Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Summary

Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l'imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine ​​che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L'acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l'analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.

Abstract

Presentiamo uno strumento di analisi ad alto contenuto open source che utilizza l'imaging automatizzato del tempo di fluorescenza (FLIM) per analizzare le interazioni proteiche utilizzando letture basate sul trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) di cellule fisse o vive in piastre multipozzetto. Ciò fornisce un mezzo per lo screening dei processi di segnalazione cellulare letti utilizzando biosensori FRET intramolecolari o FRET intermolecolari di interazioni proteiche come l'oligomerizzazione o l'eterodimerizzazione, che possono essere utilizzate per identificare i partner di legame. Descriviamo qui la funzionalità di questa strumentazione FLIM automatizzata su piastra multipozzetto e presentiamo dati esemplari dai nostri studi sull'oligomerizzazione della proteina Gag dell'HIV e sull'andamento temporale di un biosensore FRET in cellule vive. Viene poi fornita una descrizione dettagliata dell'implementazione pratica con riferimento a un elenco di componenti hardware e una descrizione del software di acquisizione dati open source scritto in μManager. Viene inoltre presentata l'applicazione di FLIMfit, un client open source basato su MATLAB per la piattaforma OMERO, per analizzare array di dati FLIM su piastre multipozzetto. Vengono delineati i protocolli per l'imaging di cellule fisse e vive e viene presentata una dimostrazione di un esperimento FLIM automatizzato su piastra multipozzetto utilizzando cellule che esprimono costrutti FRET basati su proteine fluorescenti. A ciò si aggiunge una panoramica dell'analisi dei dati per questo specifico set di dati FLIM FRET.

Introduction

L'uso crescente di analisi del contenuto ad alta automatizzata (HCA) nella scoperta della droga ^{da 1} a librerie di composti di analisi è completata dalla tendenza in scienze della vita ricerca di base verso esperimenti di imaging automatizzati per studi sistematici, ad esempio, per gli schermi fenotipiche delle biblioteche siRNA. HCA automatica sta diventando sempre più importante per gli studi più piccoli della scala biologica che sono state attuate in genere con gli esperimenti manuali con decine di piatti di cellule imaged con microscopi convenzionali. La potenza statistica conferito dalla capacità di saggiare e analizzare centinaia di migliaia di campi di vista consente media del rumore sperimentale (tra cui "rumore biologico") e l'automazione di acquisizione e l'analisi di grandi array di esempio i dati delle immagini può aiutare a eliminare pregiudizi operatore e spesso può essere utilizzato per rilevare il verificarsi di errori sistematici, come un cambiamento nel profilo IRF durante un'acquisizione. saggi di fluorescenza a basesono ampiamente implementati in HCA, con il più commercialmente disponibili HCA strumentazione di acquisire immagini intensità di fluorescenza in uno o più canali spettrali per mappare la relativa distribuzione e co-localizzazione delle proteine ​​marcate. Più sofisticate modalità di imaging di fluorescenza, come l'imaging di fluorescenza vita (FLIM), l'imaging anisotropia polarizzazione e imaging di fluorescenza anisotropia tempo risolto, non sono ampiamente sfruttati in strumenti HCA commerciali, anche se essi offrono potenti letture quantitativi, ad esempio, di interazioni proteina. Qui vi presentiamo un approccio open source per implementare FLIM in un microscopio automatico per HCA.

Fluorescenza durata fornisce una lettura spettroscopico intrinsecamente raziometrico che può essere utilizzata per distinguere specie molecolari differenti o per sondare l'ambiente molecolare locale di un fluoroforo ed è insensibile alla concentrazione fluoroforo, alle efficienze di eccitazione / rilevazione, e all'impatto della scatteanello e il campione assorbimento ^2. Inoltre, poiché le misurazioni di fluorescenza durata possono essere realizzati in un unico canale spettrale, sono direttamente confrontabili tra i vari strumenti e campioni senza calibrazione. Essi possono essere applicati a fluorofori endogeni, tra cui alcuni metaboliti cellulari, lipidi e componenti della matrice extracellulare, per fornire letture intrinseche dei processi biologici e patologie. Così FLIM senza etichetta può mappare i cambiamenti metabolici nelle cellule ^3,4 ed è stato applicato per monitorare la differenziazione delle cellule staminali ^5,6 e la crescita di ponteggi di collagene ^7. Abbiamo recentemente dimostrato che FLIM HCA può essere utilizzato per i test senza etichetta automatizzati di metabolismo cellulare utilizzando autofluorescenza ^8. Più comunemente, tuttavia, le misurazioni di fluorescenza durata e FLIM sono applicati ai fluorofori esogeni che etichetta biomolecole specifiche, spesso implementate utilizzando coloranti che macchiano compartimenti cellulari, utilizzando coloranti accoppiato antibodies che bersaglio specifiche proteine ​​in cellule fisse, o utilizzando fluorofori geneticamente espresse accoppiati a proteine ​​specifiche. vita fluorescenza può essere utilizzato per fornire solide letture quantitativi di sonde fluorescenti rilevamento del loro ambiente fisico o chimico. Per esempi, coloranti sono stati dispiegati per rilevare la fase lipidica locale delle membrane cellulari ⁹ o viscosità cella ¹⁰ e biosensori a base di proteine fluorescenti geneticamente espressi sono stati sviluppati per segnalare concentrazioni di cellule di segnalazione molecole anche per quanto IP3 ^11, PIP2 ¹² e calpaina ¹³ o ioni come calcio ^14,15, potassio e cloruro ^{16 17.}

Molti di questi biosensori utilizzano trasferimento di energia per risonanza (FRET) ^18,19 per fornire letture dei cambiamenti nella conformazione biosensore. FRET tra il "donatore" e fluorofori "accettore" avviene tramite una interazione dipolo-dipolo diretta a corto raggioper cui fluorofori sono tipicamente separati da meno di ~ 10 nm. Così il rilevamento di FRET indica la vicinanza delle proteine opportunamente etichettati e quindi fornisce un mezzo per leggere le interazioni proteina-proteina ^20, come vincolante o oligomerizzazione - sia come punti finali in cellule fisse o eventi dinamici nelle misurazioni corso del tempo di vivere cellule. Etichettando un costrutto molecolare appropriata con donatore e accettore fluorofori, è anche possibile leggere variazioni conformazionali - o scissione - del costrutto tramite la variazione di FRET e questa è la base di molti biosensori ^21. Le misure di efficienza FRET in grado di fornire informazioni sulla distanza del donatore-accettore e la frazione popolazione di fluorofori donatori sottoposti FRET. Così, tecniche di imaging FRET-based può essere utilizzato per mappare e quantificare le interazioni molecolari nello spazio e nel tempo, ad esempio, per chiarire la segnalazione delle cellule elabora ^22. Automating queste tecniche di imaging in grado di fornire analisi high throughput in base a letture di vie di segnalazione o reti.

In HCA, la lettura FRET più comunemente adottata è spettrale di imaging raziometrico, dove sono mappati variazioni del rapporto di accettore all'intensità donatore. Mentre questo approccio è facilmente implementata - ed è disponibile in molti lettori di piastre multipozzetto disponibili commercialmente - misurazioni quantitative FRET spettralmente risolte richiedono la calibrazione della risposta spettrale del sistema ^23. Questo include spettrale diafonia derivante dalla spettrale spurgo attraverso e l'eccitazione diretta del accettore nonché le caratteristiche di trasmissione dello strumento e il campione (effetto filtro interno). In linea di principio, questo comporta la misurazione di ulteriori campioni di "controllo" che sono etichettati sia con donatore solo o accettore-only.

Da tali misurazioni FRET raziometrico spettrali, un FRET efficaceefficienza (il prodotto della efficienza FRET effettiva e frazione di FRETing molecole donatore / accettore) può essere ottenuta, insieme alla proporzione relativa di donatore e accettore molecole ^24. Spettrale FRET raziometrico è spesso usato con biosensori unimolecolare tasto, dove la stechiometria donatore / accettore può supporre di essere conosciuto. Per determinare le frazioni di popolazione del donatore FRETing e accettore, ad esempio, per ottenere una curva di risposta alla dose, è necessario conoscere l'effettiva efficacia FRET. Questo può essere ottenuto misurando un campione di controllo positivo FRET con proprietà note o utilizzando un altro metodo per misurare l'efficienza FRET, come photobleaching accettore o FLIM.

