Summary
在人类血管内皮功能的非侵入性的评估可以通过血流介导的扩张的技术来确定。虽然千研究中使用了该技术，没有研究在大鼠进行这种技术非侵入。下面的文章介绍肱血流介导的扩张和大鼠股浅动脉无创测量。
Introduction
血管内皮是蜂窝单层该线条动脉的内腔并且是血管功能的重要调节剂。有从内皮释放众多分子导致血管直径的调制。在这些分子，一氧化氮（NO），似乎是在响应于刺激从血管内皮释放的主血管舒张分子（例如，胰岛素，乙酰胆碱，或剪切应力的变化）1。在血管内皮细胞，编号是由酶产生内皮NO合酶（eNOS）和随后从血管内皮细胞2释放。否扩散到血管平滑肌，其中它引起松弛和增加的血管直径3。
内皮功能障碍可以在利用血流介导的舒张（FMD）技术4,5-人类非侵入性进行评估。口蹄疫已经提出来表示一个功能生物测定内皮衍生在人类中NO的生物利用度，且通常评估在下列一〜5分钟肢闭塞6响应于反应性充血肱或股浅动脉。反应性充血增加了被转导至内皮细胞的7层的剪切力，信令NO 8的释放。虽然近年来，血管舒张由NO释放发起的比重一直争论不休9,10，口蹄疫表明内皮依赖性扩张，并一直被证明预测心血管事件11-13。
迄今为止，成千上万的研究已经使用的口蹄疫技术用于人类血管内皮功能的非侵入性测量。考虑到在重点转化研究近期的转变，对口蹄疫的啮齿类动物的非侵入性测量准则将是非常有价值的。与平移方法保持一致，该协议是建立在肱动脉和苏佩FMD的测量大鼠rficial股动脉，由于这些网站都是人类最常用的测量。在大鼠一个强大的和可重复的口蹄疫响应这个协议的结果，然而，在大鼠口蹄疫测量技术要求高，可能是困难的其他研究者没有视频演示复制。因此，下面的文章将演示口蹄疫肱和大鼠股浅动脉血管无创测量的方法。
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Protocol
所有动物的程序符合指南实验动物14的管理和使用以及犹他州大学和盐湖城的退伍军人医疗中心动物护理和使用获得批准。
1.动物的制备
- 将动物含100％氧气3％异氟醚麻醉诱导室。留在感应室中的动物，直到它响应外部刺激。
- 从感应腔室取出动物，并将其放置在配备有心电图（ECG）电极加热的检查表。维持在100％的氧气3％异氟醚麻醉。肱动脉和股浅动脉FMD不能同时进行。因此，对于每个测定准备指令在下面列出。
2.肱动脉准备
- 放置动物仰卧，抑制左上肢和一个各下肢进制与手术磁带的体检表。
- 抑制动物的右上肢，使上肢的下部略微升高的平台之上（〜0.2-0.5厘米）。
- 应用脱毛剂（如奈尔），以动物的右上肢去除毛发。
- 定位在右上肢远端的肘闭塞箍（10毫米管腔直径标准血管阻塞）。不休息平台上的封堵器，因为通胀/通缩将移动肢体，扰乱超声图像。
- 使用超声波键盘的超声波机器设置为B型。
- 应用超声凝胶的少量动物，近端闭塞箍的上肢。
- 手动对齐附着到立体支架与上肢的超高频线性阵列换能器。肱动脉应该是可见2-3毫米深。
- 以确认肱动脉，不肱静脉，正在成像，切换到使用超声波键盘PW-模式。动脉将脉动血流，而不是这将有连续血流相邻静脉。
3，股浅动脉准备
- 定位动物仰卧和抑制上肢和左下肢到检查台与手术胶带。
- 抑制动物的右下肢到升高位置（〜0.5-1厘米），使用垫（例如，折叠的纸巾）的平台之上。
- 应用脱毛剂（如奈尔），以动物的右下肢去除毛发。脱毛后股静脉应在上内大腿清晰可见。
- 位置的闭塞套（10毫米管腔直径标准血管封堵器）近端右脚踝。不休息平台上的封堵器，因为通胀/通缩将移动下肢，扰乱超声图像。
- 超声机器设置为B模式。
- 应用超声凝胶的少量动物，近端闭塞箍的下肢。
- 手动对齐附着到立体支架与股静脉，这是通过皮肤可见的超高频线性阵列换能器。股浅动脉应该是可见的<1毫米深。
- 以确认该股浅动脉，而不是股静脉，进行成像，切换至PW-模式。动脉将脉动血流，而不是这将有连续血流相邻静脉。
4.基线阶段
