Articolo metodologico

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

8.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54710

⸱

25 gennaio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Abstract

topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell'intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all'interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l'inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all'interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 + CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all'interno della lamina propria delle piccole tessuti dell'intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.

Introduzione

Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente 1, 2, 3 sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura che richiede tempo e costosa. Così, un metodo semplice per la generazione di topi transgenici è desiderabile.

Le citochine sono una vasta classe di piccole proteine ​​secrete / peptidi che regolano le risposte immunitarie attraverso la segnalazione intercellulare. L'interleuchina 22 (IL-22) è una citochina con molte riferito attività, tra cui barriera function, la riparazione dei tessuti e l'infiammazione 4. Sebbene IL-22 è stato inizialmente scoperto come prodotto delle cellule T 5, rapporti successivi hanno dimostrato la sua espressione nelle cellule natural killer (NK) negli esseri umani 6 e 7 topi e in altre classi di linfociti innate 8. Nonostante vasta osservazione di cellule-22 che producono IL, visualizzazione di IL-22 in precedenza necessaria la stimolazione ex vivo e permeabilizzazione alle macchie con anticorpi. Pertanto, il romanzo IL-22 topi reporter sarebbe uno strumento molto utile per studiare la funzione di IL-22 nei processi omeostatici e patogeni.

Qui, abbiamo sviluppato un modello semplificato transgenico giornalista mouse per osservare le cellule IL-22-producono in vivo e in vitro. Utilizzando un metodo BAC recombineering 9, abbiamo inserito la sequenza tdTomato cDNA con Poly A frammenti di segnale in IL-22 locnoi e sostituito esone 1. Le altre regioni, esoni, e gli elementi normativi non tradotte non sono stati perturbati, dal momento che vorremmo imitare la regolazione naturale della IL-22, per quanto possibile. Il sito di inserimento giornalista interrompe la sequenza di segnale, con conseguente accumulo del reporter all'interno delle cellule che producono, a differenza di IL-22 stessa, che sta rapidamente secreto. Questo nuovo metodo può essere applicato anche alla generazione di topi transgenici per altre proteine ​​secrete.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutti gli animali hanno ricevuto cure adeguate secondo le procedure sperimentali descritte nella Guida 2011 per cura e l'uso di animali da laboratorio Comitato di Federico Laboratorio Nazionale per la Ricerca sul Cancro.

1. Generazione di IL-22-tdTomato topi reporter di BAC recombineering

NOTA: I topi dovrebbero essere inconscia e non si muovono in risposta a uno stimolo nocivo. Sterilizzare l'area chirurgica con il 70% di etanolo e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro.

  1. Purificare BAC DNA (RP23-401E11, lunghezza clone di 228391 bps) utilizzando un metodo di estrazione alcalina 10, 11. Caratterizzare il clone BAC da SpeI digestione di 5 mg di RP23-401E11 per confermare la dimensione corretta del gene bersaglio. NOTA: Il BAC DNA è stato digerito in 14 frammenti.
  2. Inserire il gene TdTomato giornalista nel sito Not I / Sal I del vettore shuttle PLD53SC-A-GFP-B11 e sostituire il gene GFP nello stesso sito. Quindi, utilizzando BAC RP23-401E11 come modello, amplificare le caselle di omologia (A e B) al primo esone tradotta di Il-22 (esone 1) mediante PCR (95 ° C 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 secondi, e una estensione finale a 72 ° C per 10 min). In un sistema di reazione PCR 50 microlitri, aggiungere 50 ng (1 ml) di BAC DNA, 0,5 ml di primer (10 mM), 40 ml di PCR Supermix alta fedeltà, e 8 ml di H 2 O.
    NOTA: I primer per le caselle A e B sono i seguenti: Una casella in avanti: 5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e Reverse: 5'-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Scatola B Forward: 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. I siti degli enzimi di restrizione (Asc I e Pac I) sono sottolineate.
  3. Legare 500 ng di Asc I-digerito A e 500 ng di Fragm B Pac I-digeritoEnt in 50 ng di PLD53SC-ATB (tdTomato) vettore a 16 ° C per 1 ora.
  4. Transform purificato vettoriale PLD53SC-ATB in cellule BAC-competenti 11 e li cultura su Luria-Bertani (LB) piastre di agar con cloramfenicolo (20 mg / ml) e ampicillina (30 mcg / ml) a 37 ° C. Scegli due o tre colonie di co-integrazione dalle piastre maestro Ch / Amp.
  5. Inoculare ogni colonia in 1 ml di LB addizionato con 20 ug / ml di cloramfenicolo e incubare per 1 ora a 37 ° C e 225 rpm. Distribuire 100 ml di ciascuna miscela su una piastra di LB-agar (10 g di Peptone 140, 5 g di estratto di lievito, 12 g di agar e 1 L di acqua; pH 7.5) addizionato con cloramfenicolo e 4-4,5% di saccarosio. Incubare la cultura durante la notte a 37 ° C.
  6. Scegli entrambe colonie grandi e piccoli e li replate su due piatti LB-agar con cloramfenicolo. Poi, esporre le piastre con o senza luce UV per 30 sec e raccogliere le colonie sensibili agli UV per ulteriori analisi.
  7. Identificare il DNA BAC modificato mediante PCR utilizzando tdTomato / IL-22 Primer eterozigote (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverse: 5' TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). Le condizioni Thermocycler sono le seguenti: 95 ° C per 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 56 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; e una estensione finale a 72 ° C per 10 min.
  8. Conferma la sequenza dell'area modificata del BAC BAC sequenziamento diretto di grandi prep BAC DNA 12.
  9. Anestetizzare un mouse destinatario con una dose di 0,25% tribromoethanol nella cavità peritoneale, quando impiantare gli zigoti microiniettati in topi / 6c C57BL pseudo-gravidanza.
  10. Linearizzare l'IL-22-tdTomato BAC costrutto (10 mg) mediante digestione con 5 ml di restrizione endonucleasePi-SCEI in 100 ml di sistema di reazione e microinject il DNA linearizzato BAC in uova fecondate di C57BL / 6 femmine in fase di pronuclei 13. Screit il topi transgenici con l'analisi Southern blot di DNA isolati da biopsie di coda utilizzando le procedure standard.