Utilizzando letture di fluorescenza a vita, FRET può essere rilevato e quantificato le misure di emissione del donatore solo - eliminando la necessità di calibrazione spettrale e altri campioni di controllo. Così, letture FLIM FRET possono essere confrontati tra gli strumentie tra i diversi campioni - che consentono i dati da endoscopia o la tomografia di modelli di malattia in tempo reale ²⁵ per essere confrontata misure di saggi cellulari. Montando i profili di decadimento dei donatori di fluorescenza a un modello di decadimento multi-esponenziale appropriata corrispondente alla FRETing e le popolazioni di donatori non FRETing, FRET efficienza e frazioni popolazione può, in linea di principio, essere ottenute direttamente senza ulteriori misurazioni. Questi vantaggi significativi, tuttavia, porta a costo di FLIM da fotoni più identificati per pixel di immagini intensità spettralmente risolta - tipicamente centinaia di fotoni sono necessari per ottenere una precisione nella determinazione vita del 10% quando montato su un unico modello di decadimento esponenziale e quando raccordo profili di fluorescenza di decadimento a modelli complessi (multiesponenziali decadimento), il numero di fotoni rilevati aumenta a migliaia necessari. Questo è convenzionalmente portato a lunghi tempi di acquisizione (decine a centinaia di secondi per campo di view) per FLIM, in particolare quando si utilizza il tempo correlato conteggio di singolo fotone (TCSPC) realizzato con l'acquisizione di pixel sequenziale in microscopi a scansione laser. I tentativi di aumentare la velocità di esposizione utilizzando intensità di eccitazione più alti può portare a photobleaching significativi e / o fototossicità. Insieme ad una mancanza di adeguati strumenti di strumentazione e software disponibili in commercio, questo ha impedito FLIM da essere utilizzato in HCA per la scoperta o sistemi di droga biologia, dove centinaia di migliaia di campi di vista sono da acquisire. La scansione laser TCSPC FLIM è stato implementato in un microscopio piastra di pozzetti automatizzato ²⁶ per le misure secondarie in seguito all'identificazione di "hits" di stato stazionario polarizzazione risolto imaging di fluorescenza anisotropia ^27, che può raggiungere velocità di imaging simili a spettrali immagini raziometrico ²⁸ con il quale condivide molti vantaggi e svantaggi. imaging di fluorescenza anisotropia sfrutta la diminuzionein anisotropia di fluorescenza del accettore in presenza di FRET ed è anche sensibile alla spettrale cross-talk (ad esempio, l'eccitazione diretta della accettore). Richiede calibrazione per tenere conto di polarizzazione diafonia e non fornisce una misura diretta della efficienza FRET.

Per realizzare i vantaggi dei FLIM per HCA, abbiamo lavorato per risolvere i problemi di velocità di acquisizione delle immagini e un accesso più ampio alla tecnologia. Qui, forniamo un elenco completo dei componenti software e hardware sorgente aperti che possono essere utilizzati per implementare il lettore che è descritto qui di seguito, insieme a base-test esemplare FRET automatizzato rapido FLIM pozzetti piatto. Nel nostro approccio ^29, FLIM è realizzato utilizzando grande campo dell'imaging tempo-dipendenti utilizzando una gated immagine ottica intensificatore (GOI), che è illustrata in figura 1 che può fornire tassi di imaging più veloci e inferiore fotoscolorimento rispetto a singolo fascio di scansione TCSPC causa della interr pixel paralleleogation. Il nostro strumento openFLIM-HCA può fornire FLIM senza supervisione, che richiede solo pochi secondi per acquisire dati FLIM rilevamento pochi 100 fotoni per pixel (a seconda della luminosità del campione). Combinato con il tempo necessario per spostare il campione dal campo precedente di vista, per regolare le impostazioni di acquisizione e di mantenere il campione a fuoco, questo provoca tipicamente tempi di acquisizione piastra multipozzetto di ~ 10 s per campo visivo ^25,28. Sezionamento ottico può essere implementato usando un quasi-largo campo Nipkow ( "disco rotante") dello scanner ^30.

Per l'analisi dei dati FLIM, abbiamo sviluppato uno strumento software open source chiamato FLIMfit ³¹ che è in grado di analizzare rapidamente pozzetti insiemi di dati piastra FLIM su postazioni PC convenzionali ed è un plug-in per OMERO ^32. FLIMfit offre funzionalità di analisi a livello globale (riportate nella Sezione 1.2) che permettono i dati FLIM ad essere montati sui modelli complessi con oolo pochi 100 fotoni per pixel sotto l'ipotesi che i componenti di fluorescenza durata sono invarianti attraverso un'immagine o regione di interesse (ROI), riducendo così il numero di fotoni rilevati richiesto, l'esposizione alla luce per il tempo di campionamento e acquisizione dell'immagine. FLIMfit esecuzione su un PC desktop standard, richiede solo 10 secondi di secondi di tempo di calcolo per analizzare insiemi di dati che comprende centinaia di FOV. Così sia l'acquisizione dei dati e l'analisi FLIM possono essere intraprese in tempi che sono pratici per HCA.

hardware openFLIM-HCA

La nostra implementazione di FLIM HCA è composto da sei componenti chiave: (i) un telaio microscopio a fluorescenza con autofocus ottica; (Ii) un motorizzato (xyz) palco microscopio; (Iii) una sorgente laser di eccitazione; (Iv) un sistema FLIM tempo-dipendenti in tutto il campo con intensificatore gated ottica (GOI), generatore di ritardo e la macchina fotografica; (V) un computer per l'acquisizione e analisi dei dati e (vi) uno scanner disco NipkowUnità per l'imaging ottico sezionato per sopprimere dalla luce fuoco. Questo può essere importante quando l'imaging segnali deboli, per esempio, da biosensori FRET alla membrana plasmatica delle cellule, che potrebbero essere sommersi da contributi di fluorescenza citoplasmatica o di sfondo da coprioggetto o terreno di coltura. dati FLIM tempo-dipendenti è acquisita da illuminare il campione con il ultracorti impulsi di radiazione di eccitazione, l'imaging l'emissione di fluorescenza a fotocatodo del GOI e l'acquisizione di una serie di immagini CCD del fosforo del governo indiano per una serie di impostazioni di ritardo di cancello intensificatore ottica dopo l'arrivo degli impulsi di eccitazione. Poiché il ritardo di porta tempo dopo eccitazione viene aumentata, il segnale di fluorescenza è visto a diminuire e la serie di immagini di fluorescenza time-gated acquisite sul CCD formano il set di dati richiesta per analizzare i profili decadimento di tutti i fluorofori nel campo visivo . Il gating del GOI è sincronizzato con gli impulsi di eccitazionee, per la serie di acquisizioni CCD, il ritardo del cancello tempo relativo agli impulsi di eccitazione è impostata una serie di valori crescenti nel range desiderato. Questa sincronizzazione si ottiene utilizzando il generatore di ritardo che comprende una "scatola veloce ritardo" (che fornisce ritardi fino a 20 ns in passi di 1 PS) e una "scatola ritardo grossolano" che fornisce i ritardi con un passo minimo di 25 ps.

Per FLIM, l'eccitazione può essere fornita da un laser ultraveloce. Per comodità, si impiegano tipicamente una sorgente supercontinuo fibra-laser-pompato che fornisce impulsi di picosecondi sintonizzabile tutto lo spettro visibile da cui la radiazione di eccitazione appropriato può essere selezionato per ogni fluoroforo utilizzando una ruota portafiltri motorizzata con diversi filtri passa banda. Tipicamente, si usa una potenza media di ~ 100-200? W al campione con impulsi a frequenza di ripetizione 40 o 60 MHz. Tali poteri di eccitazione potrebbero anche essere forniti da sorgenti laser ultraveloci in base raddoppio della frequenza dimode-locked titanio drogato laser zaffiro. Si noti che una durata dell'impulso di eccitazione sotto ~ 100 ps è sufficiente per la maggior parte degli esperimenti. Una seconda ruota portafiltri motorizzata dotata di filtri a densità neutra viene utilizzata per regolare l'intensità di eccitazione. Per la sicurezza e la convenienza, la radiazione di eccitazione può essere consegnato tramite una fibra ottica monomodale. Le configurazioni per largo campo FLIM e FLIM otticamente sezionato sono rappresentati nelle figure 2 e 3, rispettivamente. Per maggiori dettagli dei componenti di precisione utilizzati, si prega di visitare il wiki openFLIM-HCA ^33. Una copia dell'elenco delle parti corrente è dato nel materiale supplementare.

