Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Гиперполяризованный Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/54751
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1,2, 1, 3,4, 1,5,6, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Nuclear Medicine, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Chemistry, Technische Universität München, 3GE Global Research, 4Zentralinstitut für Medizintechnik der Technischen Universität München (IMETUM), Technische Universität München, 5Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, 6IDG Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München
* These authors contributed equally

Abstract

В последние десятилетия новые методы стадирования опухоли, рестадировании, мониторинг реакции на лечение, а также выявления рецидивов различных видов рака появились в сочетании с позитронно - эмиссионной томографии внедренный с 18 F-фтордезоксиглюкозы ([18 F ] -FDG ПЭТ). 13 C магнитно - резонансная томография спектроскопические (13 CMRSI) является минимально инвазивный метод визуализации , который позволяет контролировать метаболизм в естественных условиях и в режиме реального времени. Как и с любым другим методом , основанным на 13 С ядерного магнитного резонанса (ЯМР), она сталкивается с проблемой низкой тепловой поляризации и последующего низким отношением сигнал-шум из - за относительно низкой гиромагнитного отношения 13 С и его низкой изобилие природных ресурсов в биологические образцы. Путем преодоления этих ограничений, динамическая поляризация ядер (DNP) с последующим растворением образца в последнее время позволило широко используется ЯМР и магнитно-резонансная томография (МРТ) систем для измерения, Изучение и изображения ключевых метаболических путей в различных биологических системах. Особенно интересной и перспективной молекулы используется в 13 CMRSI является [1- 13 С] пируват, который, в последние десять лет, широко используется для в пробирке, доклинические, и, совсем недавно, клинические исследования для изучения метаболизма клеточной энергии при раке и других заболеваний. В этой статье мы опишем технику растворения DNP с использованием 3,35 T доклинические DNP hyperpolarizer и продемонстрировать его использование в исследованиях в пробирке. Аналогичный протокол для гиперполяризации могут быть применены по большей части в исследованиях в естественных условиях , а также. Для этого мы использовали лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и катализируют метаболические реакции [1- 13 С] пируват в [1- 13 C] лактат в клеточной линии карциномы простаты, PC3, в пробирке с использованием 13 CMRSI.

Introduction

В настоящее время наиболее широко используется клинический метод стадирования опухоли, рестадировании, мониторинг реакции на лечение, а также выявления рецидивов широкого спектра раковых заболеваний является [18 F] -FDG ПЭТ. 1 Тем не менее, в последнее время , несколько новых и альтернативных подходов появились. Одним из таких методов является 13 CMRSI. Этот метод включает введение C-молекулы 13 в биологическом образце, а затем минимально инвазивной МРТ для оценки метаболизма в пробирке или в естественных условиях в режиме реального времени. Тем не менее, самой большой проблемой 13 CMRSI, по сравнению с другими методами , такими как [18 F] -FDG ПЭТ или компьютерной томографии, является низкое отношение сигнал-шум.

Сигнал ЯМР прямо пропорционален уровню поляризации, отношение разности населения спин ½ ядер в двух энергетических состояниях к общей численности населения (рис 1А). Поляризация является продуктом-гогиромагнитное отношение е (γ) ядер и приложенное напряженность магнитного поля над температурой. Типичная поляризация ядер 1 Н порядка 0,001% до 0,005% при 3 Т, что дает относительно плохое отношение сигнал-шум. Сегодняшнее состояние дел в современной МРТ является успешным методом визуализации только из - за высокой численности 1 Н в биологических образцах и высокой гиромагнитному соотношении 1 Н (у 1H = 42,576 МГц / T). Тем не менее, наблюдая других ядер, таких как углерод, является более сложным. Единственным стабильным, магнитно - активный изотоп углерода 13 С, составляет лишь 1,1% от общего числа атомов углерода. Кроме того, гиромагнитное отношение 13 C (γ 13С = 10,705 МГц / T) в четыре раза меньше , чем у 1 Н, что приводит к более низкой эффективности обнаружения. Таким образом, низкое содержание 13 С и низкой γ 13С вызывают тепловые измерения 13 C для достижения 0,0176% от чувствительности 1Измерение Н-ЯМР в естественных условиях.

Динамическая поляризация ядер

Способ преодолеть сравнительно слабую чувствительность 13 измерений С DNP. Первоначально он был описан для металлов в 1953 году Альберт В. Оверхаузером. В своей статье он заявил: "Показано , что если электронный спиновый резонанс электронов проводимости насыщается, ядра будут поляризованы в той же степени они были бы , если их гиромагнитное отношение было то , что спина электрона." 2 В дальнейшем в том же году, Карвер и Слихтера экспериментально подтвердили гипотезу Оверхаузера 3. В 1958 г. Абрагам и Проктор описал этот эффект для электронов в жидкостях и назвал его "твердый эффект." При температурах ниже 4 К, электрон-спиновой поляризации достигает почти 100% и более чем на три порядка выше , чем ядерно-спиновой поляризации (рис 1B) 4. Tего происходит потому , что гиромагнитное отношение электрона (Г е = 28024,944 МГц / T) на три порядка выше , чем ядерных гиромагнитных соотношениях. Слабые взаимодействия между электронами и ядрами, таких как эффект Оверхаузера, твердый эффект, перекрестный эффект, и эффект термического смешивания, позволяют передавать поляризации от электронных спинов ядерных спинов с использованием микроволнового излучения с частотой, близкой к соответствующему электрона парамагнитного резонанса (ЭПР) частота 5,6. Теория ДНП получила дальнейшее развитие, чтобы привлечь большее количество электронов и тепловое перемешивание. Тем не менее, на сегодняшний день нет единого количественное теоретическое описание ДНП не было опубликовано 7,8.

Рисунок 1
Рисунок 1: Понимание динамической поляризации ядер и гиперполяризации. А) Схематическое сравнение спиновой заселенностив состоянии теплового равновесия поляризации и гиперполяризованным состояния. Б) поляризации зависит от температуры. Поляризация электронов (е -) достигает 100% ниже 1.4 K. ДНП обеспечивает передачу поляризации от e- до ядер 13 С, что увеличивает их поляризацию до 10 5 - кратно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для того, чтобы ввести ДНП в исследованиях биологических систем с использованием ЯМР 13 С, должны были быть разработаны последующее растворение быстрого образца. 50 лет после того, как гипотеза Оверхаузера, Ян Х. Ardenkjaer-Larsen и др. решена технически сложный вопрос о привлечении к гиперпол замороженного образца в жидкое состояние с потерей минимальным гиперполяризации 6. Растворение DNP открыл новое поле исследований под названием 13 КМРЯ, обеспечивая новый метод для исследования и описания различных состояний 9,10 болезни. В качестве стабильных носителей непарный электрон, тритильная радикала трис (8-карбокси-2,2,6,6-тетра (гидроксиэтил) -benzo- [1,2-4,5] -бис (1,3) -dithiole-4-ил) -метил натриевая соль (OX063) или (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил) оксил (TEMPO) обычно используется. Они смешиваются с желаемой молекулой 13 С-меченого и подвергается воздействию микроволнового излучения с частотой , близкой к соответствующей частоте ЭПР. Используя эту технику, поляризация ядер 13 С может быть увеличена до 37% 11. Это приводит к кратному усилению поляризации 10 5 по сравнению с тепловой равновесной поляризации 11,12. Тем не менее, как только микроволновое облучение прекращают и / или 13 С-молекула переходит в жидкое состояние, поляризация затухает с продольной релаксации (Т 1) ядра 13 С , который был поляризован. Таким образомИзобретение быстрых методов растворения или любой последующий метод сокращения времени до экспериментального измерения (т.е. инъекции) имеет решающее значение для биологических применений 13.