Preparazione 2. Single-cell da milza, timo, linfonodi, e le placche di Peyer

NOTA: topi reporter IL-22-tdTomato sono stati mantenuti al National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Il metodo di eutanasia è conforme alle più recenti linee guida AVMA sull'eutanasia. Tutti i topi sono stati sacrificati con CO 2 inalazione 14.

  1. Euthanize un IL-22-tdTomato del mouse in una camera di CO 2 e metterlo su un tampone pulito. Sterilizzare la pelle dell'addome spruzzando il 70% di alcol e tagliarlo aperto. Rimuovere la milza nel fianco sinistro e il timo dietro lo sterno.
  2. Per raccogliere i nodi mesentericlymph (situato nel tessuto mesenterico) e placche di Peyer (piccoli lymphoidnodules in tutta la regione ileo dell'intestino tenue), prendere la mesenterica bianco perlato i nodi vicino alla tegli parete dell'intestino tenue con sezionare pinze con punte a punta fine seghettati e poi rimuovere l'intero intestino tenue e colon fuori dal corpo. Trova le patch ovali estesi (placche del Peyer) lungo l'intestino e tagliarli con le forbici. Macinare questi tessuti linfoidi (linfonodi e placche di Peyer) individualmente tra due vetrini smerigliati in una cella singola sospensione in PBS / 1% di siero fetale bovino (FBS) tampone sul ghiaccio.
  3. Tritare la milza o tessuti timo utilizzando lo stesso metodo come al punto 2.2. Centrifugare la sospensione della milza per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi ACK per milza per i pellet cellulari.
  4. Mescolare bene e lasciare riposare per 1 min. Aggiungere 9 ml di tampone sterile tampone fosfato salino (PBS) per ogni campione. Centrifugare per centrifugazione per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C per rimuovere i globuli rossi.
    NOTA: Non aggiungere ACK buffer di lisi delle cellule del timo.
  5. Risospendere le leucociti risultanti in 5 ml di PBS e pass le cellule attraverso un colino cella di 100 micron. Raccogliere il pellet di cellule per centrifugazione a 500 g per 8 minuti.
  6. Risospendere le cellule in 5 ml di media RPMI o tampone FACS e contare le cellule vitali utilizzando 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS.

