Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l'impatto dell'iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

L'iperglicemia è definita come livelli eccessivi di glucosio nel sangue. Anche se potrebbe riflettere una situazione di stress acuto, l'iperglicemia è anche una condizione che spesso porta a una diagnosi di diabete, un disturbo cronico di secrezione insulina e / o resistenza. Nel 2016, il numero degli adulti che vivono con il diabete ha raggiunto 422 milioni di persone in tutto il mondo, e ogni anno 1,5 milioni di persone muoiono da questa malattia, rendendolo un grave problema di salute ¹ . Infatti, il diabete incontrollato porta a diversi disturbi fisiologici che interessano il sistema cardiovascolare, i reni e i sistemi nervosi periferici e centrali.

È interessante notare che l'iperglicemia acuta e cronica può alterare la cognizione e contribuire sia alla demenza che alla depressione ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Inoltre, l'ammissione dei pazienti wL'iperglicemia è stata associata a peggiori risultati funzionali, neurologici e di sopravvivenza dopo l'ictus ischemico ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11} . È stato inoltre dimostrato che l'iperglicemia / diabete influisce sulla neurogenesi adulta, un processo che porta alla generazione di nuovi neuroni, impattando l'attività delle cellule staminali neurali e la differenziazione, la migrazione e la sopravvivenza neuronale ^{2 , 12} .

A differenza dei mammiferi, i pesci teleostici, come i pesci zebra, mostrano un'intensa attività neurogenica in tutto il cervello e presentano una straordinaria capacità di riparazione del cervello durante l'età adulta ^{13 , 14 , 15 , 16} . In particolare, tali capacità sono possibili a causa della persistenza del neuCellule staminali / progenitori, comprese le glia radiali ei neuroblasti ^{17 , 18 , 19} . Inoltre, il pesce zebra è recentemente emerso come modello per studiare i disturbi metabolici, tra cui l'obesità e l'iperglicemia / diabete ^{20 , 21 , 22} .

Anche se il pesce zebra è un modello ben noto di iperglicemia e neurogenesi, pochi studi hanno indagato l'impatto dell'iperglicemia sulla homeostasi del cervello e sulla funzione cognitiva ^{12 , 23} . Per determinare l'impatto dell'iperglicemia sulla proliferazione delle cellule cerebrali congenite e causata da lesioni, è stato creato un modello di iperglicemia acuta attraverso l'iniezione intraperitoneale di D-glucosio. Inoltre, un modello di iperglicemia cronica è stato riprodotto attraverso l'immersione di pesci in acqua integrata wIth D-glucosio ¹² . I pesci zebra presentano molti vantaggi nella ricerca. Sono economici, facili da sollevare e trasparenti durante le prime fasi di sviluppo, e il loro genoma è stato sequenziato. Nel contesto di questo lavoro, essi presentano anche diversi vantaggi: (1) condividono processi fisiologici simili con gli esseri umani, rendendoli uno strumento fondamentale per la ricerca biomedica; (2) consentono una rapida indagine dell'impatto dell'iperglicemia sulla homeostasi del cervello e sulla neurogenesi, vista la loro diffusa e forte attività neurogenica; E (3) sono un modello alternativo che consente la riduzione del numero di mammiferi utilizzati nella ricerca. Infine, il pesce zebra può essere utilizzato come modello per testare la biodistribuzione di molecole radiomarcate e potenziali agenti terapeutici usando PET / CT.

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di documentare visivamente come impostare modelli di iperglicemia acuta e cronica in zebrafish, utilizzare zebRafish per valutare il rimodellamento del cervello in condizioni iperglicemiche e monitorare le molecole radiomarcate (qui, [18F] -FDG) usando PET / CT.

I pesci zebra degli animali selvatici adulti ( Danio rerio ) sono stati mantenuti in condizioni normali di fotoperiodo (14/10 h luce / scura) e temperatura (28 ° C). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle direttive comunitarie francesi e comunitarie per l'uso degli animali nella ricerca (86/609 / CEE e 2010/63 / UE) e sono state approvate dal Comitato Etico locale per la sperimentazione animale.