Существуют три основных требования , что молекула кандидат должен выполнить для успешного проведения 13 исследований CMRSI. Во- первых, 13 С ядром интерес должен иметь достаточно длинную T 1 (> 10 лет). Выбор 13 С-метки имеет решающее значение. Лучшие ядра - кандидаты являются атомы углерода, не имеющие прямого контакта с 1 Н-ядер через связь. Она также должна быть быстро метаболизируется в течение 2 - 3 Т - 1 раз, что приводит к потоку продукта метаболизма с существенно различным химическим сдвигом от исходного вещества. Образец смеси должна также образовывать аморфное стекло , если в твердом состоянии , так что пространственное распределение уменьшает расстояние между электроном и 13 С, что позволяет трансфер поляризации. Если молекула кандидат не образует аморфное стекло , естественно, она должна быть очень хорошо растворимы в Остекление агента, такого как глицерин или диметилсульфоксид 14. Эти требования приводят к относительно небольшому числу молекул-кандидатов. Тем не менее, даже после успешного открытия подходящей молекулы, разработка рабочего протокола для гиперполяризации может быть технически сложным 9,14,15.

В последние годы некоторые субстраты были успешно поляризованным, такие как [1- 13 С] пируват 12,16 - 36, [2- 13С] пируват 37, [1- 13 С] этилпируват 38, [1- 13 C ] лактат 39, [1- 13 C] фумарат 40 - 43, 13 С-бикарбонат 36,44,45, [1- 13 C] ацетата натрия 43,46 - 49, 13 C-мочевина 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutamiпе 15,52,53, [1- 13 C] глутамата 53,54, [1- 13 C] 2-оксоглутарат 55, [1- 13 C] аланин и другие 14,56. Особенно интересным и часто используемый субстрат для гиперполяризации является [1- 13 С] пируват. Он широко используется в доклинических исследованиях для изучения клеточной энергии-обмен веществ при различных заболеваниях 14,17,22. [1- 13 С] пируват отвечает всем требованиям для успешного гиперполяризации, в том числе относительно длинный T 1 и быстрого переноса через клеточную мембрану перед впоследствии метаболизируются. Доклинические исследования с [1- 13 С] пируват в настоящее время переводятся в клинику 57.

Метаболизм пирувата

Хорошо известно, что существует прямая связь между мутациями в ДНК рак клеток и изменение их метаболических путей. Уже в 1920-е годы, Отто Варбург DiscovERed , что существует повышенный метаболизм глюкозы и лактата в опухолях по сравнению с здоровой тканью 58 - 60. В дальнейшем различные чередований в других метаболических путей, таких как пентозофосфатного пути, цикла трикарбоновых кислот, окислительного фосфорилирования и синтеза нуклеотидов и липидов, которые были описаны.

Пируват является конечным продуктом гликолиза. В опухоли, она подвергается анаэробный гликолиз , катализируемой ЛДГ 61 и вступает в реакцию с восстановленной формой кофермента никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), в результате чего в лактат и окисленной формы кофермента (НАД +). В качестве альтернативы, пируват подвергается реакции переаминирования с глутамата с образованием аланина, катализируемой аланин-трансаминазы (АЛТ). Обе реакции легко обратимы. Пируват также подвергается декарбоксилирование, катализируемой пируват-дегидрогеназы (PDH) до диоксида углерода и ацетил-КоА, гepresenting необратимой реакции на этой стадии. Чередование этих скоростей реакций могут быть связаны с опухолью метаболизма 17,21,22,25,62. Метаболических путей приведены на рисунке 2.

фигура 2
Рисунок 2: Схема реакции основного метаболического пирувата. Пируват / лактат превращение катализируется СДГ, и преобразование пирувата / аланин катализируется ALT. Пируват необратимо превращается в ацетил-КоА и СО 2 PDH и СО 2 находится в зависимости от рН равновесии с бикарбонатом 80. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обнаружение гиперполяризованного [1- 13 С] пируват и его метаболитов было показано ранее на крысах онискусство 37,63 - 65, печень 66, мышцы и почки 62,67. Одно исследование показало существенные различия в соотношении лактат-к-аланин между нормальным и голодном печени крысы 66 и продемонстрировали высокую надземные и гиперполяризованного [1- 13 C] лактат уровень заболеваемости раком печени 68,69. Существует доказательство того, что степень злокачественности опухоли могут быть идентифицированы в трансгенной аденокарциномой простаты мыши (TRAMP) с использованием гиперполяризованного [1- 13 С] пируват 22, с гиперполяризованным уровней лактата , показывающие высокую корреляцию с гистологической степени подакцизным опухолей. Аланин , катализируемой из пирувата АЛТ также была предложена в качестве маркера в полезный крысы гепатоцеллюлярной карциномы 23.

Измерение пируват-лактат метаболический поток был использован для мониторинга ишемии 63,65,70 и в качестве реакции на лечение с химиотерапией 17,40 цитотоксическое, таргетных препаратов <SUP> 24,25,41, или лучевая терапия 26 на животных моделях. Он также используется для обнаружения фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K) ингибитором реакции LY294002 в мышиных моделях глиобластомы и рака молочной железы 25. Изменения в пирувата в опухолей головного мозга 26 и рак простаты 24,71 также наблюдались после лечения.

карцинома простаты

Рак предстательной железы является преобладающей формой рака у пожилых мужчин и второй ведущей связанных с раком смерти у мужчин во всем мире 72. На сегодняшний день нет надежных, неинвазивные методы не доступны для ранней диагностики и определения характеристик рака простаты 73,74, подчеркивая настоятельную необходимость новых методов визуализации обмена веществ , с тем чтобы строгое обнаружение и постановку пациентов. Рак простаты был использован в качестве модели для демонстрации возможности растворения ДНП в сочетании с 13 CMRSI у пациентаS 57. Эта работа была продолжена в первом клиническом испытании с использованием [1- 13 C] пирувата и 13 CMRSI для визуализации рака простаты, и она совсем недавно была завершена (NCT01229618).

Мотивацией данной работы , чтобы проиллюстрировать более подробно и для более широкой аудитории к применению метода 13 CMRSI в доклинической обстановке с клетками. Измерение ЛДГ-катализируемой метаболизм [1- 13 С] пируват в [1- 13 C] лактат в пробирке в клеточной линии карциномы простаты PC3, мы демонстрируем возможное применение растворения ДНП в исследованиях в пробирке и решения важных шагов и проблемы во время экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Образец исходного раствора Приготовление

  1. Добавить gadoterate меглумин (GadM, 0,5 моль / л) в концентрированной [1- 13 C] пировиноградной кислоты с получением конечной концентрации 1-ммоль / л GadM. Добавить тритильного радикала трис (8-карбокси-2,2,6,6-тетра (гидроксиэтил) -benzo- [1,2-4,5] бис- (1,3) -dithiole-4-ил) - метил натриевая соль (OX063) к этой смеси с получением конечной концентрации 15 ммоль / л. Vortex до полного растворения.
    Примечание: Этот препарат раствор предназначен для использования с 3,35-T доклинические DNP hyperpolarizer. Когда 7-Т клинической hyperpolarizer используется, то gadoterate меглумин не требуется, поскольку при более высоком магнитном поле, его преимущества незначительны. Добавление гадолиния на основе контрастного вещества повышает достижимую твердотельный поляризацию, а также скорость поляризации. Тем не менее, в жидком состоянии, контрастное вещество укорачивает время релаксации T 1.