3. Isolamento di intraepiteliale linfociti e lamina propria cellule dall'intestino

  1. Aprire la pelle addominale come al punto 2.1, tagliare l'intestino tenue, dal duodeno (accanto allo stomaco) per ileo (vicino alla appendice), e l'intero colon, proprio sopra l'ano. Rimuovere il adiposo in più e pinze dei tessuti utilizzando mesenterici. Mettere subito l'intestino in PBS ghiacciato.
  2. Se vuoi placche di Peyer (piccole, noduli grezzi) lungo la regione distale del piccolo intestino. Rimuovere le masse con pinza Andopen dell'intestino lunghezza con le forbici. Lavare accuratamente l'intestino con 10 ml di PBS ghiacciato.
  3. Incubare i tessuti in 20 ml di tampone di pre-digestione (5 mM EDTAe 1 mM ditiotreitolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)) per 30 minuti a 37 ° C con rotazione lenta (50 rpm) in un agitatore. Dopo ciascuna delle 2 incubazione, rimuovere lo strato di cellule epiteliali, che contiene i linfociti intraepiteliali (IELS), da un'intensa vortex (30 sec a 12.000 giri al minuto) e passare tutti i tessuti attraverso un colino cella di 100 micron.
  4. Aggiungere 20 ml di soluzione EDTA al tessuto per la seconda incubazione per 30 min a 37 ° C. Passare le frazioni IEL attraverso un colino cella di 100 micron e piscina con le frazioni precedenti. Mantenere i frammenti rimanenti intestino sul ghiaccio da trattare nella fase 3.9.
  5. Centrifugare le frazioni IEL in pool a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare le frazioni IEL in pool con 10 ml di HBSS / 5% FBS e spin giù per 5 min a 800 xg e 4 ° C.
  6. Risospendere le cellule in 8 ml di terreno 44% di silice colloidale e 15 rivestirle medio silice colloidale 5 ml di 67%. Centrifugare il 44% / 67.5% Di pendenza miscela di cellule per 20 minuti a temperatura ambiente e 1.500 x g.
  7. Raccogliere le cellule IEL della band a livello di interfaccia. Innanzitutto, rimuovere lo strato superiore del surnatante (circa 5 ml) con 1 ml pipetta. Poi, IELS raccolta all'interfase della colloidale medio di silice gradiente.
  8. Lavare le IELS con l'aggiunta di 10 ml di terreno RPMI. Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 800 xg e 4 ° C. Risospendere le IELS in 5 ml di RPMI per passo 3.15.
  9. Per l'isolamento dei linfociti della lamina propria (LPLS), sminuzzare i frammenti di tessuto dell'intestino dal punto 3.4 in piccoli pezzi con le forbici (1 mm) e digerire i pezzi con 10 ml di tampone di digestione (0,05 g di collagenasi, 0,05 g di DNasiI, e 0,3 g di dispasi II in RPMI / 5% FBS) per 15-20 minuti a 37 ° C.
  10. Filtrare la miscela attraverso un colino cella di 70 micron. Il supernatante flow-through contiene LPL rilasciato.
  11. Completamente digerire i frammenti intestino ripetendo i passaggi 3,9-3,10 (di solito, devono essereripetuto 3 volte). Ogni volta, piscina il surnatante contenente il LPLS.
  12. Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 1500 xg e temperatura ambiente e risospendere il pellet in RPMI / 5% FBS. farli passare attraverso un colino cella di 40 micron.
  13. Risospendere le pellet cellulari in 10 ml della frazione 40% di 40:80 silice colloidale dislivello medio li sovrapporre 5 ml della frazione 80% in una provetta da 15 ml.
  14. Eseguire la separazione gradiente di densità per centrifugazione per 20 min a 1500 xg e temperatura ambiente 15.
  15. Raccogliere il LPLS, come descritto al punto 3.7. li Risciacquare una volta con 10 ml di PBS e risospendere il pellet in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS o mezzo RPMI.
  16. Contare le cellule vitali (sia IELS e LPLS) con lo 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS.