Per grande campo FLIM, la radiazione di eccitazione è necessaria per illuminare l'intero campo di vista più uniforme possibile. Per questo abbiamo diretto il fascio laser di eccitazione ad un diffusore olografico "top-hat" che è ruotato a 10-50 Hz al tempo medio speckle laser, con il piano del diffusore viene esposta al piano focale posteriore della lente del microscopio obiettivo. L'immagine di fluorescenza dalla porta di uscita del microscopio viene trasmessa sul fotocatodo del GOI e il fosforo del GOI (area attiva diagonale 18 mm) viene ripreso sul sensore di un CCD scientifica raffreddata (chip di dimensioni 10,2 millimetri x 8.3 mm) telecamera con un paio di lenti della fotocamera forniscono un ingrandimento di 0,7. Il sistema è controllato da un PC standard che è interfacciato alla strumentazione utilizzando protocolli RS232. Inoltre, un microprocessore Arduino è utilizzato per controllare un otturatore nel percorso ottico di eccitazione che viene chiuso tranne quando la telecamera CCD sta acquisendo dati FLIM e per registrare il segnale da un fotodiodo che viene utilizzato per misurare la potenza media dal supercontinuo spettralmente filtrato sorgente di eccitazione. Per FLIM otticamente sezionata, la radiazione laser di eccitazione è accoppiata in una fibra ottica monomodale a mantenimento di polarizzazione che collega direttamente l'unità scanner disco Nipkow, come shown in figura 3. L'immagine di output di fluorescenza dalla unità scanner Nipkow viene trasmessa sul fotocatodo del GOI e il resto del sistema è lo stesso che per tutto il campo FLIM.

software openFLIM-HCA

Il software di acquisizione dei dati è scritto in μManager ^34. Fornisce funzionalità di acquisizione dati completa HCA compresa la possibilità di cambiare la sequenza in cui vengono esposte le pozzetti della piastra, di acquisire corsi a tempo per qualsiasi FOV, per mantenere automaticamente messa a fuoco durante le misurazioni e di controllare le ruote di eccitazione e di filtro delle emissioni e il cambia dicroico per l'imaging multicolore automatizzato. È anche possibile eseguire un'acquisizione "scansione preliminare" di intensità di fluorescenza per identificare automaticamente e registrare le posizioni del FOV adeguato successiva acquisizione FLIM a seconda, ad esempio, sulla base di intensità. dati HCA FLIM possono essere salvati come una seriedi file TIFF, come una serie di file OME-TIFF (ad esempio, uno per FOV) o come un singolo file OME-TIFF che incorpora tutti i dati da una piastra di pozzetti. Maggiori informazioni e una descrizione dettagliata del software μManager possono essere trovati sul openFLIM-HCA wiki ^33.

Il software di analisi dei dati, FLIMfit ^31, un client open source MATLAB-based per la piattaforma di gestione dei dati di immagine OMERO ^32, è in grado di leggere i dati da un server FLIM OMERO o dal disco del computer, come indicato in figura 4. E 'stato progettato per analizzare i dati provenienti da TCSPC o strumenti FLIM tempo-dipendenti in tutto il campo e fornisce molte funzionalità per adattarsi dati da openFLIM-HCA compreso il montaggio di monoesponenziale profili di decadimento, e di raddoppiare i profili di decadimento complessità esponenziale e superiore, compresi modelli come profili di fluorescenza di decadimento polarizzazione risolto. Si può anche tener conto dei segnali di fondo fissi e variabili nel tempo e può utiLize una funzione misurato spazio-temporale risposta dello strumento (IRF) o può andare bene con un IRF idealizzato che può essere in differita su base pixel-saggio di un importo fissato dalla misura piena sperimentale IRF. A differenza di tempo globale (t ₀₎ tra la IRF ed un campione fluorescente può essere determinata da una misura di uno standard di fluorescenza. variazioni spaziali a segnali di fondo e IRF possono anche essere presi in considerazione. FLIMfit è in grado di adattare i dati FLIM su una base pixel-saggio o l'utilizzo di "binning globale" o "raccordo globale" per facilitare il montaggio dei dati FLIM con modeste (centinaia) fotone numeri ai modelli di decadimento complessi.

Binning globale comporta aggregando tutti i fotoni rilevati dai pixel all'interno di un ROI definito dall'utente in ogni punto di tempo per fornire i numeri di fotoni sufficienti per consentire il montaggio di modelli di decadimento complessi. Il ROI può essere l'intero campo visivo (FOV), può essere manualmente defined dall'utente, oppure può essere determinato tramite gli strumenti di segmentazione. Il ROI può anche essere definita utilizzando maschere importati in FLIMfit da altri software di segmentazione delle immagini. Per le applicazioni FRET, è comune l'uso di binning globale per adattarsi a un modello di doppio esponenziale di decadimento per determinare i componenti di fluorescenza di durata corrispondente al FRETing e fluorofori donatori non FRETing che si presume essere spazialmente invarianti attraverso il ROI e poi a rimontare su un elaborando pixel saggio con queste valli componenti vita fisse per ottenere la frazione popolazione FRETing donatori in ciascun pixel.

Raccordo globale comporta contemporaneamente montaggio dei componenti a vita e frazioni di popolazione FRETing donatore pixel-saggio in un intero FOV- o attraverso un insieme di dati FLIM che potrebbe comprendere più FOV, per esempio, da un esperimento piatto pozzetti o una serie temporale di immagini di fluorescenza di vita. raccordo Global è in grado di sfruttare la Variati spazialesu di frazioni di popolazione in tutta l'immagine che si perde nell'approccio binning globale per fornire vincoli più forti sulla stima durata dei componenti - e risultati quindi più affidabili - anche se a costo di molto di più di calcolo ^35. FLIMfit possono analizzare rapidamente pozzetti insiemi di dati piastra FLIM con attacco globale sulla workstation PC convenzionali con, per esempio, un set multipozzetto tempo-dipendenti dei dati FLIM, acquisiti con cinque porte di tempo per ciascuno dei 394 FOV ciascuno composto da 672 x 512 pixel, che richiede solo 32 secondi e 2 GB di memoria per adattarsi ad un doppio esponenziale modello di decadimento ^31. Ciò è stato ottenuto utilizzando un non lineare separabile almeno algoritmo squadretta implementato utilizzando algoritmi paralleli multithread per consentire scalabilità efficace su processori multicore e al codice FLIMfit è stato ottimizzato per ridurre al minimo l'utilizzo della memoria. La Figura 5 mostra una fotografia della interfaccia utente grafica di FLIMfite maggiori dettagli possono essere trovati nella pagina web indicata in riferimento 36. Ulteriori informazioni sul raccordo globale e binning globale può essere trovato in riferimento 31.

Il seguente protocollo per HCA FLIM con la nostra strumentazione openFLIM-HCA e software può essere adattato per una vasta gamma di esperimenti di imaging cellulare con letture FLIM. In generale, piastra di pozzetti FRET esperimenti dovrebbero essere progettati per includere pozzi repliche di controlli biologici positivi e negativi, oltre alle condizioni in fase di studio. Qui, descriviamo l'implementazione specifica per eseguire FLIM otticamente in sezione (vedi figura 3) di cellule Cos esprimono FRET costruisce costituito dalla proteina fluorescente mTurquoise e proteina fluorescente Venere uniti da una breve linker peptide. Qui il mTq32V, mTq17V e mTq5V FRET costrutti (discusse nella sezione Risultati rappresentativi) fornire a basso, medio e alto efficienza FRET insieme con la non-FRETing mTq5A costrutto.Questi costrutti e gli altri materiali necessari per seguire questo protocollo sono elencati nella Lista dei materiali.