2. Рост клеточной культуры

    2 125 роста см. Используйте среду F-12K , содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и поддержания клеток при 37 ° С в увлажненной атмосфере при 5% СО 2. Перед стадией растворения, удалите среду из колбы культуры.
    Примечание: Каждая линия клеток требует определенного протокола подготовки для распространения клеток. Обратитесь к требованиям с поставщиком клеточной линии.

3. Подготовка клеток для эксперимента

  1. Удалите среду клеток и промыть клетки с ~ 10 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
  2. Добавляют 5 мл трипсина в колбу и возвращают колбах культуры клеток в инкубаторе в течение 3 до 5 мин.
  3. Добавить ~ 5 мл F-12K среды для дезактивации трипсина.
  4. Граф клеток с применением автоматического счетчика клеток. Смешайте 10 мкл клеточного раствора с 10 мкл раствора красителя. хорошо перемешать с помощью пипетки и переносят 10 мкл смеси в гое камере "счетные стекла".
  5. Удалить и подсчет клеток в колбе (ов). Перенесите соответствующие объемы , содержащие желаемое количество клеток (например, 5 х 10 6 до 10 8) в пластиковых флаконах.
  6. Центрифуга клеток при 1200 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
  7. Повторное приостановить клеток в среде F-12K, содержащей 10% FCS до общего объема 800 мкл и перевести их в реакционную чашку (2 мл). Поместите реакционную чашку в пластиковый флакон с теплой водой.

4. Растворение агент Подготовка

Примечание: Агент растворения представляет собой жидкость, которая используется для растворения гиперполяризованного образца. В биологических применений, растворение обычно выполняется с Н 2 О на основе или оксид дейтерия (D 2 O) основе буферы, такие как PBS или трис (гидроксиметил) аминометан (Трис), содержащий 1 г / л этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

  1. PREPARAние 20 ммоль / л буфера PBS
    1. Для приготовления 100 мл агента растворения, растворите 36 мг мононатрийфосфата (NaH 2 PO 4), 247 мг динатрий фосфат (Na 2 HPO 4), и 10 мг ЭДТА в растворе 20 ммоль гидроксида / л натрия ( NaOH) в D 2 O. перемешались до полного растворения.
      Примечание: ЭДТА (1 г / л), добавляют в буфер, чтобы исключить возможные ферромагнитные ионы, которые могут испортить гиперполяризации. NaOH, используется для нейтрализации пировиноградной кислоты в соотношении 1: 1 моль до достижения рН 7,4.

5. Переменный температуры Вставка (ВТИ) Откат

  1. В поляризатор главном окне программы DNP-ЯМР, нажмите на кнопку "Перезарядка".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это включается вакуумный насос и эвакуирует VTI приблизительно 5,0 мбар. Затем игольчатый клапан между VTI и жидкого гелия резервуара полностью открывается, позволяя жидкий гелий течь в ВТИ. Скорость потока составляет гegulated с помощью игольчатого клапана для поддержания оптимального количества жидкого гелия в ВТИ, пока он не достигнет температуры кипения гелия. Затем ВТИ откачивают до почти полного вакуума, а температура достигает приблизительно 1,4 К. ВТИ заполнен жидким гелием до 65%. На данный момент, прибор готов к установке образца.

6. Подготовка проб и вставка

  1. С помощью микропипетки, добавьте ~ 8 мкл 13 С-меченого пробы исходного раствора в пластиковую чашку.
  2. Прикрепите пластиковый стаканчик к вставного стержня и инициировать процесс вставки образца, нажав кнопку "Вставить образец" в главном окне программы. Выберите "Нормальный образец" и нажмите кнопку "Продолжить".
    Примечание: Во время этого процесса, игольчатый клапан закрывается первым, чтобы прекратить подачу жидкого гелия в ВТИ, а давление в ВТИ затем возрастает. Держатель образца внутри ВТИ поднимается из жидкого гелия, впускной клапанв верхней части ВТИ открывается, и поток газа гелий вводится из впускного клапана для предотвращения внешнего загрязнения воздушной влаги.
  3. При появлении соответствующего запроса нажмите вставной стержень с прикрепленным пластиковую чашку вниз в ВТИ. Убедитесь, чтобы достигнуть держателя образца в нижней части ВТИ. В противном случае, газообразный гелий может толкать пробу из ВТИ.
  4. Отделить и снимите стержень вставки.
  5. Завершите процедуру, нажав кнопку "Далее" в диалоговом окне. Процедура вставки образца должна занимать не более 10 с.
    Примечание: Впускной клапан закрывает, газовый поток гелия прекращается, держатель образца с чашки для образца погружают в жидкий гелий, и игольчатый клапан открыт, чтобы позволить жидкий гелий течь в ВТИ. После 5 - 10 мин ВТИ охлаждают до температуры ниже 1,4 К, что позволяет все свободные электроны будут поляризованы.
  6. Убедитесь, что пластиковый стаканчик с образцом был введен правильно в ВТИ, проверяя тшлем он не прикреплен к вставного стержня или вытеснены из ВТИ гелиевым газом. Затем нажмите кнопку "Готово".

7. Микроволновая печь стреловидности (по желанию)

ПРИМЕЧАНИЕ: СВЧ - развертки позволяет определить оптимальную сверхвысокой частоты , чтобы максимально увеличить скорость гиперполяризации ядер 13 С в целевом соединении.

  1. Для измерения СВЧ развертки, запустите программу RINMR, типа "HYPERSENSENMR" и нажмите кнопку "Select Config" и "Do Microsweep."
  2. Чтобы начать процесс, выберите вкладку "откалибровать" в главном окне программы.
  3. Нажмите "Создать" и выбрать начальную и конечную частоту (например, 94,100 ГГц 94,200 ГГц), размер шага частоты (например, 20 МГц), мощность (100 МВт) и время (60 сек). Нажмите кнопку "Продолжить", "Включить" и "Пуск".
    Примечание: С помощью этих настроек, то hyperpolarizer первый поляризует образцав течение 60 с использованием микроволновой частоты 94.100 ГГц и мощностью 100 мВт. Затем он применяет 90 ° радиочастотный (RF) импульс и получает сигнал гиперполяризованного 13 С помощью встроенного спектрометра. Эти шаги повторяются для каждого шага в заданном диапазоне частот. Для последующего гиперполяризации, выбрать частоту СВЧ с амплитудой максимального измеренного сигнала.

8. Поляризация

  1. Для измерения поляризации наращивание, запустить программу RINMR, типа "HYPERSENSENMR" и нажмите кнопку "Select Config" и "Solid нарост".
  2. В поляризатор главном окне программы DNP-ЯМР, нажмите кнопку "Поляризация", чтобы начать процесс гиперполяризации.
  3. Выбрать оптимальную микроволновую частоту (полученную во время СВЧ развертки) и мощность (например, 100 мВт) для образца и нажмите кнопку "Далее".
  4. Включить "Поляризация нарост мониторинг" и нажмите кнопку "Готово".
  5. Поляризовать образец до> 95% (~ 60 мин в течение [1- 13 С] пируват).
    Примечание: Во время поляризации, микроволновые печи направляются в ВТИ и к образцу, в результате чего 13 C вращается для согласования с гиперполяризованным неспаренных электронных спинов. Для измерения гиперполяризации налипания, РЧ импульсы с углом флип (FA) 5 ° применяются периодически (например, каждые 300 лет), и результирующий сигнал на графике как нароста поляризационной кривой.