1. Stabilire un modello di iperglicemia acuta in Zebrafish

1. Preparare una soluzione di base di tricaina (MS-222) sciogliendo 400 mg di polvere di tricina in 97,9 ml di acqua e 2,1 ml di tampone Tris / HCl 1 M (pH 9). Regolare il pH a 7 e l'aliquota per la conservazione a -20 ° C.
2. Preparare un anestetico per gli zebrafish adulti mettendo 5 ml di tricicina (soluzione di riserva) in 100 ml di acqua di pesce (concentrazione finale di tricaina: 0,02%).
3. Trasferite uno zebrafish (da 3 a 6 mesi) dal suo serbatoio all'anestesia finché non si arresta.
4. RiSpostare il pesce usando una pipetta tagliata e asciugarla rapidamente su carta tissue assorbente.
5. Pesare il pesce.
6. Preparare una siringa di D-glucosio disciolta in 1X PBS e iniettare 50 μL di D-glucosio (2,5 g / kg di peso corporeo).
   NOTA: Ad esempio, un pesce da 0,6 g riceve 50 μL di soluzione D-glucosio / PBS al 3%.
7. Mettere il pesce sulla schiena e inserire l'ago della siringa nella cavità intraperitoneale.
8. Iniettare lentamente la soluzione D-glucosio / PBS e quindi posizionare i pesci nell'acqua.
9. Controllare i pesci finché non si riprende completamente. Rimetterlo al suo serbatoio fino a raggiungere il tempo richiesto per eseguire la misurazione del glucosio nel sangue.
   NOTA: Il glucosio nel sangue viene misurato 1,5 h dopo l'iniezione.

2. Stabilire un modello di iperglicemia cronica in Zebrafish

1. Preparare un serbatoio da 2 L di acqua di pesce pulita.
2. Sciogliere 40 g di D-glucosio nel 2 L di acqua di pesce per una concentrazione finale di D-glucosio di111 mM.
3. Immergere 5 - 7 zebrafish adulti nell'acqua contenente D-glucosio.
4. Sostituire l'acqua del pesce D-glucosio ogni due giorni per evitare la crescita di batteri o altri microrganismi.
5. Dopo 14 giorni di trattamento, mettere i pesci brevemente in acqua dolce per rimuovere il D-glucosio al di fuori del corpo prima di prendere la misurazione del livello di glucosio nel sangue.

3. Misurare i livelli di glucosio nel sangue di Zebrafish

1. Coprire il pesce con il ghiaccio per una rapida eutanasia.
   NOTA: Non utilizzare un sovradosaggio di tricaine, in quanto ciò induce ampie variazioni nei livelli di glucosio nel sangue. Non lasciare troppo tempo il pesce nel ghiaccio, in quanto questo causerà il coagulo del sangue.
2. Pulire il pesce con carta tissue assorbente per rimuovere tutta l'acqua e per evitare la diluizione del sangue durante la misurazione del glucosio nel sangue.
3. Rimuovere un occhio con pinze di dissezione e attendere che la cavità degli occhi sia piena di sangue.
4. Mettere una striscia di prova su un glucometer e iInserire la striscia nella cavità dell'occhio.
5. Misurare i livelli di glucosio nel sangue.