- 优化B模式图像，类似于如何将在人类15来完成。确保与在两壁可视内膜中层容器的水平，纵向图像观察。通过稍微调整超声探头位置，以确保尽可能多动脉尽可能优化图像是在拍摄窗口中查看。
- 可替代地，调整超声波的设置，通过改变亮度/对比度，聚焦区，频率，动态范围和线密度，以获得更好的图像。还有其他的方法来优化超声图像，但这些详细的说明超出了本协议的范围。
- 动脉影像优化后，打开心门控只显示R波期间捕获，以确保只有一个直径收集框架是一个心动周期的每个部分舒张时的图像。
注：心电图门控可在该协议由生理的设置选项下选择ECG门控使用的超声波机器上，但是，此功能可能无法适用于所有超声仪器。图像被优化后的ECG门控应当接通，因为它是难以在较低的帧速率，以获得的图像（即，每R波一次）。没有心电图门控，在大鼠高心脏速率和要求高的帧的组合率捕捉心动周期的舒张部仅允许〜10-20秒的剪辑。数据的每个剪辑繁琐的大小和数量大大增加分析负担。 - 记录使用B模式的基线数据的60秒。
注：超声机总是记录，然而，并非所有的图像被存储在超声机上，因为有上可记录在超声剪辑帧的数目的上限。剪取物长度（即帧数）可在设置调整。建议以每夹帧的最大数量设置。当记录在剪辑的结束（即帧的最大数量达到），录制继续，但剪辑向前滚动捕捉最新的帧。在这种情况下，被抓获的最大帧的限制之外较早帧随后被删除。虽然这些错综复杂在记录机之间不同，记录长度的调整可能是必要的。 - SWITCH为PW-模式。将光标放置在管腔的中间。样品闸门会自动在参照光标放置，但应可以调整为使用超声键盘宽度。保持≤60°的角度声波作用。
- 通过改变多普勒波束角度，调整角度声波作用。通过使用超声键盘进行细微调整的角度。如果这两个提供适合于测量的角度，手动通过倾斜动脉到一个更加最佳角度调整超声波探头。如果执行了超声角的任何调整，夺回B模式图像。
- 记录速度数据10秒钟。
5.遮挡阶段
- 膨胀用空气填充10毫升注射器血管阻塞。为了保持空气压力恒定在血管封堵器，折上本身的管放置一个长尾夹在折叠管。
- 切换到PW-模式确认袖口闭塞，就是明证大量减少血流速度。
- 切换到B模式和记录数据，60秒的短片，直到闭塞4:45分钟。
- 切换到PW-模式。保持心脏率的记录，并分析各超声剪辑的时间。
6.充血阶段
- 松开袖带通过从折叠管长尾夹PW-模式记录时间。录制5秒钟之前和袖口释放后5秒。
- 切换到B模式和记录数据，60秒的短片，直到闭塞后3分钟。保持心脏率的记录，并分析各超声剪辑的时间。
- 口蹄疫完成后请从体检表中的动物和监视，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。
7.分析
- 为了分析，出口超声如DICOM文件到装有边缘检测软件的脱机计算机，其允许无偏阻止动脉直径在每个帧的mination。分析是可能的超声机上，但是，它不推荐的，因为它是非常耗费时间和受研究者偏压。
- 期间基线和闭塞相分析60第二区段动脉直径数据，并在过程中充血性相10第二区段。
- 分析使用自动边缘检测软件的流量分析功能血液速度数据。通过在基线和闭塞阶段测量外观均匀的连续5个或多个波形确定平均血流速度。确定袖口释放后立即血流速度反应性充血时的平均血流速度。最高血流速度波形被认为是峰值血流速度。
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Representative Results
于8 Wistar大鼠的肱动脉和股浅动脉进行血流介导的扩张。的大鼠的定位，如图1所示。
股浅动脉的代表超声图像示于图2。
图1. 鼠和超声定位。
大鼠的定位臂丛（A）的测量和股浅（B）动脉FMD。超声探头和肱（C）的测量和股浅（D）动脉闭塞口蹄疫袖带定位。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 代表超声图像。