9. Растворение

  1. Когда поляризация достигает> 95%, инициировать процесс растворения, нажав кнопку "Растворение" в поляризатор главном окне программы DNP-ЯМР.
  2. Выберите процесс растворения из выпадающего меню и нажмите кнопку "Далее".
    ПРИМЕЧАНИЕ: поляризатор позволяет определить требуемый процесс растворения путем выбора сроков проведения чеканки газа.
  3. Нагрузка ~ 5 мл растворяющей агента через верхний клапан в нагретый сосуд в тон роспуск часть поляризатор. Вычислить точный объем агента растворения, необходимого, используя следующее уравнение:
    Уравнение 1
    где V DA является разыскиваемый объем растворения агента, м PA, м OX063 и м ГТР массы пирувата, OX063 и gadoterate меглумин, соответственно, добавляют к образцу исходного раствора.
  4. Поместите палку растворение в активном положении над впускным клапаном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет прибору для подключения его растворения приборов к чашке образца в ВТИ.
  5. Нажмите кнопку "Готово", чтобы начать процесс растворения.
    Примечание: Агент растворения под давлением до 3 бар с помощью газообразного гелия, и затем нагревают до температуры 200 ° С, что приводит к увеличению давления. Когда давление достигает 10 бар, игольчатый клапан закрывается, чтобы прекратить подачу жидкого гелия в ВТИ. Держатель образца поднимает чашкуиз жидкого гелия. Палка растворение опускают в ВТИ и подключен к кювету для образца. Условный агент растворения проталкивается давлением, которое возникает вследствие нагрева сосуда, содержащего буфер растворения и газообразный гелий, в результате растворения ручки к чашке, что вызывает быстрое растворение образца. Раствор затем выходит в колбу для сбора через пластиковую трубку. Роспуск палка с прикрепленным чашки затем поднимается из ВТИ.
  6. Переместить палку растворения с прикрепленной чашки в положение "чистки" и завершить процесс, нажав кнопку "Готово".

10. Обнаружение 13 C гиперполяризованным сигнала

  1. 13 C метаболический магнитно - резонансной спектроскопии в пробирке
    1. Смешайте 200 мкл 20-ммоль / л растворенного гиперполяризованного образца из коллекции колбу с 800 мкл раствора клеток.
      Примечание: В результате конечная концентрацияиз [1- 13 С] пируват 4 ммоль / л.
    2. Смешайте суспензии также с помощью микропипетки и передачи ~ 600 мкл в ЯМР-трубки 5 мм.
    3. Вставьте 5 мм ЯМР-трубку в 1-T ЯМР-спектрометра. В главном окне программного обеспечения, нажмите кнопку "Выполнить", чтобы начать измерение, применяя ряд ста 10 ° РЧ импульсов каждые 3 сек.
      Примечание: Измерьте время между первоначальным смешиванием гиперполяризованным образца с клетками и началом приобретения спектроскопического. Убедитесь, что процедура смешивания не превышает 30 с, чтобы свести к минимуму потери поляризации.
  2. 13 C метаболический магнитно - резонансная томография
    1. Чтобы построить контейнер для экспериментов в пробирке с использованием спектрометра MRI, возьмите 5-мл шприц и подключить его к катетеру (D = 1,2 мм) , который достаточно долго , чтобы достигнуть от спектрометра изоцентре к доступным Площадь спектрометр.
    2. Заполните контейнер в пробирке с гое клеточного раствора желаемой концентрации для эксперимента (например, 10 8) или с ферментативной раствором.
    3. Поместите контейнер в пробирке на изоцентру магнита МРТ. Поместите катушку приемника 13 C-настроенную радиочастотную на контейнере. Поместите концентрированный 13 С-меченого калибровочный образец (например, 10-моль / л 13 C-мочевина) поблизости.
    4. Вставьте "контейнер в пробирке" вблизи изоцентре сканера ЯМР.
    5. Выполнить стандартную 3-плоскости последовательность локализации сканера и отрегулировать положение контейнера в пробирке к изоцентре, по мере необходимости.
    6. Запуск T2-взвешенный "анатомическую" последовательность 1 H , закрывающую экстракорпорального локализацию контейнера в. Используйте следующие параметры: 2D спинового эха с осевой ориентацией, времени повторения (TR) = 2000 мс, эхо времени (TE) = 20 мсек, толщина среза = 1 мм, поле зрения , охватывающий контейнер в пробирке, и16 эхо-сигналы в возбуждении. Убедитесь в том, что поле Шиммирование делается на протонах во время этого шага.
    7. В анатомических изображений, выберите 5 смежных срезов, сосредоточенные на интересующей нас области. Назначают 13 C приобретение калибровки спектроскопического , охватывающую выбранные анатомических срезов. Используйте следующие параметры: последовательность калибровки 2D Блок-Siegert с осевой ориентацией 12 х 12 ориентированных на закодированы, TR = 1000 мс, ломтик толщина = 5 мм, поле зрения сопоставления анатомических изображений, количество сканирований (NS) = 64, пропускная способность = 5000 Гц, и FA = 90 °.
    8. Выберите последовательность калибровки спектроскопического 13 C (для получения дополнительной информации см Шульте и др. , 2011) 75 из библиотеки последовательности импульсов. Загрузить последовательность импульсов к сканеру с компьютера, нажав кнопку "Загрузить". Нажмите на кнопку "Spectra" предварительного сканирования для запуска спектроскопического PreScan. В амплитудный спектр сюжета, отрегулировать пик от 13 C калибровки фантома к центрог частоты сканера. Установите выигрыш приемника до максимума. Нажмите кнопку "Пуск" для запуска последовательности калибровки спектроскопического 13 C. Обратите внимание на усиление сообщили передачи и центрическую частоту.
    9. Установить приобретение 13 C химического сдвига изображения (CSI) , охватывающий выбранные анатомических срезов. Используйте следующие параметры: 2D эхо-планарной спектроскопического томография (EPSI) с осевой ориентацией 12 х 12 ориентированных на закодированы, TR = 400 мс, ломтик толщина = 5 мм, поле зрения соответствующих анатомических изображений, NS = 300, а пропускная способность = 5000 Гц ,
      Примечание: Образцы EPSI одной линии в к-пространстве многократно после того, как один ВЧ возбуждения для получения как пространственной и спектральной информации одновременно. Для получения более подробной информации о методах приобретения, смотрите статью Durst и др. 2015 76.
    10. Скачать последовательность C CSI 13 и запустить спектроскопические прескана. Отрегулируйте частоту сканера и передавать усиление, как указано в последовательности калибровкивывод.
    11. После того , как гиперполяризационная раствор осаждается в колбе сбора, составлять ~ 3 мл в шприц , а затем вводят его в катетер , соединенный с контейнером в пробирке. Начать сбор данных. После приобретения завершена, сохраните файл исходных данных для последующей реконструкции.