4. Analizzare la proliferazione delle cellule cerebrali dopo l'iperglicemia

1. Soluzioni e tamponi: requisiti e preparazione
   1. Preparare 1 L di 1x PBS aggiungendo 100 mL di 10x PBS a 900 mL di H 2O distillato (dH ₂ O) e mescolare.
   2. Preparare 1x PBS con detergente del 0,2% (PBS-T, vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Per preparare 1 L di PBS-T, aggiungere 2 mL di detergente (vedi tabella dei materiali ) a 1 L di PBS.
   3. Preparare una serie di etanolo (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% e 30%) e 0,85% NaCl.
   4. Preparare il buffer di blocco: PBS-T contenente 0,5% al ​​1% di latte in polvere.
      NOTA: Per preparare 200 mL di tampone di blocco, aggiungere 2 g di latte in polvere a 200 mL di PBST.
   5. Preparare il tampone di recupero di antigene, citrato di sodio.
      NOTA: Per preparare 1 l di tampone di citrato di sodio, aggiungere 2.94 g di sodio citrato triIl sale sodico deidrato a 1 L di dH ₂ 0. Regolare il pH a 6 prima del riempimento a 1 L.
   6. Preparare un 4% di paraformaldeide-PBS buffer, aggiungendo 4 g di paraformaldehide a 100 ml di 1x PBS. Scaldare sotto agitazione a 58-60 ° C fino a quando non si dissolve completamente.
2. Preparazione del campione per immunohistochemistry: fissazione e disidratazione
   1. Dopo aver misurato il livello di glucosio nel sangue, separare la testa dal corpo tagliando la testa dietro le gole.
      Nota: In alternativa, il cervello può essere estratto direttamente e congelato per altri esperimenti, come l'estrazione di mRNA.
   2. Fissare le teste durante la notte a 4 ° C in 4% di paraformaldeide disciolta in PBS (PFA-PBS).
   3. Il giorno dopo, lavare brevemente le teste in PBS.
   4. Disseccare con cautela il cervello con un microscopio. Sciacquare le testine fisse con PBS e utilizzare un ago per fissare una testa sotto un microscopio di dissezione. Rimuovere gli occhi e la parte superiore del cranio con le pinze. CarefuEstrarre il cervello e collocarlo in 1x PBS.
   5. Lavare successivamente il cervello fisso con 1x PBS per 30 minuti, 0,85% NaCl per 30 minuti, 70% EtOH / 0,85% NaCl (v / v) per 15 minuti, 70% EtOH per 15 minuti (due volte), 85% EtOH per 20 Min, 95% EtOH per 20 minuti e 100% EtOH per 20 minuti (due volte). Incubare per una notte in una soluzione finale di etanolo 100%.
      NOTA: I cervelli disidratati possono rimanere per diversi mesi in 100% EtOH a 4 ° C prima dell'involucro di paraffina.
3. Preparazione del campione per immunohistochemistry: preparazione del tessuto per l'embedding di paraffina
   1. Mettere il cervello in un piccolo bicchiere di vetro.
      NOTA: Non utilizzare un recipiente di plastica, in quanto il toluene può danneggiare alcune materie plastiche.
   2. Rimuovere l'etanolo e sostituirlo con toluene, in quanto il cervello deve essere totalmente recuperato da toluene. Eseguire due bagni di toluene di 30 minuti.
   3. Rimuovere il toluene e collocare il cervello in una cassetta di incorporazione. Mettere la cassetta chiusa in bicchieri di paraffina fuso a 58-60 ° C (30 minuti in ogni bicchiere di paraffina). Attivare la pinza a caldo. Alla fine dei bagni di paraffina, estrarre la cassetta e versare una paraffina liquida in uno stampo.
   4. Versare la paraffina fusa in uno stampo e posizionare il cervello dentro. Orientare il cervello usando le pinze di inclusione a riscaldamento, utilizzando l'orientamento anteroposteriore del cervello come guida. Lasciare che la paraffina si indurisca sulla parte di raffreddamento della macchina incorporatrice.
   5. Per motivi tecnici, posizionare il cervello lungo l'asse anteroposteriore. Dopo aver smontato il blocco di paraffina, tagliarlo e fissarlo su una cassetta, con la paraffina sciolta nell'orientamento appropriato per consentire la sezione trasversale.
   6. Inserire il blocco di paraffina nel braccio del microtomo. Tagliare le sezioni di spessore di 50 μm fino al raggiungimento del livello del campione cerebrale. Tagliare il blocco di paraffina per ottenere un trapezio e regolare lo spessore della sezionamento a 7 μm. Raccogliere i nastri di paraffina utilizzando pennelli e collocarli sul panno neroER. Tagliarle delicatamente ogni 3 o 4 sezioni.
   7. Mettere una diapositiva su una piastra riscaldante e coprirla con acqua dH ₂ O.
   8. Posizionare delicatamente i nastri tagliati sull'acqua. Rimuovere l'acqua con carta tissue assorbente quando i nastri di paraffina sono sufficientemente estesi / dispiegati. Rimuovere meccanicamente le ultime gocce. Rimuovere l'acqua dai vetrini e lasciarli asciugare per almeno 3 ore sulla piastra riscaldante a circa 30-40 ° C.
4. Procedura immunoistochimica
   1. Rimuovere la cera paraffina posizionando le sezioni in tre contenitori di xilene per 7 minuti ciascuno.
   2. Ridurre le sezioni inserendo le diapositive in due contenitori di 100% EtOH per 2 min ciascuno, seguiti da bagni di EtOH 95%, 85% EtOH, 70% EtOH e 30% EtOH per 30 s ciascuno. Infine, mettiamo brevemente le diapositive in dH ₂ O e due volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
   3. Eseguire il recupero di antigene incubando le sezioni in tampone di citrato in un forno a microonde (2 min a 500 W) fino a quandoIl tampone inizia a bollire. Lasciare scorrere le diapositive a temperatura ambiente per 15 minuti.
   4. Lavare tre volte in PBST, 5 minuti ciascuno, e bloccare le sezioni per 45 minuti in PBST contenente 1% di latte. Incubare durante la notte con anticorpi primari ( ad es. Anticumulo nucleare proliferante (PCNA) per la colorazione delle cellule proliferative; 1/100) diluito in tampone di blocco (PBST, 1% di latte).
   5. Lavare tre volte in PBST, 5 minuti ciascuno, e incubare le sezioni per 90 minuti con anticorpi secondari appropriati ( ad esempio , Alexa Fluor 488, 1/200), diluito nel buffer di blocco e con DAPI (1/500).
   6. Lavare tre volte in PBST, 5 minuti ciascuno, e montare le diapositive con supporto fluorescente (vedere la tabella dei materiali).
   7. Analizzare la colorazione utilizzando un epifluorescenza e / o un microscopio confocale.
   8. Quantificare la proliferazione delle cellule cerebrali su almeno tre sezioni successive di cervello di una regione di interesse in almeno tre distinteimals.
      NOTA: In alternativa, l'incorporazione del cervello può essere fatta in agarosio per procedere alla sezione di vibratomi e all'immunohistochemia libera di galleggiamento, come descritto in precedenza ²⁴ .
5. Studiare l'impatto dell'iperglicemia sui meccanismi di riparazione del cervello
   NOTA: In alternativa, l'indagine sulla riparazione del cervello in iperglicemia acuta e cronica può essere eseguita dopo ferite alla pugnalata del telencephalon, come descritto in precedenza ^{24 , 25 , 26} . Brevemente:
   1. Anestetizzare i zebrafish adulti con la tricaina.
   2. Posizionare il pesce sotto un microscopio di dissezione con luce.
   3. Tenere il pesce con una mano.
   4. Con l'altra mano, inserire una siringa da 30 G verticalmente attraverso il cranio nella regione mediale dell'emisfero telencefalo destro.
   5. Riporre il pesce in acqua fresca di pesce, acqua integrata con D-glucosio (111MM) o controllare l'acqua del pesce. Consentire al pesce di sopravvivere per 7 giorni dopo la lesione.
      NOTA: fare riferimento al passaggio 4 per il resto della procedura.