Protocol

1. Preparazione dei pozzetti Piastra Array

1. Preparare una soluzione di 75 mM cumarina 6 in etanolo (t ~ 2,43 ns) per misure di riferimento per consentire la determinazione di t _0.
2. Seed 150.000 cellule Cos in quattro pozzetti di una piastra ben 6 e permettono di collegare durante la notte in un terreno di coltura (vedi Lista dei materiali).
3. Trasfezione un bene ciascuno con mTq5A, mTq5V, mTq17V e mTq32V utilizzando un reagente di trasfezione commerciale in base alle istruzioni del produttore e la cultura per 24 h.
4. Staccare cellule utilizzando una soluzione di tripsina / EDTA commerciale secondo il protocollo del produttore.
5. cellule pipette 5.000 Cos sospesi in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) esprimenti mTq5A in ciascuno dei pozzetti A1-G3 di spessore 96 piastra multipozzetto # 1.5 fondo di vetro che è stato precedentemente trattato con poli-L-lisina. Ripetere l'operazione per mTq5V cellule che esprimono in pozzi A4-G6, mTq17V in pozzi A5-G9 e mTq32V in pozzi A10-G12.
6. Lascia ben H1 vuoto (per fornire la misura di qualsiasi sfondo statico dal piatto pozzetti).
7. Pipettare 200 ml di HBSS solo in ben H2 (per fornire la misurazione di un segnale di fondo dal mezzo di coltura cellulare).
8. Pipetta 5.000 cellule non transfettate in HBSS in ben H3 (per fornire la misura di qualsiasi segnale di fondo da autofluorescenza cellulare).
9. Pipettare 200 ml di 75 mM soluzione colorante cumarina nella ben H4 (per fornire un controllo su qualsiasi variante di t ₀ durante l'acquisizione piastra di pozzetti, ad esempio, a causa di cambiamenti di temperatura ambiente o alle fluttuazioni dei circuiti di laser o di temporizzazione.

2. openFLIM-HCA acquisizione dati

NOTA: Informazioni dettagliate sono trovate sul openFLIM-HCA wiki ^33.

1. Avviare μManager e il plugin OpenFLIM-HCA
2. Selezionare il file di calibrazione per la specifica combinazione di gruppo generatore di ritardo efrequenza di ripetizione del laser sotto "controllo FLIM: Ritardo file di calibrazione scatola: Calibration Files".
3. Impostare la cartella in cui i dati verranno salvati in "File: Set Cartella Base".
4. Controllare il percorso del fascio di eccitazione per garantire che l'accoppiamento nella fibra ottica consegna è stabile e che l'efficienza di accoppiamento è massimizzato potenza trasmessa attraverso la fibra consegna usando un misuratore di potenza misura. Fluttuazioni inferiori al 5% sono accettabili.
5. Controllare che il governo indiano scatenante è stabile, visualizzando il segnale di uscita del monitor dal GOI su un oscilloscopio innescata dal segnale di trigger di ingresso GOI.
6. Controllare l'imaging del fosforo GOI sul sensore CCD coprendo il fotocatodo del GOI, impostando il suo guadagno a 750 V e messa a fuoco una delle lenti a relè in modo tale che le immagini di sparse singoli eventi di fotoni (a causa di luce di fondo che perde però il coperchio GOI ) registrato sul CCD sono nitide come possibile.
7. Controllare che il campionecampo di vista è uniformemente illuminata da imaging di un campione fluorescente uniforme, come una goccia della soluzione di colorante di riferimento su un vetrino, con una potenza di eccitazione sufficientemente bassa (<1? W) per assicurare che il GOI non è saturo.
8. Selezionare il file di definizione piatto del caso, vale a dire, selezionare l'opzione per piastre a 96 pozzetti ( "file: le proprietà di carico su piastra").
9. Utilizzando l'interfaccia grafica μManager, assicurarsi che non vi è alcuna dicroica cubo fascio splitter nella stativo selezionando una posizione vuota.
10. selezionare manualmente una larghezza di porta di 4 ns al governo indiano per l'intero esperimento.
11. Acquisire IRF dati di immagine:
    1. Utilizzando l'interfaccia grafica μManager, assicurarsi che non vi è alcun obiettivo microscopio nel percorso del fascio selezionando una posizione vuota. inserire manualmente un blocco trave anodizzato nero sopra la torretta obiettivo di impedire qualsiasi fuga di luce laser e l'angolo di minimizzare qualsiasi riflessione di nuovo nel telaio microscopio.
    2. Utilizzo della GUI μManager, impostare i filtri in CSUX (eccitazione, dicroico, Emission) tale che la frazione di luce di eccitazione dispersa dal disco Nipkow filatura può essere ripreso, ma garantire l'intensità non è sufficiente a saturare il sistema per un 200 ms CCD tempo di integrazione. Questo per evitare di esporre il fotocatodo governo indiano per troppa luce, che potrebbe danneggiare il fotocatodo.
    3. Utilizzare la funzione Find MaxPoint su tutta la gamma dei ritardi coperti dalla casella ritardo veloce programmabile. Controllare lo schema di uscita visualizzato e quindi regolare la casella ritardo corso manuale premendo il pulsante avanti in modo che il profilo completo IRF sia all'interno del campo di scansione della scatola ritardo veloce.
    4. Regolare i parametri di acquisizione (densità neutra, tempo di esposizione, l'accumulo di Frame) in modo che il CCD non è saturo in più brillanti tempo-gate e il tempo di integrazione efficace è> 200 ms.
    5. Impostare passi ritardo di 25 ps oltre la piena ritardo squillatoe ( "Controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: Popolare ritardi").
    6. Acquisire immagine IRF premendo il tasto "Snap immagine FLIM".
    7. Acquisire un'immagine di sfondo bloccando il laser ( "controllo del percorso della luce: densità neutra: bloccato"), riducendo il numero di ritardi ( "controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: impostazione del ritardo corrente (PS)"), lasciare tutte le altre proprietà inalterato e premere il tasto "Snap immagine FLIM".
12. Acquisire dati tintura di riferimento:
    1. Selezionare ben H4 utilizzando il μManager GUI ( "controllo XYZ: Vai bene: H4").
    2. Utilizzando la μManager GUI, selezionare i filtri (eccitazione 434/17 nm, Dichroic, Emissione 482/25 nm) per l'imaging mTqFP.
    3. Utilizzare la funzione Find MaxPoint su tutta la gamma completa di scatola ritardo veloce e quindi regolare la scatola ritardo grossolano in modo che il profilo completo decadimento è all'interno della gamma ritardo della scatola ritardo veloce.
    4. Impostare il ritardofino al punto di massima intensità, cambiando il "controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: impostazione del ritardo corrente (PS)". Regolare i parametri di acquisizione (densità neutra, il tempo di esposizione) in modo che il CCD non è saturo.
    5. Impostare passi ritardo di 25 ps oltre la gamma completa di ritardo ( "controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: Popolare ritardi).
    6. Acquisire i dati di tintura di riferimento premendo il tasto "Snap immagine FLIM".
    7. Acquisire la seconda immagine di sfondo una camera CCD, bloccando il laser di eccitazione (vedi 2.11.7)
13. Acquisire i dati FLIM del campione piastra di pozzetti utilizzando il software di acquisizione μManager:
    1. Set che pozzetti devono essere esposte e il numero di FOV da acquisire per bene ( "Setup HCA acquisizione in sequenza: posizioni XYZ").
    2. selezionare manualmente un FOV esemplare contenente il campione da acquisire. Utilizzare questa FOV per determinare il filtro a densità neutra ottimale, larghezza porta al GOI etempo di integrazione della telecamera in modo da raggiungere il 75% del range dinamico della telecamera CCD.
    3. Impostare autofocus ( "controllo XYZ: Autofocus"): Premere "solo controllo del fuoco di ritorno", e poi messa a fuoco manuale sulle cellule o strutture di interesse. Impostare "intervallo di ricerca Autofocus" a 2000 micron e premere "Invio". Premere il tasto "AF ora" per iniziare una procedura di messa a fuoco automatica. Un valore di offset verrà visualizzato nel campo "FocusOffset (Autofocus)".
    4. Inserire il valore di offset ottenuto in 2.13.3 in "Offset AF" e ripetere la procedura di messa a fuoco automatica per due volte ( "AF ora") per verificare che il valore di offset è ora pari a zero, che indica il corretto funzionamento del sistema di messa a fuoco automatica.
    5. Utilizzare la funzione "AutoGate" nel software di acquisizione OpenFLIM-HCA di scegliere un campione logaritmica dei punti di ritardo. In alternativa, questi possono essere selezionati manualmente, vedere riferimentoENCE 36 per maggiori dettagli.
    6. Impostare "Accumulate Frames" per un valore che i rendimenti desiderati tempo totale di acquisizione dei dati. Aumentando il numero di fotogrammi accumulati aumenta rapporto segnale-rumore dei dati FLIM a spese di anche aumentare il tempo totale di acquisizione dati FLIM.
    7. Eseguire l'acquisizione FLIM della piastra pozzetti premendo il pulsante "Start sequenza HCA".
14. Acquisire ulteriori immagini della telecamera uno sfondo CCD, bloccando il laser di eccitazione (vedi 2.11.7) con le impostazioni di acquisizione identici ed usati per l'acquisizione dei dati FLIM.