Реконструкция 11. Данные

  1. Применить один из двух описанных кинетических моделей для анализа полученных данных.
    1. В первом способе для описания кинетики ЛДГ, кинетическое значение (К), сравнить сумму лактат сигнала (М LAC) к сигналу всех гиперполяризованных молекул (М х) 21,77.
      Уравнение 2
    2. В другом методе, измерения лактата и пирувата сигналов с течением времени и приспосабливать их к кинетической модели 17,25,71. Для того, чтобы решить обменный курс обмена веществ, к PA → LAC и эффективныйскорость затухания сигнала лактата, г LAC, используйте следующие линейные дифференциальные уравнения с использованием обменного дифференциальной модели двухузельного, получая для лактата:

      Уравнение 3

Примечание: Эффективный лактат сигнал скорости распада г LAC зависит от лактата продольного времени релаксации (T 1, ЛАК), противоположная скорость метаболизма обмена из лактата в пируват K LAC → PA, приложенному FA и TR, и интенсивность сигнала пируват (М ПА) и лактат (М ЛАК), принимая во внимание снижение необратимой сигнала после каждого последовательного возбуждения:

Уравнение 4

Поэтому г LAC приводит к одному, неразделимой срок спада сигнала. Так как можно скорректировать тон флип угол и время повторения, и даже если есть поток LAC → PA, мы предполагаем , что обменный курс от лактата до пирувата (к LAC → ПА) не должны быть включены в расчет, на основании результатов Харрисон и др. 2012 78. Их результаты показывают , что к LAC → ПА не играет , как решающую роль , как можно было бы предположить. Этот режим позволяет время Т 1 релаксации лактата быть определена количественно. Эта модель не зависит от введения пирувата для измерения, которое, в случае экспериментов в пробирке, не имеет решающее значение , и им можно пренебречь. Это, тем не менее, играют важную роль для измерений 79 в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты "СВЧ развертки" показаны на рисунке 3. Это показывает , что оптимальная частота для СВЧ [1- 13 С] пируват образца на 94.156 ГГц для локального 3,35-T hyperpolarizer. Все следующие эксперименты гиперполяризации (п = 14) были выполнены с использованием этой микроволновой частоты с мощностью 100 мВт. Микроволновое облучение применялось в течение от 60 до 80 мин, что приводит к твердотельным гиперполяризации выше, чем 90%. Результаты представлены на рисунке 4. Гиперполяризационная [13 C] пируват смешивают с 5 × 10 6 (n = 2), 10 7 (N = 2), 2 × 10 7 (п = 1), 3 × 10 7 (n = 2), 4 × 10 7 (п = 1), 6 × 10 7 (п = 2), 8 × 10 7 (п = 2), и 10 8 (п = 1) клетки рака простаты линии РС3.

Полученные данные представлены на рисунке 5 Рисунок 6. Приобретенные данные со спектральным и временным разрешением, показаны на рисунке 5A-D и фиг.6а-D, только с временным разрешением для каждой молекулы , наблюдаемой (рис 5Е-Н и рис 6E-Н), и только с спектральным разрешением (рис 5I -L и рис 5i-L). Мы наблюдали три основных гиперполяризованным сигналов , представляющих [1- 13 С] пируват, [1- 13 С] пируват гидрат и [1- 13 C] лактат, с химическими сдвигами на 173 частей на миллион, 181 частей на миллион и 185 частей на миллион, примерно относительная к триметилсилил пропановой кислоты (ТСГУ) при рН 7,4 и температуре 20 ° C. Отношения сигнала между тремя метаболитов суммированы в таблице 1. Данные показывают четкую корреляцию между сигналом лактата и количества клеток , присутствующих в образце (рисунок 7). Тем не менее, результатыИз экспериментов с менее чем 2 × 10 7 клеток обнаруживают значительное отклонение, вероятно , связано с низким отношением сигнал-шум. Поэтому мы предлагаем использовать больше клеток, чем это для дальнейших экспериментов. Когда относительный сигнал лактат (кинетический значение) нормирована на число клеток (рис 8), это четко показывает , подобное поглощение и метаболизм в течение всех клеток. Тем не менее, существует тенденция к снижению производства лактата на клетку с увеличением числа клеток. Мы считаем, что одна из причин уменьшенный клеточной метаболической активности является очень высокая концентрация клеток в очень малом объеме, что приводит к увеличению вязкости образца. Результаты обмена дифференциальной модели двухузельного приведены в таблице 2 и показаны на рисунке 9. Данные следуют тенденции , аналогичную предыдущей модели: ростом к PA → LAC с увеличением числа клеток. Тем не менее, эта модель приводитs в неправдоподобные увеличения кинетики с количеством клеток. Когда скорость метаболизма обмена к ПА → LAC нормализуется к числу клеток, мы можем снова увидеть четкую тенденцию снижения K PA → LAC с увеличением числа клеток (рисунок 10).

На рисунке 11 показана возможность добавления пространственной локализации в эксперименте. Это показывает фантом впрыскивается с 80 ммоль / л гиперполяризованного [1- 13 С] пируват рядом с 10 моль / л 13 С-мочевины фантомным. Методика позволяет достижение спектра с временным и специального разрешения (рис 11а) или спада сигнала выбранных метаболита сигналов во времени (рис 11б). Спектры во временной области также можно суммировать , чтобы получить лучший сигнал-шум (рис 11C). Специальное разрешение позволяет выбор желаемой частотной области сое 13 C спектр принадлежащих к определенным метаболитов, таких как [1- 13 С] пируват (рис 11D), [1- 13 С] пируват гидрат (рис 11E), или ссылка 13 C-мочевина (рис 11F). Он может быть совмещались с 1 изобр. Последовательность импульсов используется (EPSI) позволяет приобретение изображения всего среза каждые 4,9 сек. Таким образом, этот метод может предоставить данные с пространственным, временным и спектральным разрешением для любого метаболита.

фигура 2
Рисунок 3: Результаты СВЧ - развертка с [1- 13 С] пируват на местном 3,35-T Hyperpolarizer. В результате измерений , определяющих оптимальную частоту СВЧ , чтобы максимально увеличить скорость гиперполяризации ядер 13 С в целевом соединении [1- 13 С] пируват. Микроволновое развертка имеет форму ЭПР поглощенияспектр. Форма и разделение пиков основаны на радикал используется (в данном случае, тритил радикал), а наибольшее влияние имеют твердый эффект и тепловое перемешивание. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 4: Твердотельный Поляризация раскачки [1- 13 С] пируват образца. В среднем п = 13 твердотельного поляризации наращиваниям с ошибкой, представленной на стандартное отклонение измеренного через каждые 300 сек до 4500 сек. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 5: Результаты 13C ЯМР - спектроскопии на число ячеек (5 х 10 6 до 3 х 10 7 клеток). Полученные данные нанесены со спектральным и временным разрешением (AD), построенная с временным разрешением только для [1- 13 С] пируват, [1- 13 С] пируват гидрата и [1- 13 C] лактат (EH), и график только с спектральным разрешением, подводя всех временных шагов (IL). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 6: Результаты 13C ЯМР - спектроскопии на число ячеек (4 х 10 7 до 1 × 10 8 клеток). Полученные данные, построенные со спектральным и временным разрешением ( 13 С] пируват, [1- 13 С] пируват гидрата, и [1- 13 C] лактат (EH), и наносили на график со спектральным разрешением только суммирования всех временных шагов (ИЛ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 7: Результаты Простой метаболитов Соотношение кинетическое моделирование. Данные представляют собой отношение [1- 13 C] лактат сигнала к сумме [1- 13 С] пируват, [1- 13 С] пируват гидрат, и [1- 13 C] лактат в сравнении с количеством клеток в эксперименты. Погрешность представляет собой стандартное отклонение. псдавать в аренду, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 8: Результаты простого метаболитов Соотношение кинетическое моделирование нормированы на количество клеток. Данные представляют собой отношение [1- 13 C] лактат сигнала к сумме [1- 13 С] пируват, [1- 13 С] пируват - гидрат, и [1- 13 C] лактат нормализованы к числу клеток по сравнению с количеством клеток в экспериментах. Погрешность представляет собой стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 9: Результаты двухузельного обмена дифференциальной модели. Магнезии данные ESENT метаболический обменный курс (к PA → LAC) в зависимости от количества клеток в экспериментах. Погрешность представляет собой стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 10: Результаты двухузельного обмена дифференциальной модели нормированы на количество клеток. Данные представляют собой метаболический обменный курс (K PA → LAC) нормированную к числу клеток в сравнении с количеством клеток в экспериментах. Погрешность представляет собой стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