使用B模式成像测定直径（A）的股浅动脉超声图像。使用PW-模式来确定血流速度。该图所示是在基线（B）的血流速度，在接合阶段（C）的血液中的速度的降低，并且在充血相（D）的在袖带释放迅速增加血液速度。 请按此查看更大的版本这个数字。
正如图3所示，有肱和股浅动脉之间的类似血管舒张响应。当作为基线的百分比来表示，口蹄疫是动脉之间相似的，然而，当expresse-d作为自基线的绝对变化，口蹄疫是肱动脉（P <0.05）显著更高。这种差异可能是由于在肱动脉较大血管直径比在股浅动脉（498±28对397±11微米，P <0.05）。在人类16 FMD的测量，臂丛和股浅口蹄疫变异系数闭会期间类似分别为9±1和10±4％。尽管在血管大小的差异，当作为％或基线的绝对变化表示有肱动脉和股浅动脉FMD之间有很强的线性关系。
大鼠 图3. 血流介导的扩张。
肱动脉和以下5分钟内肢体缺血肤浅femoralartery的舒张百分数表示（A）和绝对（B）从基线变化。当为（C）基线的百分比表示口蹄疫是动脉之间相似。然而，当从基线（D）的绝对变化表示，口蹄疫是肱动脉显著更高。无论以百分数表示（E），或从基线的绝对（F）的变化，出现了口蹄疫肱动脉和股浅动脉之间牢固的关系。 * P <0.05，相对于肱动脉。值是平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
如表1中所示，基线，闭塞，和充血阶段期间测量心血管变量。利用心动周期的舒张部分期间内膜到内膜或媒体到媒体的距离测定动脉的直径。动脉直径测定60秒在基线和连续我N〜通过闭塞和充血阶段60秒间隔。利用在一个心动周期的血液中的管腔的平均动脉速度测定血流速度。血流量计算为每等式：血流量（μL/分钟）=（血液速度（微米/秒）·π·[血管直径（微米）/ 2] 2·60）。剪切速率是根据以下公式计算：剪切速率（秒-1）=血液速度·8 /血管直径。口蹄疫是根据公式计算：FMD =（峰值血管直径 - 基线血管直径）/基线血管直径。
| 肱动脉 | 股浅动脉 | |
| 基线阶段 | ||
| 心脏速率，BPM | 367±12 | 368±16 |
| 直径，微米 | 498±28 | 397±11 * |
| 血液流速，微米/秒 | 85±8 | 76±11 |
| 血流量，微升/分钟 | 1027±147 | 568±90 * |
| 剪切速率，S -1 | 1.4±0.1 | 1.5±0.2 |
| 闭塞阶段 | ||
| 心脏速率，BPM | 362±12 | 359±14 |
| 直径，微米 | 499±32 | 390±11 *† |
| 血液流速，微米/秒 | 63±9† | 38±8† |
| 血流量，微升/分钟 | 722±122† | 272±62 *† |
| 剪切速率，S -1 | 1.0±0.2† | 0.8±0.2† |
| 充血阶段 | ||
| 心脏速率，BPM | 363±12 | 357±12 |
| 山顶直径，微米 | 586±22†‡ | 457±15 *†‡ |
| 峰值血流速度，微米/秒 | 149±11†‡ | 205±12 *†‡ |
| 峰值血流量，微升/分钟 | 1778±229†‡ | 1495±127†‡ |
| 最高剪切速率，S -1 | 2.5±0.3†‡ | 3.7±0.2 *†‡ |
| * P <0.05，相对于肱动脉。 </ TD> | ||
| †P <0.05，相对于基线阶段。 | ||
| ‡P <0.05，相对于遮挡阶段。 | ||
| 值是平均值±SEM。 |
表1.通过协议的每一个阶段心血管变量。
有心脏中率无改变整个任一协议，以及与动脉测量（P> 0.05）。肱动脉的直径比股浅动脉（P <0.05）显著大。在接合阶段，存在相比，在这两个动脉基线（P <0.05）是血流速度，血液流动，以及剪切速率显著降低。继发布袖口，峰值血流速度，血流量，和剪切速率均高于在这两个动脉基线或闭塞阶段（P <0.05）显著高。在人类16反应性充血测量，臂丛和股浅动脉反应性充血变异系数闭会期间分别为类似24±9和19±5％，分别为。有在血流速度，血液流动，和动脉之间的剪切速率的差异，这在很大程度上是由于在动脉直径的差异。