3. Analisi dei dati openFLIM-HCA Utilizzando FLIMfit

1. Controllare che i necessari file ausiliari per l'analisi dei dati FLIM sono presenti (ad esempio, IRF e la misurazione della tintura di riferimento).
2. Caricare i dati dal pozzetto vuoto (H1), il mezzo pozzetto contenente coltura (H2) e la ben contenenti cellule non marcate in mezzo di coltura (H3) in FLIMfit( "File: caricare i dati FLIM") per verificare se vi siano contributi di fondo più grande di 1% del segnale dalle cellule che esprimono "donatore-only", vale a dire, in pozzetti A1-G3.
3. Preparare un file variabile nel tempo di fondo (TVB) caricando il medium bene con la cultura in FLIMfit ( "File: caricare i dati FLIM"). Caricare i dati della macchina fotografica di fondo acquisiti nella sezione 2.14 ( "Background: Load Background") e utilizzare i "Tools: Crea TVB intensità Mappa" FLIMfit per generare la TVB. Vedi riferimento 31 per maggiori dettagli sulla TVB.
4. Preparare la spazialmente variabile IRF correzione di mappa caricando i dati acquisiti IRF nel paragrafo 2.11 e sottrarre il fondo telecamera CCD acquisito nella sezione 2.11.7. Utilizzare l'opzione FLIMfit "Strumenti: Creare IRF correzione di mappa" per calcolare la variabile spazialmente IRF cambio mappa. Vedere di riferimento [31] per maggiori dettagli sulla IRF cambio mappa.
5. Montare un monoexponenziale decadimento ai dati colorante di riferimento acquisiti nella sezione 2.12. Colorante carico di riferimento e la spazialmente variabile mappa IRF calcolata nella sezione 3.4, impostare i parametri in forma ( "Durata: No. Exp: 1") con t ₀ set come parametro attrezzata ( "Durata: FIT IRF Spostamento: Fornitura"). Il valore di t ₀ ottenuto viene poi riportato nella tabella mostrata nella scheda "Parametri".
6. Analizzare i dati FLIM caricando i dati FLIM sperimentali acquisiti nel paragrafo 2.13, la spazialmente variabile IRF Mappa calcolato nella sezione 3.4, sullo sfondo macchina fotografica acquisita nel punto 2.14, il file TVB preparato in sezione 3.3 e digitare il valore negativo di t ₀ ottenuto nella sezione 3.5 ( "IRF: IRF spostamento: t _0"). Poi inserire i dati sperimentali al modello di decadimento desiderato utilizzando FLIMfit ³⁶ a seconda delle esigenze dell'esperimento.

Results

Per illustrare le funzionalità della strumentazione openFLIM-HCA, vi presentiamo tre applicazioni FRET esemplari. Il primo riguarda FRET costrutti che sono adattati da costrutti modello FRET sviluppati dal laboratorio di Stephen Vogel ^38. Essi comprendono una serie di costrutti fluorescenti geneticamente esprimibili in cui una proteina fluorescente donatore (mTurquoise) è collegato ad un fluoroforo accettore (Venere) per lunghezze breve controllate di acidi 5, 17 e 32 aminoacidi (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Le diverse lunghezze linker tra fluorofori donatore e accettore risultato in diverse efficienze tasto e quindi diversi tempi di vita del donatore. Per fornire un controllo negativo, la Venere nel breve 5-amino acid linker costrutto è sostituito da Amber - una mutazione non fluorescente YFP (mTq5A) che non può agire come un accettore FRET ^38. Abbiamo sostituito Cerulean nei vettori originali pCXV e pC5A dalla restrizione digerire il vectors con NheI e BglII enzimi e legando frammenti mTurquoise digerito con gli stessi enzimi dal vettore pmTurquoise-N1. La regione linker è stato modificato da questa sostituzione.

La figura 6 presenta una FLIM esemplare FRET dosaggio con questo sistema modello espressa in cellule Cos, in cui una piastra multipozzetto viene schierato con 3 colonne ciascuno di cellule trasfettate con il controllo negativo (colonne 1-3), il linker acido 5-amino FRET costruire (colonne 4-6), il linker acido 17-ammino FRET costruire (colonne 7-9) e il linker acido 32 amino FRET costruire (colonne 10-12). Linea H contiene pozzi per la stima TVB. Figura 6 (a) mostra esempi di immagini a vita fluorescenza acquisiti automaticamente di campi tipici di vista in ciascun pozzetto. È evidente che il controllo negativo (colonne 1-3) presentano le vite più lunghe e che la durata donatore disponibilità per il FRET costrutto con il più breve linker lenGTH (colonne 4-6). Figura 6 (b) mostra come la vita media media di tutti i FOV in ciascun pozzetto varia attraverso la piastra pozzetti. Figure 6 (c) e (d) mostrano le mappe a vita intensità-fusione donatore fluorescenza esemplari per un FOV di mTq5A e mTq17V rispettivamente. Figura 6 (e) mostra il donatore di fluorescenza profilo di intensità di decadimento mediato su tutte le cellule imaged in A1, insieme con l'adattamento di un modello di decadimento monoesponenziale e l'IRF (che è dominato dalla larghezza porta GOI). Figura 6 (f) presenta la vita media di fluorescenza per ogni colonna della piastra multipozzetto ottenuto da una vestibilità monoesponenziale pixel-saggio. Una tabella della vita media e la deviazione standard (STD) si può trovare nella tabella 1 qui sotto. L'acquisizione dei dati per le immagini mostrate in figura 6 ha circa 160 min acquisire. L'analisi ha 92 s su un computer 2,6 GHz con 10 core e 64 GB di RAM.

Il secondo test esemplare mostra l'applicazione di FLIM FRET di leggere la oligomerizzazione di HIV-1 Gag durante l'assemblaggio del virus HIV-1 virioni come mezzo per testare inibitori di questo processo ^25,42. Esprimendo HIV-1 Gag in cellule ospiti appropriate fornisce un sistema modello per questa fase del ciclo di vita di HIV-1 in quanto porta alla formazione di particelle virali (VLPs) che sono simili immaturi HIV-1 virioni. Per questo test, abbiamo espresso HIV-1 proteina Gag fonde con CFP in cellule HeLa e confrontato l'azione di differenti inibitori tramite il loro impatto sul segnale FRET che ha portato dalla oligomerizzazione Gag. Dettagli delle inibitori utilizzati sono forniti in riferimento 42.

I dettagli della preparazione del campione e misure sperimentali sono descritti ampiamente in riferimento 25, dove abbiamo dimostrato che potremmo usare FLIM per leggere boesimo heteroFRET tra l'aggregazione delle proteine ​​Gag marcate stocasticamente con PCP e con YFP, e anche homoFRET in cellule che esprimono solo Gag etichettato con PCP. Anche se homoFRET di solito non presenta un cambiamento nella vita del donatore, lo fa per il caso particolare di PCP in cui è presente il fluoroforo in due isomeri con diversi tempi di vita di fluorescenza media ^40,41. La PCP omo-FRET lettura ha il vantaggio di preparazione del campione semplificato rispetto al CFP / YFP etero-FRET ed è più efficiente dello spettro, che potrebbe essere importante per letture FRET multiplex.

Il nostro lavoro precedente applicata FLIM FRET per saggiare la oligomerizzazione Gag in presenza di una N-myristoyltransferase (NMT), un inibitore ^42. Questo inibitore sconvolge gli enzimi endogeni responsabili l'aggiunta di acido miristico al Gag, che consente proteine Gag di legarsi alla membrana plasmatica ed è un prerequisito ⁴³ nella formazione di virioni di HIV oVLP. Abbiamo dimostrato che entrambe le letture heteroFRET e homoFRET potrebbero realizzare Z 'di> 0,6 negli studi dose-risposta con un inibitore NMT. Z 'è un parametro utilizzato nell'industria farmaceutica per indicare la qualità di un test e rappresenta le differenze nei valori medi dei controlli positivi e negativi e sui relativi spread per generare un singolo valore di metrica di qualità dosaggio - con Z'> 0,5 essere considerato "eccellente" per un saggio farmaceutica ^44. Notiamo che questo eccellente risultato è stato ottenuto con campioni per i quali la variazione vita media donatore era dell'ordine di 300 ps - dimostrare la potenza statistica di analisi dei dati FLIM per un gran numero di cellule, che consente letture utili da realizzarsi utilizzando molto più piccolo cambiamenti nella vita di fluorescenza di quanto sia possibile con i numeri tipici di cellule impressi in esperimenti di microscopia manuali.