лор "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> фигура 2
Рисунок 11: Результат магнитно - резонансной томографии гиперполяризованным [1- 13 С] пируват Probe. А) Спектр приобрел по всей ломтиком и всех временных шагов. Б) Распад [1- 13 С] пируват и [1- 13 С] пируват сигнал гидратов в течение долгого времени. Третий сигнал представляет собой C-мочевина ссылка локализации 10 М 13. C) Спектр получен от всего пространственным и временным разрешением. D) 1 H изображение накладывается с 13 С изображением суммированного [1- 13 С] пируват сигнала над всеми шагами по времени. E) 1 H изображение накладывается с 13 С изображением суммированного [1- 13 С] пируват гидрата сигнала по всем временных шагов. F) 1 H изображение накладывается с <SUP> 13С изображение суммированного сигнала 13 С-мочевины в течение всех временных шагов (опорный сигнал). 13 C-сигнал в CE нормирована на максимум сигнала специфического метаболита. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Номер мобильного
5 × 10 6 (п = 2) 10 7 (п = 2) 2 × 10 7 (п = 1) 3 × 10 7 (п = 2) 4 × 10 7 (п = 1) 6 × 10 7 (п = 2) 8 × 10 7 (п = 2) 10 8 (п = 1)
[1- 13 C]
пируват 		92,9 ± 1,4 91,7 ± 1,0 86,7 77,5 ± 2,7 76 69,7 ± 0,5 65,9 ± 3,7 42,9
[1- 13 C]
пируват гидрата 		6,8 ± 1,2 6,7 ± 1,6 9.5 10,1 ± 1,8 8.9 7,7 ± 1,5 10,4 ± 0,2 13.4
[1- 13 C]
лактат 		0,3 ± 0,3 1,6 ± 0,6 3,8 12,4 ± 4,5 15.1 22,5 ± 1,1 23,7 ± 3,5 43,7

Таблица 1: Относительное соотношение гиперполяризованного Метаболитов по отношению к различным количеством клеток.

Номер мобильного 5 × 10 6 (п = 2) 10 7 (п = 2) 2 × 10 7 (п = 1) 3 × 10 7 (п = 1) 4 × 10 7 (п = 1) 6 × 10 7 (п = 2) 8 × 10 7 (п = 2) 10 8 (п = 1) K PA → LAC [* 10 -4] 0,924 ± 0,870 4,984 ± 1,19 15,135 36,289 58,904 112,174 ± 10,491 114,3 ± 37,059 349,234

Таблица 2:Результаты двухузельного Обмен дифференциальной модели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

13 CMRSI с гиперполяризованных зондов является перспективным методом для контроля метаболизма в реальном времени в пробирке и в естественных условиях. Один очень важный аспект при использовании этого экспериментального процесса является надлежащей стандартизации, особенно в отношении в экспериментах пробирке. Во-первых, приготовление образца должно быть сделано правильно и последовательно для достижения той же концентрации гиперполяризованного материала в каждом эксперименте. Это требует точного взвешивания как образца, так, чтобы быть гиперполяризационная и буфер. Если концентрация не является правильным, конечный рН раствора не является точным, что может оказать влияние на T 1 и ответы клеток передаются . Это также имеет решающее значение для обработки клеток как можно более равномерно. Клетки всегда должны быть приготовлены таким образом, что существует минимальная задержка между урожаем клеток и последующего эксперимента с целью минимизации продолжительности времени клетки поддерживают при очень высокой концentration и низкий объем. Изменение в протоколе клеточного препарата, например в разное время приготовления или температуры, может привести к значительным изменениям в полученных данных. Смешение образца с клетками также должны быть стандартизированы. Важно, чтобы измерить время между добавлениями индикаторного к клеточной суспензии и началом измерения, так как это может варьироваться; в ходе анализа данных, это следует учитывать.

Правильный выбор анализа данных и кинетического моделирования имеет решающее значение в интерпретации полученных данных. Простая модель подходит для линейной односторонней реакции с постоянным курсом двух метаболитов. Как описано во введении, пируват подвергается несколько ферментативных реакций и, что более важно, он также подвергается неферментативного реакции обратимы обмена с пирувата гидрата. Эта реакция сыграла решающую роль в экспериментах, и его эффект хорошо демонстрирует Iп эксперимент с 8 × 10 7 клеток. Несмотря на то, Таблица 1 указывает на то, что относительная концентрация пирувата гидрат аналогична других экспериментах, когда близко исследован на рис 6D, она показывает гораздо более высокую пируват гидратов сигнала в начале эксперимента по сравнению с другими экспериментами. Однако, когда временное разрешение суммируется, эта важная информация теряется и вызывает ошибку в восстановлении данных. С другой стороны, обмен дифференциальная модель двухсайтовый является более надежным и точным описанием кинетики, так как она включает в себя временную разрешающую способность в расчете. Таким образом, она включает в себя неферментативного обмен с пирувата гидратов, даже если он быстро обменивается с пирувата во время измерения.

Существуют различные стратегии обработки изображений, чтобы выбрать между наблюдать гиперпол сигнал или отслеживать метаболизм гиперполяризованным молекулы в preclinicaл и клинические исследования. Durst и др. продемонстрировали преимущества и недостатки различных импульсов sequnces 76. Последовательность свободной индукции химического сдвига изображения (FIDCSI) является относительно устойчивым, но имеет ограниченное применение для мульти-ломтиком и временно разрешенных изображений. Эхо-планарная спектроскопического томография (EPSI) является устойчивым по вопросам градиентных и вне резонанса эффектов, но, он склонен к артефактам восстановлению. Итерационный разложение воды и жира с эхо- асимметричной и наименьших квадратов оценки (IDEAL) 81, спиральный химического сдвига изображения (ISPCSI), последовательность 35 импульсов и визуализации сдвига спираль химической (SPCSI) имеют высокую эффективность кодирования , но чувствительны к B 0 неоднородность. Выбор последовательности будет зависеть от характеристик сканера, то биологический вопрос, и исследуемой системы.

Есть много требований, которые должны быть выполнены для успешного гиперполяризации. Тем не менее, тздесь также несколько ограничений , что гиперполяризационная 13 метод CMRSI ныне сталкивается. Основной и неизменный ограничение времени T 1 релаксации ядра 13 С в молекуле, которая определяет количество обнаруживаемого сигнала доступных в определенное время измерения. Сигнал опускают каждым РЧ возбуждения, что приводит к потере сигнала гиперполяризации повторно во время сбора данных. Другим ограничением является относительно длительный период времени, который требуется, чтобы hyperpolarize молекулу. Это, как правило, занимает от 30 до 90 мин.

По сравнению с другими методами визуализации молекул, таких как [18 F] -FDG ПЭТ, гиперполяризационная 13 CMRSI не требует опухолей с повышенными гликолитических метаболических путей и , следовательно, увеличения потребления глюкозы. Методика показывает реальный метаболический поток в реальном масштабе времени. С другой стороны, [18 F] -FDG ПЭТ не дает прямую информацию ообмена веществ, но только косвенная информация о накоплении в метаболически активной области. Это может привести к ложноотрицательный результат, когда опухоль, кажется, метаболически неактивны, но на самом деле использует различные пути метаболизма, такие как glutaminolysis, в качестве источника углерода для пролиферации.