5. Imaging della biodisponibilità delle molecole radioelettriche mediante PET / CT in Zebrafish: Fluorodeossiglucosio ([18F] -FDG) per analizzare il metabolismo del glucosio

1. Preparare una siringa da 50 μL contenente 20 MBq di una soluzione salina di [18F] -FDG.
2. Posizionare la siringa dietro la schermatura di protezione delle radiazioni.
3. Anestetizzare un zebrafish adulto con tricaine.
4. Posizionare il pesce dietro una schermatura di protezione dalle radiazioni.
5. Iniettare [18F] -FDG nella cavità intraperitoneale. Pulire il sito di iniezione con un piccolo pezzo di carta tissue per impedire l'individuazione di residui [18F] -FDG che potrebbero fuoriuscire dal ventre del pesce.
6. Utilizzare un calibratore radioisotopo per misurare l'attività residua contenuta sulla siringa e il tessuto per calcolare l'esatta dose iniettabile.
7. Mettere il pesce su unEw, piccolo pezzo di tessuto assorbente imbevuto di tricaine e avvolgerlo delicatamente. Mettere il pesce con il tessuto assorbente sul letto dell'immagine PET / CT.
8. Inserire il letto nel sistema di imaging PET / CT e avviare l'acquisizione.
9. Procedere per condurre l'acquisizione PET / CT.
10. Al termine della procedura, posizionare il pesce in una piccola quantità di acqua fresca di pesce.
    NOTA: In alternativa, dopo l'iniezione [18F] -FDG, il pesce può essere riportato in una piccola quantità di acqua dolce per 10 minuti a 1 ora per facilitare la diffusione di [18F] -FDG prima di anestetizzare ancora il pesce per PET / CT.