Qui, vi presentiamo un piatto FLIM pozzetti Fret set di dati a confronto 4 composti inibitori per l'HIV Gag oligomerizzazione (designato ICL13, ICL14, ICL15 e ICL16). Per questo esperimento, abbiamo utilizzato la lettura homoFRET con cellule HeLa trasfettate con il plasmide Gag-PCP. Un totale di nove differenti dosi di ciascun inibitore sono stati applicati seguendo il protocollo standard descritto in riferimento 32, permettendo due pozzetti di ripetizione per condizione. Come controllo positivo, colonna 1 presenta cellule esprimenti myr-Gag, una proteina Gag mutata privo della parte acida miristico che non può formare VLP e quindi simula totale inibizione. Un controllo negativo è stato fornito da parte delle cellule che esprimono dosaggio Gag-CFP solo con solo il veicolo utilizzato per trasportare gli inibitori nelle altre colonne (colonna 11). Un totale di otto FOV sono stati acquisiti per pozzetto.

I dati sono stati dotati di un unico modello di decadimento esponenziale su base pixel-per-pixel e il plat di fluorescenza vitae mappa che mostra la vita media per bene (su tutti i pixel al di sopra della soglia di intensità attraverso gli otto campi di vista) Di seguito è riportato in figura 7 (a). Figura 7 (b) mostra il diagramma corrispondente di vita di fluorescenza in funzione della concentrazione dell'inibitore. Tre degli inibitori mostrano un effetto inibitorio (ICL13, ICL15 e ICL16) quando incubate con cellule che esprimono Gag-PCP. Un inibitore (ICL14) non mostra alcun effetto in qualsiasi dose testata. La Z 'calcolato per questo piatto era 0,51. I valori ottenuti per i controlli positivi e negativi sono mostrati nella Figura 7 (b) i punti in nero a 100 mM e 0,1 nM.

Le curve dose-risposta per ICL13, ICL15 e ICL16 mostrati nella Figura 7 (b) sono stati poi montato sulla logistica modello di regressione non lineare 4 parametro con il coefficiente Hill fissato a 1 ⁴⁵ con il massimo e minimo vite fissata alvalori ottenuti dalla (colonna 1) positivo e negativo (colonna 11) controlla rispettivamente. I valori restituiti IC ₅₀ per le tre curve erano poi: 38 nM, 24 Nm e 116 nM per ICL13, ICL15 e ICL16 rispettivamente. Per il confronto con i valori di IC ₅₀ ottenute attraverso FLIM intracellulare FRET misurazioni, abbiamo determinato _IC50 per l'inibizione della attività enzimatica ricombinante NMT1 umana nel nostro test enzimatico biochimico riportato in precedenza ^42. I tre composti che si trovano ad essere attivo da FLIM FRET sono anche i più attivi in questo saggio (IC ₅₀ valori di 17 Nm, 51 nm e 39 nM per ICL13, ICL15 e ICL16, rispettivamente), con ICL14, che non ha mostrato alcuna reazione significativa nel saggio FLIM FRET, essendo ca. 100 volte meno attivo contro NMT1 (IC ₅₀ del 1700 nm). Per i composti attivi, i valori di IC ₅₀ ottenuti attraverso queste modalità di analisi indipendenti sono molto simili, con minime variazioni probabilmente attribuibili a differences in assorbimento o il metabolismo del composto in cellule.

Questo piccolo studio evidenzia la capacità di FLIM HCA discriminare la potenza di diversi composti che agiscono sullo stesso bersaglio di interesse. Noi crediamo che sia la prima dimostrazione di uno schermo mediante FLIM automatizzata in un contesto alto contenuto di generare più curve dose-risposta e illustra il potenziale FLIM da applicare per lo screening e / o caratterizzare composti terapeutici utili.

Il terzo esemplare esperimento FLIM FRET riguarda un biosensore FRET geneticamente espresso per Exchange proteina attivata da adenosina monofosfato ciclico (cAMP (EPAC)), che è un fattore di scambio Rap-1 guanina che si lega specificamente al campo. Questo biosensore EPAC FRET (EPAC-S ^H188) utilizza proteina fluorescente mTurquoise2 (mTq2FP) come fluoroforo donatore e incorpora due Venere-FP per implementare un composite accettore ^46. Camp è un secondo messaggero onnipresente ed è coinvolto in una pletora di processi intracellulari durante molti organismi diversi. Viene sintetizzato da adenilato ciclasi dalla conversione di ATP sulla membrana cellulare. Qui mostriamo la nostra capacità di leggere e quantificare la sua attività in cellule HEK293T dal vivo dopo l'aggiunta di forskolina, un attivatore ciclasi ciclasi che fa aumentare la produzione intracellulare di cAMP e quindi aumenta la sua concentrazione citoplasmatica. Questo sensore EPAC subisce FRET nel suo stato inattivato (non legato) e suoi donatori durata aumenta con la concentrazione di cAMP come il cAMP conduce all'apertura del biosensore. Il profilo di decadimento mono-esponenziale di mTq2FP rende questo biosensore più adatto per l'analisi quantitativa vita di biosensori basati ^CFP-45. La figura 8 mostra un esempio di un corso di tempo registrato usando l'FLIM microscopio automatizzato piastra multipozzetto dove abbiamo tracciato il cambiamentoin vita media e la variazione nella frazione popolazione FRETing donatore nel tempo dopo l'aggiunta di 100 pM forskolin. Per semplicità, supponiamo che il segnale totale può essere descritto da una miscela di FRETing monoesponenziale e donatori non FRETing e la frazione popolazione del biosensore attivato EPAC FRET è stata ottenuta inserendo un profilo di decadimento esponenziale doppio tutta la serie storica.

Per l'acquisizione dei dati di Camp (EPAC) cinque ritardi cancello, con una larghezza di gate di 4.000 ps, ​​sono stati scelti con il tempo di ritardo impostato a 1.300 ps, ​​4.300 ps (intensità di picco), 4.919 ps, 6.656 ps, 8.035 ps, 1, 0391 ps e 16.000 ps. Il tempo di integrazione della fotocamera per ogni ritardo era di 250 ms. A un certo bene, abbiamo acquisito una volta portate FLIM con immagini acquisite ogni 10 s su 10 min. I punti dei dati acquisiti a volte 120 S e 130 s sono stati rimossi perché l'aggiunta di forskolin causato un piccolo spostamento della posizione focale del campione e siasie dell'intensità di fluorescenza registrata durante le acquisizioni FLIM in questi punti temporali.

Per l'analisi dei dati delle immagini sono state caricate in FLIMfit e segmentati per cella. I dati di fluorescenza durata è stato montato su un modello di decadimento esponenziale doppia utilizzando un IRF e un valore fisso t ₀ ottenuto da un colorante di riferimento (75 pM cumarina 6). La fluorescenza del donatore significa vita media su tutte le celle è mostrato in figura 8 (a). Figura 8 (b) mostra la variazione della frazione di popolazione FRETing nel tempo calcolato inserendo gli stessi dati FLIM per lo stesso modello di decadimento doppio esponenziale

dove β è la frazione donatore FRETing. Assumiamo una miscela di FRETing e eleme non FRETingnti per i punti di tempo prima dell'aggiunta di forskolin. Per ottenere queste vite, una misura doppia esponenziale è stato applicato ai primi tre punti di tempo dando vite di τ ₁ = 3.964 ± 21 ps per il donatore non FRETing, e τ ₂ = 3.022 ± 27 ps per il donatore FRETing. Questi sono stati fissati per la successiva misura dei dati intero insieme per ottenere i valori di beta in ogni punto.