正火峰值剪切速度后，血管舒张是肱动脉（ 图4）更高。这也是真正的口蹄疫表示为从基线的绝对变化。然而，尽管在幅度上的差异，但在百分之一强的线性关系和绝对口蹄疫归一化到峰值肱和股浅动脉之间的剪切速率。
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图4. 血流介导的扩张归到峰值大鼠剪切速率。
正火峰值剪切速度后，口蹄疫expressedas百分比（A）或从基线的绝对变化（B）为比较，股浅动脉中的肱动脉更高。
尽管在口蹄疫标准化峰值剪切速率动脉之间的差异，有肱动脉和股浅动脉之间有很强的关系时口蹄疫表示为一个百分比（C）或从基线的绝对变化（D）。 * P <0.05，相对于肱动脉。值是平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在本研究中，FMD的一种非侵入性测量表现在肱动脉和大鼠股浅动脉。类似于人类6，以下5分钟闭塞期内，在血流速度（即，反应性充血），从而在动脉壁上导致动脉的后续血管舒张增加的剪切速率迅速增加。口蹄疫是在肱动脉和股浅动脉两个观察。此外，还有在FMD动脉之间有很强的关系。虽然最高剪切速率在股浅动脉较高，口蹄疫归到最高剪切速率保持动脉之间牢固的关系。总之，这些结果表明，口蹄疫的非侵入性测量可在大鼠成功进行。
虽然口蹄疫测量在两个不同的动脉进行，当从基线变化百分比表示FMD的幅度是相似的。 HoweveR，当从基线的绝对变化表示，口蹄疫是肱动脉越高，作为动脉有一个较大的〜25％静止直径大于股浅动脉。这些结果是相似的人类研究，其中口蹄疫是在同一受试者17,18肱和股浅动脉测量。尽管动脉直径的差异，口蹄疫的关系，表现为从基线的百分比或绝对变化，是动脉之间极强。
血流介导的扩张已提出代表内皮源性人类6 NO生物利用度的官能生物测定，如通过来自内皮响应于增大的剪切速率1,3- NO释放发生血管扩张。因而，有较高的口蹄疫归峰值剪切速率表示已增加的灵敏度在剪切速率的给定增加的内皮细胞。口蹄疫正常化峰值剪切速率后，口蹄疫是在BRACH高胶质动脉，不管它是否被表达为百分比或从基线的绝对变化。尽管口蹄疫的幅度差异归峰值肱动脉和股浅动脉之间剪切速率，有百分比强线性关系，绝对口蹄疫归到峰值动脉之间剪切速率。
在本研究中，口蹄疫的非侵入性测量的肱和股浅动脉与袖口闭塞远端的超声波探头进行说明。被选定为几个原因这袖带放置，1）在人体中，这是最常用的方法，用于测量口蹄疫，2）NO的口蹄疫的贡献已经显示更大时动脉直径测量是近端闭塞部位9和3）有困难袖带充气后保持超声波图像时测量部位是远端闭塞。虽然这个过程表示口蹄疫的非侵入性测量，他人在使用超声波的测量远端髂总动脉的外科闭塞股动脉19闭塞住大鼠进行口蹄疫。口蹄疫响应使用最初由海斯等人描述的协议。被eNOS的的注射抑制剂抑制。事实上，这个过程已经被用来证明，细胞内无药理增加提高了口蹄疫两种模型大鼠血管内皮功能障碍与高血压20，以及暴露于二手烟会导致口蹄疫大鼠21,22减值。这些研究表明NO的贡献大鼠口蹄疫，建立口蹄疫的心血管健康的关系。然而，由于该技术是侵入性的，它可能会限制在相同的大鼠数周的纵向测量口蹄疫到几年的能力。用类似的方法在本研究中，两项最近的研究已在小鼠23,24的后肢进行口蹄疫的非侵入性测量，但也有研究（即测量时间当然和超声探头和闭塞袖口的位置）之间的几个技术变化。由于这些研究和在复制这些结果困难之间的差异，口蹄疫的大鼠非创伤测量尝试代替，如大鼠中的转化研究常用的，但具有较大的身体和血管大小比只小鼠。而在啮齿动物的股动脉口蹄疫测量一般不是新颖，没有研究在任何生活啮齿动物的肱动脉进行口蹄疫的测量。肢体之间在本研究口蹄疫的强关系可以说明内皮功能的系统性质，而且还提供了一种方法，以非侵入方式测量口蹄疫在于扰乱在后肢（例如，股静脉瘘）血流的动物。