4. L'espressione di IL-22-tdTomato in Colite

  1. Preparare sospensioni cellulari milza singoli da topi IL-22-TdTomato ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml in PBS sterile, come descritto ai punti 2.1-2.4.
  2. Purificare le cellule T CD4 + con il mouse CD4 cellulare Metodo di isolamento Negativo 10. Etichettarli con l'anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) e anti-CD45RB FITC-(clone 16A, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) mediante incubazione a 4 ° C per 30 min.
  3. Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Lavare le cellule con 2 ml di PBS / 1% tampone FBS e risospendere in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS colorazione.
  4. Eseguire le cellule T etichettati su una macchina di citometria a flusso 16. Porta le cellule su una popolazione di cellule T e di ordinamento CD4 + CD45RB alte cellule doppio positive (la lunghezza d'onda rilevata a 488 nm e 633 nm) laser.
  5. Raccogliere le cellule ordinati per centrifugazione per 5 min a 500 xg e 4 ° C. Risospendere il pellet di cellule in tampone PBS sterile a 1 x 10 6 cellule / ml. Iniettare le cellule (0,5 x 10 6) nel peritoneo ofeach Rag1 - Mouse destinatario - /.
  6. Sacrificare i topi riceventi sotto di CO 2 in vari momenti. Raccogliere i linfonodi mesenterici e intestino tenue e crasso, come descritto ai punti 2.1 e 2.2. Mettere ogni linfonodo mesenterico e cut-aperto intestino (carta / intestino / carta del panino) nel 4% paraformaldeide (PFA, gestire sotto una cappa) durante la notte per riparare i tessuti. Sostituire il PFA con il 18% di saccarosio per 16-24 ore e poi congelare i tessuti per il sezionamento.
  7. Utilizzare la macchina criostato per tagliare il tessuto 17, 18, 19. Riscaldare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per circa 60 minuti e metterli in acetone per 10 min a temperatura ambiente. li asciugare a temperatura ambiente per circa 5 minuti.
  8. Aggiungere FBS in eccesso, rimuoverlo dalla pipetta e aggiungere anti-RFP ad un 1: BSA 200 diluizione nel 0,1% / 1x PBS. Incubare l'anticorpo a 37 ° C per 60 min.
  9. Risciacquare le sezioni in 1x PBS per 10 min e applicare l'anticorpo secondario corrispondente (goat anti-rabbit 568) al tessuto, diluito 1: 300 in 1% BSA / PBS 1x, per 30 min a temperatura ambiente.
  10. Sciacquare i vetrini in PBS 1x per 10 min, pulire asciugare e aggiungere lamelle.
  11. Visualizza tutti i campioni con un microscopio a fluorescenza in presenza di luce coerente (RFP: filtro di eccitazione 540-580 nm) con l'obiettivo 40X.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Un murino IL-22 giornalista transgene è stata creata usando recombineering per modificare un cromosoma artificiale batterico portando la IL-22 locus. La figura 1 mostra uno schema di pBACe3.6 vettore contenente il gene sacBII, un indicatore positivo-selezione, e cloramfenicolo antibiotico gene di resistenza 11. Dopo aver introdotto tdTomato in esone 1, la sequenza di peptide segnale è stato interrotto, come mostrato nella Figura 2...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

IL-22 svolge un ruolo essenziale nella innata difesa ospite e nel rimodellamento tissutale. Cellule-22 producono IL sono stati identificati ex vivo mediante colorazione intracellulare. Tuttavia, rimane ancora difficile da monitorare l'espressione di IL-22 in situ, sia allo stato normale o in condizioni infiammatorie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo per sviluppare un modello di topo IL-22 giornalista, che ci permette di localizzare le cellule giornalista esprimono in vivo. La cod...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Kelli Czarra e Megan Karwan per l'assistenza tecnica sugli animali, Kathleen Noer e Roberta Matthai per l'assistenza alla citometria a flusso e Donna Butcher e Miriam R. Anver per l'analisi patologica. Questo progetto è stato sostenuto da una sovvenzione della Ely and Edythe Broad Foundation (a Scott Durum) ed è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, nell'ambito del contratto n. HHSN261200800001E (MRA).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RP23-401E11 BACThermo Fisher ScientificRPCI23. CBisogno di ID gene: 50929
NucleoBond BAC 100Takara Clontech740579
PCR SuperMix High FidelityThermo Fisher Scientific10790020
PI-SceINew England BiolabsR0696S
SpeINew England BiolabsR0133S
LB BrodoThermo Fisher Scientific10855-0011 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Estratto di lievito, 5 g cloruro di sodio.
Anti-topo CD3eBioscience11-0031
Anti-topo CD4eBioscience17-0041
Anti-topo CD45Thermo Fisher ScientificMCD4530
Anti-topo CD45RBeBioscience11-0455
Anti-topo RFPAbcamAb62341
HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo rossoThermo Fisher Scientific 14175145KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-glucosio
Dnasi IRoche10104159001
tampone di lisi ACKThermo Fisher ScientificA1049201
PercollGE healthcare scienze della vita17-0891-01
Collagenasi DRoche11088858001
Dispase II (proteasi neutra, grado II)Microscopio
IX70OlympusRichiedi un Preventivo
Microscopio Nikon Eclipse 80iNikonRichiedi un Preventivo
Agitatoredinale Microscopia elettronica Science61050-10
FACSAriaBD BioscienceRichiedi un preventivo
LSRII SORP/citometria a flussoBecton, Dickinson and Company Richiedi un preventivo
a fluorescenza invertita Roche 4942078001

Riferimenti

  1. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
  2. Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750(2012).
  3. Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
  4. Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
  5. Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
  6. Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
  7. Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
  8. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
  9. Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637(2009).
  10. Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662(2015).
  11. Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
  12. Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
  13. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11(2009).
  14. Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
  15. Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
  16. Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991(2008).
  18. Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
  19. Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
  20. Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
  21. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
  22. Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
  23. Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
  24. Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
  25. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
  26. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
  27. Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
  28. Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Topi Reporter per IL 22Analisi tramite Citometria a FlussoRecombineering BACIsolamento delle Cellule TMicroscopia a FluorescenzaLinfonodi MesentericiLamina PropriaModello di ColiteCellule CD4 PositiveEspressione di tdTomato

Articoli correlati