In sintesi, abbiamo presentato i risultati HCA FLIM esemplari per tre campioni sperimentali. Il primo era un piatto ben 96 schierati con le cellule che esprimono Cos FRET costruisce comprende un donatore mTqFP legato sia ad un accettore Venere FP o non fluorescente Ambra costruire variando lunghezze di peptide linker. La variazione FRET efficienza e quindi durata donatore con lunghezza linker è evidente e la deviazione standard della vita media per ogni costrutto era meno di 36 ps. Il secondo esemplare assay era una "finestra" di quattro potenziali inibitori per myristoylation della proteina HIV Gag per cui l'inibizione% è stato calcolato dalla variazione media durata donatore di fluorescenza con concentrazione dell'inibitore misurata in cellule HeLa esprimenti Gag proteina marcata con PCP. Questa lettura è basato su homoFRET, che di solito non presentare un cambiamento di vita donatore ma fa per PCP perché esiste in più isomeri con vite fluorescenti differenti. Questo può essere utile in termini di efficienza spettrale, ad esempio, per multiplexing diverse letture FRET ^25. Il terzo saggio esemplare è stato un corso di monitoraggio in tempo le cellule HEK293T vive che esprimono il biosensore cAMP FRET, EPAC. Questo ha dimostrato la risposta prevista in seguito al trattamento con forskolin e l'applicazione di FLIMfit utilizzando un modello di doppio decadimento esponenziale con il numero di fotoni rilevati essere commisurato con l'imaging cellulare dal vivo - come abbiamo già dimostrato con la Biosen LIBRA FRETsor per IP3 ^47.

Figura 1. Schema di grande campo di tempo-dipendenti FLIM utilizzando un intensificatore di immagine ottica gated (GOI). lato sinistro, mostra uno schema del sistema sperimentale. In alto a destra, schematica di impulsi di eccitazione, carica di immagini in tempo-dipendenti e fit monoesponenziale ai dati. In basso a destra, vignetta che mostra il decadimento di fluorescenza dei due oggetti indicati nel sistema sperimentale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Schema di grande campo openFLIM-HCA utilizzando un intensificatore di immagine ottica gated (GOI). Vedi testo principale per una descrizione più dettagliata delcomponenti del sistema. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Schema di otticamente sezionato openFLIM-HCA utilizzando un intensificatore gated di immagine ottico (GOI) con una unità scanner disco di Nipkow. Vedere testo principale per una descrizione più dettagliata dei componenti del sistema. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Schema del flusso dei dati immagine dal programma di acquisizione Manager per omero server o rigido del computer e in FLIMfit per l'analisi. il flusso di dati inizia in alto l angolo EFT in cui i dati immagine RAW viene acquisita nel software di acquisizione μ-Manager. Gli oggetti all'interno del riquadro tratteggiato rappresentano le fasi di analisi dei dati FLIM, mentre quelli di fuori corrispondono alla acquisizione e memorizzazione dei dati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Schermata di interfaccia utente FLIMfit. In alto a sinistra, la lista dei campi di vista dell'immagine intensità di fluorescenza del campo selezionato di vista attualmente caricato e. In basso a sinistra, la selezione del modello di montaggio e condizioni di montaggio. In alto a destra, il decadimento fluorescenza per regione corrente di interesse (cerchi blu), in forma di dati (linea rossa), IRF (linea rossa tratteggiata), con residui in forma di sotto (linea blu).g5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. piatto pozzetti FLIM del modello FRET costruisce mTq5V, mTq17V, mTq32V espresso in cellule Cos. (A) immagini di fluorescenza durata esemplari di FOV in ciascun pozzetto per diversi costrutti FRET espressi in cellule Cos come discusso nel testo. (B) mappa termica di vite medie di fluorescenza Venere media su tutte le cellule di ogni pozzetto. (C) l'immagine intensità mTurquoise Ambra sovrapposti con mappa corso della vita (barra della scala 20 micron). (D) l'immagine intensità mTurquoise Venere (17 aminoacidi) rivestito con carta a vita (barra della scala 20 micron). (E) il profilo misurato l'intensità di decadimento (cerchi blu) di mTq5A costruire (controllo negativo) di fluorescenza media su tutte le cellule imaged in ben A1, insieme con la misura dei dati da un decadimento monoesponenziale (linea continua blu) e IRF (linea tratteggiata arancione). (F) grafico di vita media calcolata in media su ogni colonna attraverso la piastra pozzetti, con barre di errore che mostrano la deviazione standard di vita della fluorescenza tra i campi di vista. I valori di vita per (AD) sono rappresentati utilizzando una scala di colori falsi con i limiti indicati in picosecondi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. schermo pozzetti Esemplare piatto FLIM di inibitori Gag utilizzando cellule HeLa che esprimono Gag-PCP. (A) mappa di calore di media donatore fluorescenza vita per bene per piatto pozzetti schierato con la colonna 1 cellule presentanti trasfettate con MYR-Gag-PCP come positiv controllo e per l'inibizione, colonna 11 presenta cellule trasfettate con Gag-CFP riceva solo veicolo, ed i quadrati colorati tratteggiate indicano i pozzi che sono stati trattati con una delle quattro differenti inibitori con concentrazioni che vanno da colonna alta dose da 2 a colonna a basso dosaggio 10 . la scala di falsi colori rappresenta la vita di fluorescenza media che va da 2.200 a 3.100 ps ps. (B) trame di vita di fluorescenza per ciascun inibitore con barre di errore che mostra la deviazione standard tra i pozzi di ripetizione. Punti in nero a 2 e -4 sull'asse orizzontale sono i punti di controllo positivi e negativi rispettivamente ottenuti da colonne 1 e 11, rispettivamente. Le linee continue indicano un adattamento ai dati curva dose-risposta per i diversi inibitori. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 8. uso Esemplare di FLIM per leggere il biosensore EPAC FRET in una misura di time-lapse utilizzando cellule HEK293T. Variazione (a) fluorescenza media durata e (b) frazione di FRETing donatore in funzione del tempo dopo l'aggiunta di forskolin indicato dalla barra verde. Le barre di errore indicano l'errore standard per cella. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

	per pozzetto	STD	ERR			per pozzetto	STD	ERR
mT5A	4008	32	12		MT17V	3004	26	10
mT5V	2717	35	13		mT32V	3133	30	11

Tabella 1. Media a vita e la deviazione standard (STD) dei costrutti tasto.

Discussion

Abbiamo descritto un microscopio piastra di pozzetti automatizzato progettato per HCA usando FLIM tempo-dipendenti. Questo strumento è controllato tramite il software open source scritto in μManager con la possibilità di salvare i dati su un server OMERO e l'analisi dei dati FLIM essere effettuata utilizzando FLIMfit ^36, un programma open source scritto in MATLAB e disponibile come client OMERO ³² Lo strumento μManager software di controllo, openFLIM-HCA, è disponibile on-line ³³ con un elenco dei componenti del sistema ⁴⁸ per consentire ai ricercatori accademici di costruire i propri strumenti FLIM HCA.

Al fine di acquisire i dati FLIM robuste, è necessario ottimizzare le impostazioni di acquisizione GOI e CCD e di tener conto di eventuali variazioni in t _0. Come descritto in 3.8.2, il guadagno e la fotocamera CCD tempo di integrazione governo indiano deve essere impostato per raggiungere ~ 75% della gamma dinamica del CCD. Ucantare più elevate tensioni GOI e più accumuli telaio CCD ad ogni ritardo cancello volta aumenta il rapporto segnale-rumore ^49, ma questo aumenta il tempo di acquisizione FLIM totale (da un minor numero di fotoni di fluorescenza vengono acquisiti per fotogramma prima che i saturi telecamera CCD e quindi il numero di accumuli telaio dovrebbe essere aumentato) e quindi questo trade-off dovrebbe essere deciso per ogni esperimento. La taratura del generatore ritardo dipende dalla frequenza di ripetizione del laser ed è quindi necessario garantire che il file di calibrazione corretto per la frequenza di ripetizione utilizzato viene caricato nel software di acquisizione. La procedura per calibrare la casella di ritardo può essere trovato sul openFLIM-HCA wiki ^33.

Se l'autofluorescenza cellulare è bassa rispetto al segnale di fluorescenza, si usa il segnale da un supporto di cultura giusta pozzetto contenente fornire lo sfondo tempo-variante (TVB). Per minimizzare fluorescenza di fondo dal mezzo di coltura cellulare, evitiamosupporti contenenti rosso fenolo. Se l'autofluorescenza cellulare è significativo, allora il TVB può essere derivato da misurazioni delle cellule non marcate. Tuttavia, in questo caso bisogna fare attenzione, come questo presuppone che lo sfondo autofluorescenza è la stessa per ogni pixel dell'immagine. Questo presupposto non sarà valida se l'autofluorescenza varia significativamente una cella o se il fascio di eccitazione o la sensibilità di rilevamento non è uniforme nel campo di vista.