Utilizzando le procedure descritte in questo articolo, l'iniezione intraperitoneale di D-glucosio (2,5 g / kg di peso corporeo) è stata eseguita su zebrafish adulti e ha portato ad un significativo aumento dei livelli di glucosio nel sangue 1,5 h dopo l'iniezione ( Figura 1A ). 24 h dopo iniezione, i livelli di glucosio nel sangue erano simili tra D-glucosio e pesci iniettati da PBS 12 . Per il trattamento cronico, i zebrafish sono stati immersi in acqua D-glucosio (111 mM) e sono diventati iperglicemici alla fine dei loro 14 giorni di trattamento ( Figura 1B ), come è stato precedentemente mostrato 12 , 22 .

Per studiare l'impatto della iperglicemia sulla proliferazione delle cellule cerebrali, l'immunohistochemia PCNA è stata eseguita sui cervelli della zebra dopo l'induzione di iperglicemia acuta e cronica. Sebbene ipergl. Acuta La icemia non ha influenzato la proliferazione delle cellule cerebrali 12 , l'iperglicemia cronica ha indotto una significativa diminuzione della proliferazione delle cellule staminali neurali lungo il ventricolo, come precedentemente mostrato da Dorsemans e colleghi (2016). Infatti, il numero di cellule PCNA-positive è stato ridotto nel sottopallio (Vv / Vd), nel pallio (Dm) e nelle regioni che circondano il recesso laterale e posteriore dell'ipotalamo caudale (LR / PR) ( Figura 2 ).

La neurogenesi indotta da lesioni è stata studiata anche dopo la lesione meccanica del telencephalon in iperglicemia acuta e cronica. Come precedentemente descritto dopo la lesione cerebrale in zebrafish, si è verificata una prima proliferazione parenchimale di cellule microgliali e oligodendrociti, seguita da una forte up-regolazione della proliferazione nello strato ventricolare 7 giorni dopo l'infortunio 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. L'iperglicemia acuta non ha modulato il passaggio iniziale della proliferazione nel parenchima del cervello, mentre la proliferazione delle cellule cerebrali compromessa da iperglicemia cronica lungo i ventricoli telencefali 7 giorni dopo l'infortunio ( Figura 3 ).

Il modello zebrafish è interessante anche per monitorare la biodistribuzione delle molecole radioattive usando l'imaging PET / CT. Qui, [18F] -FDG è stato iniettato intraperitonealmente in zebrafish adulti. Dopo 30 minuti, l'acquisizione PET / CT mostra che il glucosio è distribuito non solo al sito di iniezione, ma anche nella testa del pesce, compreso il cervello e lungo il midollo spinale ( Figura 4 ).

( A ) L'iniezione intraperitoneale di D-glucosio (2,5 g / kg di peso corporeo) comporta un significativo aumento dei livelli di glucosio nel sangue 1,5 h dopo l'iniezione (n = 3 ) ( B ) L'immersione di zebrafish in acqua D-glucosio (111 mM) per 14 giorni comporta un significativo aumento dei livelli di glucosio nel sangue (n = 15). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : L'iperglicemia cronica compromette la proliferazione delle cellule cerebrali dopo 14 giorni di trattamento. Le cellule proliferative sono etichettate in verde con un anticorpo PCNA. I nuclei cellulari vengono contratti con DAPI (blu). HYperglicemia riduce la proliferazione delle cellule cerebrali dopo 14 giorni di trattamento nel sottopallio ( A ), nel pallio ( B ) e nell'ipotalamo caudale attorno alla cavità laterale e posteriore del ventricolo ( C ). Barra di scala = 120 μm (A e B), 200 μm (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : La lesione della ferita del fegato del telencephalon regola la proliferazione cerebrale a 7 giorni dopo la lesione. ( A ) Schema di una sezione trasversale del telencefalo zebrafish al livello indicato nella sagittale superiore. Schema è stato preso dal atlante del cervello zebrafish 31 . Là D punti indicano le cellule proliferanti 32 , 33 . L'ago indica il sito della lesione. ( B ) PCNA (verde) immunohistochemistry 7 giorni dopo la lesione del cervello mostra una forte upregulation della proliferazione lungo il ventricolo del cervello nel telencephalon danneggiato. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Imaging PET / CT di [18F] -FDG (20 MBq iniettato) 30 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale. Le immagini rappresentative dell'immagine PET / CT mostrano un'ampia distribuzione di [18F] -FDG nel corpo del pesce zebra, tra cui la testa, il cervello e il midollo spinale.Files / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nessun potenziali conflitti di interesse sono stati resi noti.