera di conteggio delle cellule batteriche
Filtro di sterilizzazione in polietersulfone 0,2 &; mVWR28145-501Per sterilizzare la cellulasi
SaccarosioBioShopSUC600.1Saccarosio per MS medium
Estratto di lievitoBioBasicG0961Per SH medium

Riferimenti

  1. Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
  2. Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
  3. Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
  4. Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
  5. Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
  6. Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
  7. Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
  8. Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
  9. Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459(2015).
  10. Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
  11. Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
  12. Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
  13. Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
  14. Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).

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