L'acquisizione di un'immagine IRF utilizzando impulsi di luce di eccitazione sparsi fornisce il profilo IRF temporale che è convoluta con il modello di dati nel processo di montaggio e fornisce anche una mappa della variazione spaziale della IRF attraverso il campo di vista. L'IRF può essere misurata l'imaging di un campione di dispersione quale una sospensione colloidale anche se, nel nostro strumento, usando luce di eccitazione dispersa dal disco Nipkow fornisce una misurazione più pulita del IRF. determinazione accurata della tempistica of la IRF è importante perché gli errori nel tempo di ritardo tra l'eccitazione e il tempo-gating possono influire in modo significativo il processo di adattamento, in particolare quando il montaggio di modelli di decadimento esponenziale complessi. L'IRF ha acquisito utilizzando la luce di eccitazione diffusa non è esattamente ciò che è necessario per il processo di adattamento, perché è registrato alla lunghezza d'onda di eccitazione piuttosto che alla lunghezza d'onda di emissione di fluorescenza, che può influenzare la sua tempistica, anche se la variazione spaziale della IRF dovrebbe essere la stessa ad entrambe le lunghezze d'onda. Inoltre, l'IRF disperso può essere spostata a livello globale in tempo relativo alla vera IRF causa di un cammino ottico divergente dall'oggetto dispersione, come nel caso di un IRF acquisito dal disco Nipkow in FLIM otticamente sezionata. Tale correzione, t _0, che è lo spostamento temporale globale necessaria da applicare alla acquisito sparsi IRF luce di eccitazione, è calcolata dai dati colorante riferimento monoesponenziali come indicato in ProtoCpasso olo 4.4. I seguenti coloranti possono essere utilizzati per diverse lunghezze d'onda di eccitazione: a 75 pM cumarina 153 soluzione in metanolo (τ ~ 4,3 ns ⁵⁰⁾ può essere usata per l'eccitazione nell'intervallo 295-442 nm; un 75 mM cumarina 6 soluzione in etanolo (t ~ 2,43 ns ³⁷⁾ possono essere utilizzati per l'eccitazione nell'intervallo 430-500 nm; e 75 mM soluzione rodamina B in acqua (τ ~ 1,7 ns ³⁷⁾ può essere usata per l'eccitazione nell'intervallo 488-575 nm. Notiamo che, sebbene sia possibile in FLIMfit utilizzare un diverso IRF per ciascun pixel del sistema, di solito è ragionevole fare l'ipotesi che la spazialmente variabili IRF ha lo stesso profilo temporale per ogni pixel dell'immagine, ma presenta una gamma di spazialmente variabile offset temporali relativi alla t globale _0. Descriviamo questo come la variazione di mappa IRF, che è determinata dalla IRF luce diffusa. Insieme, il profilo IRF, t ₀ e la mappa spostamento IRF vengono usati per enAssicurarsi che ogni pixel nel FOV è dotata di un IRF appropriata. È importante sottolineare che, t ₀ può variare lentamente nel tempo e quindi dovrebbe essere misurato prima di ogni acquisizione dati FLIM.

L'utente deve decidere come per assaggiare i profili di decadimento di fluorescenza ed è necessario per impostare la larghezza dei termini cancelli ed i loro relativi ritardi dopo l'eccitazione. In generale, è auspicabile utilizzare ampie larghezze di gate per massimizzare il segnale rilevato e tipicamente usiamo larghezze di gate impostati a 4 ns per FLIM di cellule marcate con proteine ​​fluorescenza. Il numero di ritardi di tempo-gate dovrebbe essere sufficiente per campionare il profilo di decadimento fluorescente (compresa una porta impostato per misurare il segnale appena prima dell'impulso di eccitazione) data la complessità del montaggio di modello che verrà utilizzato nell'analisi. Il valore ottimale può dipendere dalle vite e ampiezze relative delle componenti di decadimento. In generale, 4 porte sono sufficienti per monoesponenziale montaggio decade mentre 7 o più porte puòessere utilizzato per più modelli di decadimento complessi.

Notiamo che FLIM può essere implementato utilizzando una serie di tecniche nel dominio del tempo o nel dominio della frequenza e HCA FLIM automatizzata di matrici piastra pozzetti è stata implementata prima di una (non sezionamento) in tutto il campo ottico con letture a vita nel dominio della frequenza di FRET ^51. La prima ottica sezionamento FLIM lettore di piastre pozzetti automatizzato per HCA l'utilizzo in tutto il campo di tempo-dipendenti di imaging ²⁸ è stato poi riportato. Successivamente, a grande campo (non sezionamento) nel dominio della frequenza FLIM HCA è stato applicato per lo screening per le modifiche post-traslazionali (tirosin-fosforilazione) attraverso una libreria gene utilizzando FRET ⁵² e il tempo-dipendenti FLIM HCA è stato applicato a preoccuparsi saggi di HIV-1 gag oligomerizzazione ⁵³ e di SUMOylation di FoxM1 ⁵⁴ e di Raichu RhoA e Rac1 biosensori ^33. E 'anche possibile utilizzare TCSPC per piastra di pozzetti FLIM ^26, ma fino ad oggi si è dimostrato difficile da abbinare tegli throughput tecniche che sfruttano il rilevamento a grande campo. Un approccio emergente che potrebbe affrontare questo problema è l'uso di matrici di rivelatori singoli conteggio di fotoni come array SPAD ^55.

Notiamo che eventuali letture di FRET utilizzando proteine fluorescenti devono essere trattati con cautela e che i valori assoluti dei parametri ottenuti da FLIMfit o qualsiasi altro software di analisi FLIM dipenderà dalle ipotesi associati al modello raccordo. Per esempio, dove il donatore FRET ha una significativa componente secondo decadimento, l'uso di un modello biesponenziale per adattarsi ai dati FRET FLIM può comportare il contributo della componente più veloce decadimento, tipicamente associati con la popolazione FRETing appare superiore a quello che dovrebbe. E 'quindi desiderabile impiegare donatori con una vita mono-esponenziale, come mTq2FP. Anche allora, recenti studi hanno dimostrato che l'analisi FRET può ancora essere influenzata da stati scure di proteine ​​accettore di fluorescenza o dieterogeneità del fattore orientamento κ ^{2 a} causa di una distribuzione di conformazioni fluoroforo con una varietà di angoli cromofori e distanze ^56. Tuttavia, noi e altri hanno dimostrato che le letture di fluorescenza a vita di FRET producono risultati utili che correlano con le misurazioni biochimiche e possono essere utilizzati per lo screening per le interazioni proteina o di seguire la dinamica di biosensori. Così questa piattaforma HCA openFLIM può essere applicata a una vasta gamma di test di durata a base di fluorescenza utilizzando FRET o autofluorescenza cellulare ^8, oltre a fornire letture quantitativi di sonde a base di coloranti ^25.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
telaio per microscopio	Olympus	IX81	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
autofocus ottico	Olympus	ZDC	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
tavolino per microscopio motorizzato (x-y-z)	Marzhauser	00-24-565-0000	Corvus controlle
	Fianium	SC400-4	Laser supercontinuum http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
intensificatore ottico gated	Generatori di ritardo Kentech	High Rate Imager (HRI)
Kentech		---	See Generatore di ritardo agile e fotocamera per generatore di ritardo di precisione
	Hamamatsu	ORCA-ER-II
Unità scanner a disco Nipkow	Yokogawa	CSU-X1	http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Diffusore a cilindro	Thorlabs	ED1-S20-MD	Diffusori ingegnerizzati
mTq5V	Oxford Genetics	P3850	mCostrutto di Venere turchese con 5 linker di aminoacidi
mTq17V	Oxford Genetics	P3847	mCostrutto di Venere turchese con 17 linker di aminoacidi
mTq32V	Oxford Genetics	P3848	mCostrutto di Venere turchese con 32 linker
di aminoacidi mTq5A	Oxford Genetics	P3849	mCostrutto di ambra turchese
HEK293T	---	---	tipo di cellule utilizzate
fenolo privo di rosso HBSS	Sigma Aldrich	55021C-1000ML	terreni
		imaging terreni di coltura	DMEM + 10% FBS + 0,5% Antibiotici
DMEM	Sigma Aldrich	D6046-500ML	per terreni di coltura
FBS	Sigma Aldrich	12003C-500ML	per terreni di coltura
xTremeGene9	Sigma Aldrich	6.37E+09	per la trasfezione, seguire il protocollo online della
soluzione di tripsina/EDTA	Thermo Fischer	R001100	per il distacco delle cellule, seguire il protocollo online di Thermo Fischer