В заключение, растворение ДНФ может быть использован в различных приложениях для изучения неограниченного перечень заболеваний (таких , как сахарный диабет), 82 измерения рН 15,36,45, или контролировать метаболические изменения различных типов рака. Эти измерения могут быть выполнены на разных уровнях, от клеточных в экспериментах пробирке путем доклинических исследований с использованием животных моделей (например, мышей, крыс, кроликов, свиней и собак), в недавних клинических исследованиях человека 57. Будущие клинические приложения будут представлены очень мощный и неинвазивный диагностический инструмент, который может не только обнаружить и локализовать заболевание, но и позволяют наблюдать леченияреакция в режиме реального времени 83.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901 GE Healthcare/Agilent Technologies 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon Magritek 1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 7789-20-0
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic Sigma Aldrich 7558-80-7
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 1310-73-2
Disodium edetate Sigma Aldrich 6381-92-6
Pyruvic acid - 13C1 Cambridge Isotopes Laboratories CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L) Guerbet gadoterate meglumine  
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) GE Healthcare trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line ATCC CRL1435
F-12K medium  ATCC 30-2004
Fetal Bovine Serum ATCC SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1x ATCC 30-2101
Sample plastic cup Oxford Instruments
Trypan blue Bio-Rad 145-0013-MSDS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohren, E. M., Turkington, T. G., Coleman, R. E. Clinical applications of PET in oncology. Radiology. 231 (2), 305-332 (2004).
  2. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  3. Carver, T. R., Slichter, C. P. Polarization of Nuclear Spins in Metals. Phys. Rev. 92 (1), 212-213 (1953).
  4. Abragam, A., Proctor, W. G. Spin Temperature. Phys. Rev. 109 (5), 1441-1458 (1958).
  5. Abragam, a, Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Reports Prog. Phys. 41 (3), 395-467 (2001).
  6. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  7. Shimon, D., Hovav, Y., Feintuch, A., Goldfarb, D., Vega, S. Dynamic nuclear polarization in the solid state: a transition between the cross effect and the solid effect. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (16), 5729-5743 (2012).
  8. Serra, S. C., Rosso, A., Tedoldi, F. Electron and nuclear spin dynamics in the thermal mixing model of dynamic nuclear polarization. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (38), 13299-13308 (2012).
  9. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Brindle, K. M. Biomedical applications of hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55 (4), 285-295 (2009).
  10. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Chen, A., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Hyperpolarized 13C metabolic imaging using dissolution dynamic nuclear polarization. J. Magn. Reson. Imaging. 36 (6), 1314-1328 (2012).
  11. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  12. Golman, K., in't Zandt, R., Thaning, M. Real-time metabolic imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (30), 11270-11275 (2006).
  13. Comment, A., Rentsch, J., et al. Producing over 100 ml of highly concentrated hyperpolarized solution by means of dissolution DNP. J. Magn. Reson. 194 (1), 152-155 (2008).
  14. Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magn. Reson. Med. 66 (2), 505-519 (2011).
  15. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magn. Reson. Med. 60 (2), 253-257 (2008).
  16. Chen, A. P., Albers, M. J., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magn. Reson. Med. 58 (6), 1099-1106 (2007).
  17. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
  18. Schroeder, M. A., Swietach, P., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovasc. Res. 86 (1), 82-91 (2010).
  19. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Tropp, J., Pfefferbaum, A., Spielman, D. M., Mayer, D. Cerebral dynamics and metabolism of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate using time-resolved MR spectroscopic imaging. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (13), 1734-1741 (2010).
  20. Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Res. 66 (22), 10855-10860 (2006).
  21. Park, I., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C magnetic resonance metabolic imaging: application to brain tumors. Neuro. Oncol. 12 (2), 133-144 (2010).
  22. Albers, M. J., Bok, R., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Res. 68 (20), 8607-8615 (2008).
  23. Yen, Y. -F., Le Roux, P., et al. T(2) relaxation times of (13)C metabolites in a rat hepatocellular carcinoma model measured in vivo using (13)C-MRS of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 23 (4), 414-423 (2010).
  24. Dafni, H., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopic imaging informs on hypoxia-inducible factor-1 and myc activity downstream of platelet-derived growth factor receptor. Cancer Res. 70 (19), 7400-7410 (2010).
  25. Ward, C. S., Venkatesh, H. S., et al. Noninvasive detection of target modulation following phosphatidylinositol 3-kinase inhibition using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res. 70 (4), 1296-1305 (2010).
  26. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magn. Reson. Med. 65 (2), 557-563 (2011).
  27. Johannesson, H., Macholl, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Dynamic Nuclear Polarization of [1-13C]pyruvic acid at 4.6 tesla. J. Magn. Reson. 197 (2), 167-175 (2009).
  28. Durst, M., Koellisch, U., et al. Bolus tracking for improved metabolic imaging of hyperpolarised compounds. J. Magn. Reson. 243, 40-46 (2014).
  29. Khegai, O., Schulte, R. F., et al. Apparent rate constant mapping using hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 27 (10), 1256-1265 (2014).
  30. Sogaard, L. V., Schilling, F., Janich, M. A., Menzel, M. I., Ardenkjaer-Larsen, J. H. In vivo measurement of apparent diffusion coefficients of hyperpolarized (1)(3)C-labeled metabolites. NMR Biomed. 27 (5), 561-569 (2014).
  31. Aquaro, G. D., Frijia, F., et al. 3D CMR mapping of metabolism by hyperpolarized 13C-pyruvate in ischemia-reperfusion. JACC. Cardiovasc. Imaging. 6 (6), 743-744 (2013).
  32. Menzel, M. I., Farrell, E. V., et al. Multimodal assessment of in vivo metabolism with hyperpolarized [1-13C]MR spectroscopy and 18F-FDG PET imaging in hepatocellular carcinoma tumor-bearing rats. J. Nucl. Med. 54 (7), 1113-1119 (2013).
  33. Schilling, F., Duwel, S., et al. Diffusion of hyperpolarized (13) C-metabolites in tumor cell spheroids using real-time NMR spectroscopy. NMR Biomed. 26 (5), 557-568 (2013).
  34. Schulte, R. F., Sperl, J. I., et al. Saturation-recovery metabolic-exchange rate imaging with hyperpolarized [1-13C] pyruvate using spectral-spatial excitation. Magn. Reson. Med. 69 (5), 1209-1216 (2013).
  35. Wiesinger, F., Weidl, E., et al. IDEAL spiral CSI for dynamic metabolic MR imaging of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Magn. Reson. Med. 68 (1), 8-16 (2012).
  36. Wilson, D. M., Keshari, K. R., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. J. Magn. Reson. 205 (1), 141-147 (2010).
  37. Schroeder, M. A., Atherton, H. J., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  38. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., et al. Metabolic imaging in the anesthetized rat brain using hyperpolarized [1-13C] pyruvate and [1-13C] ethyl pyruvate. Magn. Reson. Med. 63 (5), 1137-1143 (2010).
  39. Chen, A. P., Kurhanewicz, J., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magn. Reson. Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
  40. Witney, T. H., Kettunen, M. I., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-(13)C]pyruvate and. Br. J. Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