优化和高品质的超声图像的维护，对于这个procedu所需的关键技能重新和需要大量的实践。例如，对于人类口蹄疫的测定中，有人建议，至少100监管扫描独立地5扫描之前进行。有时，图像可能袖口闭塞时移和要求超声探头的轻微调整。在这个协议中的一个关键步骤是在特定时间点B模式和PW-模式之间的切换。同时B模式和PW模式成像是不可能在这个协议中使用的超声波机器。因此，它需要超声模式之间快速切换在特定的时间段，以捕获速度和直径测量值。有一个写出来的协议和实践执行该协议将极大地提高超声模式之间切换的效率。该协议中考虑超记录的时间敏感性质，会出现错误，所以要准备记下任何协议异常，如忘记捕捉超声剪辑。在接合缺相的超声波剪辑不是关键的，但是，如果在记录期间的反应性充血相位丢失，建议至少30分钟已经过去了25之后再次执行该过程。
正如任何研究有向实验方案的局限性。在这项研究中，麻醉给药至100％的氧气下大鼠，因而，口蹄疫的测量也可能反映血管反应性高氧。麻醉的其他形式，例如戊巴比妥钠可以用来创建一个更具代表性的血气信息对人类和消除这种担忧。血压没有在这个协议中的任何点进行监控。虽然血压不响应于在人类中急性袖口闭塞改变，这是未知的，如果在血压任何瞬时变化将发生的影响。此外，采用压缩空气来填充血管阻塞器，但是，充水可能造成一个更稳固的闭塞血流作为水的它并不像空气作为可压缩的。最后，条件下口蹄疫非创伤测量，其中eNOS的抑制（即，L-NMMA输注）并没有被执行。因此，编号口蹄疫的贡献，因为它是在该协议执行的，目前尚未确定。
总之，这篇文章已经证明了口蹄疫肱和大鼠股浅动脉血管无创测量的协议。与在焦点转化研究的最近移相结合，口蹄疫的大鼠评估可用于人类翻译结果给大鼠提供一种有价值的工具，以及提供在大鼠纵向研究，以评估在几个时间点的血管内皮功能的能力接受不同的治疗方法。事实上，在口蹄疫的减少伴随着主动脉动脉僵硬以下在慢性肾功能衰竭（未发表结果）的大鼠模型中，这表明该应用的肾损害已经观察非侵入性的口蹄疫lication血管功能的纵向动物研究的标志物。未来的研究，调查老鼠是必要的口蹄疫机制，将提供进一步的深入了解无创测量FMD人类。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optional |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore surgical tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatory cream (e.g., Nair) | General supply | ||
| Cotton swabs | General supply | ||
| Ultrasound gel | General supply | ||
| Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml syringe with Luer-Lok tip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Paperclip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Hypodermic needle – 18 gauge | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Medium binder clip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus |
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