  41. Bohndiek, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to a vascular disrupting agent using hyperpolarized (13)C magnetic resonance spectroscopy. Mol. Cancer Ther. 9 (12), 3278-3288 (2010).
  42. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (47), 19801-19806 (2009).
  43. Jensen, P. R., Peitersen, T., et al. Tissue-specific short chain fatty acid metabolism and slow metabolic recovery after ischemia from hyperpolarized NMR in vivo. J. Biol. Chem. 284 (52), 36077-36082 (2009).
  44. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
  45. Scholz, D. J., Janich, M. A., et al. Quantified pH imaging with hyperpolarized 13C-bicarbonate. Magn. Reson. Med. 73 (6), 2274-2282 (2015).
  46. Koellisch, U., Gringeri, C. V., et al. Metabolic imaging of hyperpolarized [1-(13) C]acetate and [1-(13) C]acetylcarnitine - investigation of the influence of dobutamine induced stress. Magn. Reson. Med. 74 (4), 1011-1018 (2015).
  47. Koellisch, U., Laustsen, C., et al. Investigation of metabolic changes in STZ-induced diabetic rats with hyperpolarized [1-13C]acetate. Physiol. Rep. 3 (8), (2015).
  48. Jensen, P. R., Meier, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Duus, J. O., Karlsson, M., Lerche, M. H. Detection of low-populated reaction intermediates with hyperpolarized NMR. Chem. Commun. (34), 5168-5170 (2009).
  49. Koelsch, B. L., Keshari, K. R., Peeters, T. H., Larson, P. E. Z., Wilson, D. M., Kurhanewicz, J. Diffusion MR of hyperpolarized 13C molecules in solution. Analyst. 138 (4), 1011-1014 (2013).
  50. Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10435-10439 (2003).
  51. von Morze, C., Larson, P. E. Z., et al. Imaging of Blood Flow Using Hyperpolarized [(13)C]Urea in Preclinical Cancer Models. J. Magn. Reson. Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
  52. Chiavazza, E., Kubala, E., et al. Earth's magnetic field enabled scalar coupling relaxation of 13C nuclei bound to fast-relaxing quadrupolar 14N in amide groups. J. Magn. Reson. 227, 35-38 (2013).
  53. Jensen, P. R., Karlsson, M., Meier, S., Duus, J., Lerche, M. H. Hyperpolarized amino acids for in vivo assays of transaminase activity. Chem. - A Eur. J. 15 (39), 10010-10012 (2009).
  54. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Detection of tumor glutamate metabolism in vivo using 13C magnetic resonance spectroscopy and hyperpolarized [1-13C]glutamate. Magn. Reson. Med. 66 (1), 18-23 (2011).
  55. Chaumeil, M. M., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized [1-13C] glutamate: a metabolic imaging biomarker of IDH1 mutational status in glioma. Cancer Res. 74 (16), 4247-4257 (2014).
  56. Keshari, K. R., Wilson, D. M. Chemistry and biochemistry of 13C hyperpolarized magnetic resonance using dynamic nuclear polarization. Chem. Soc. Rev. 43 (5), 1627-1659 (2014).
  57. Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Transl. Med. 5 (198), (2013).
  58. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  59. Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. {Ü}ber den Stoffwechsel von Tumoren im K{ö}rper. Klin. Wochenschr. 5 (19), 829-832 (1926).
  60. Barnes, A. B., De Paepe, G., et al. High-Field Dynamic Nuclear Polarization for Solid and Solution. Biological NMR. Appl. Magn. Reson. 34 (3-4), 237-263 (2008).
  61. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Gatter, K. C., Harris, A. L. Pyruvate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase expression in non small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia. 7 (1), 1-6 (2005).
  62. Golman, K., Petersson, J. S. Metabolic Imaging and Other Applications of Hyperpolarized 13C1. Acad. Radiol. 13 (8), 932-942 (2016).
  63. Golman, K., Petersson, J. S., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magn. Reson. Med. 59 (5), 1005-1013 (2008).
  64. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Jeffrey, F. M., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  65. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia NMR detection of hyperpolarized 13CO2 and H13CO3-. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  66. Hu, S., Chen, A. P., et al. In vivo carbon-13 dynamic MRS and MRSI of normal and fasted rat liver with hyperpolarized 13C-pyruvate. Mol. imaging Biol. MIB Off. Publ. Acad. Mol. Imaging. 11 (6), 399-407 (2009).
  67. Kohler, S. J., Yen, Y., et al. In vivo 13 carbon metabolic imaging at 3T with hyperpolarized 13C-1-pyruvate. Magn. Reson. Med. 58 (1), 65-69 (2007).
  68. Hu, S., Lustig, M., et al. 3D compressed sensing for highly accelerated hyperpolarized (13)C MRSI with in vivo applications to transgenic mouse models of cancer. Magn. Reson. Med. 63 (2), 312-321 (2010).
  69. Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
  70. Schroeder, M. A., Cochlin, L. E., Heather, L. C., Clarke, K., Radda, G. K., Tyler, D. J. In vivo assessment of pyruvate dehydrogenase flux in the heart using hyperpolarized carbon-13 magnetic resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (33), 12051-12056 (2008).
  71. Zierhut, M. L., Yen, Y. -F., et al. Kinetic modeling of hyperpolarized 13C1-pyruvate metabolism in normal rats and TRAMP mice. J. Magn. Reson. 202 (1), 85-92 (2010).
  72. Dennis, L. K., Resnick, M. I. Analysis of recent trends in prostate cancer incidence and mortality. Prostate. 42 (4), 247-252 (2000).
  73. Jambor, I., Borra, R., et al. Functional imaging of localized prostate cancer aggressiveness using 11C-acetate PET/CT and 1H-MR spectroscopy. J. Nucl. Med. 51 (11), 1676-1683 (2010).
  74. Presti, J. C. J., Hricak, H., Narayan, P. A., Shinohara, K., White, S., Carroll, P. R. Local staging of prostatic carcinoma: comparison of transrectal sonography and endorectal MR imaging. AJR. Am. J. Roentgenol. 166 (1), 103-108 (1996).
  75. Schulte, R. F., Sacolick, L., et al. Transmit gain calibration for nonproton MR using the Bloch-Siegert shift. NMR Biomed. 24 (9), 1068-1072 (2011).
  76. Durst, M., Koellisch, U., et al. Comparison of acquisition schemes for hyperpolarised (1)(3)C imaging. NMR Biomed. 28 (6), 715-725 (2015).
  77. Janich, M. A., Menzel, M. I., et al. Effects of pyruvate dose on in vivo metabolism and quantification of hyperpolarized (1)(3)C spectra. NMR Biomed. 25 (1), 142-151 (2012).
  78. Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13 C NMR. NMR Biomed. 25 (11), 1286-1294 (2012).
  79. Gómez Damián, P. A., Sperl, J. I., et al. Multisite Kinetic Modeling of (13)C Metabolic MR Using [1-(13)C]Pyruvate. Radiol. Res. Pract. 2014, (2014).
  80. Talbot, J. -N., Gutman, F., et al. PET/CT in patients with hepatocellular carcinoma using [(18)F]fluorocholine: preliminary comparison with [(18)F]FDG PET/CT. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 33 (11), 1285-1289 (2006).
  81. Reeder, S. B., Pineda, A. R., et al. Iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation (IDEAL): application with fast spin-echo imaging. Magn. Reson. Med. 54 (3), 636-644 (2005).
  82. Laustsen, C., Ostergaard, J. A., et al. Assessment of early diabetic renal changes with hyperpolarized [1-(13) C]pyruvate. Diabetes. Metab. Res. Rev. 29 (2), 125-129 (2013).
  83. Serrao, E. M., Brindle, K. M. Potential Clinical Roles for Metabolic Imaging with Hyperpolarized [1-(13)C]Pyruvate. Front. Oncol. 6, 59 (2016).

Tags

Cancer Research выпуск 118 гиперполяризации DNP, ЯМР магнитно-резонансная спектроскопия магнитно-резонансная томография МРТ, ЛДГ пируват лактат карциномы простаты
Гиперполяризованный<sup&gt; 13</sup&gt; C Метаболический магнитно-резонансная спектроскопия и обработка изображений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, … More

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, K. A., Topping, G., Hundshammer, C., Feuerecker, B., Gómez, P. A., Pariani, G., Schilling, F., Glaser, S. J., Schulte, R. F., Menzel, M. I., Schwaiger, M. Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54751, doi:10.3791/54751 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter