Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un prodotto chimico sinapsi formato dalla connessione tra il terminale del motoneurone della fibra muscolare e l'assone del neurone di motore terminal. NMJ ha dimostrato di giocare un ruolo cruciale quando la comunicazione tra il nervo e del muscolo è alterata, come si verifica nell'invecchiamento o sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Come nervo e del muscolo di comunicare in modo bidirezionale^1,2, potendo misurare NMJ difetti separatamente da difetti muscolari può fornire nuove intuizioni loro interazione fisiopatologici. Infatti, questa valutazione funzionale può aiutare a valutare se le alterazioni morfologiche o biochimiche riducono neurotrasmissione funzionalità di segnalazione.

Il confronto della risposta contrattile del muscolo suscitato da stimolazione del nervo e la risposta del muscolo stesso evocata dalla stimolazione diretta della sua membrana è stata proposta come una misura indiretta di funzionalità NMJ. Infatti, dal neurotrasmissione di by-pass di stimolazione della membrana di segnalazione, eventuali differenze nelle due risposte contrattili possono essere attribuite ai cambiamenti nella giunzione neuromuscolare. Questo approccio è stato ampiamente proposto per ratti^3,4,5,6,7e utilizzato anche per raccogliere informazioni su mouse modelli^8,9,10,11,12.

Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per asportare e testare due preparati di nervo del muscolo, cioè i preparativi Soleo-sciatic e diaframma-frenico. Utilizzando un su misura software, abbiamo progettato un protocollo di test continuo che combina la misurazione di diversi parametri che caratterizzano la funzionalità del muscolo e NMJ, quindi ottenendo una valutazione completa del danno NMJ separatamente da quella del muscolo. In particolare, il protocollo di misura la forza di contrazione, la cinetica di muscolo, la curva di forza-frequenza per diretta e stimolazioni nervose, la neurotrasmissione guasto¹³ per un infornamento e le frequenze tetaniche e la fatica di intratetanic⁷.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della Sapienza Università di Roma-Unità di Istologia ed Embriologia Medica e sono stati eseguiti in conformità con l'attuale versione della Legge Italiana sulla Protezione degli Animali.

1. Set-up sperimentale

1. Set-up del sistema sperimentale composto da 1 attuatore/trasduttore, 2 stimolatori, 1 apparato muscolare in vitro, 1 bagno tissutale preparatorio, 1 elettrodo di aspirazione, 1 oscilloscopio digitale, 1 stereomicroscopio, 1 illuminatore a luce fredda, 1 scheda di acquisizione, 1 blocco connettore e un personal computer.
   NOTA: Qui il software di comando è stato programmato in LabView ed è stato progettato per garantire un'elevata flessibilità, precisione e ripetibilità delle stimolazioni. Per ogni stimolazione, l'utente può selezionare l'ampiezza, la frequenza, la durata dell'impulso e decidere se viene erogato alla membrana o attraverso il nervo. L'utente può anche selezionare la durata del periodo di riposo prima di ogni stimolazione.

2. Valutazioni delle proprietà contrattili NMJ dei muscoli soleo e diaframma

1. Riscaldamento del sistema
   1. Preparare il Krebs Ringer buffer¹⁴ e posizionarlo in un bagno dell'apparato di montaggio e nel bagno di tessuto preparatorio. Porre una piastra da 60 mm preparata con 4 ml di silicone nel bagno di tessuto preparatorio.
   2. Accendere il bagnomaria circolante e impostare la temperatura a 30 °C per il muscolo soleo e a 27 °C per il muscolo diaframma.
   3. Lasciare fluire la miscela 95% O₂ - 5% CO₂ in entrambi i bagni.
   4. Accendere l'attuatore/trasduttore e i due stimolatori a impulsi e impostare i valori di corrente a 300 mA per la stimolazione a membrana e a 5 mA per la stimolazione nervosa.
      NOTA: Il valore di corrente di 300 mA ha precedentemente dimostrato di non indurre alcuna contrazione significativa sui rami nervosi quando la D-tubocurarina viene aggiunta alla soluzione¹⁵. Il valore di corrente di 5 mA corrisponde alla quantità di corrente necessaria per stimolare il muscolo attraverso il nervo senza creare una sovrapposizione con la stimolazione di membrana indotta per mezzo della soluzione. Poiché la distanza tra l'elettrodo di aspirazione e il muscolo dipende dalla lunghezza del nervo, questo valore di corrente deve essere regolato attentamente prima di ogni esperimento, come descritto di seguito.
2. Dissezione del soleo e del diaframma
   1. Sacrificare il topo mediante lussazione cervicale per ridurre al minimo la sofferenza e asportare immediatamente i muscoli per il test come segue.
   2. Preparazione, dissezione e set-up soleo-sciatico
      1. Spruzzare etanolo al 70% sulla zampa del topo e rimuovere la pelle che copre la gamba. Praticare un'incisione nella parte superiore della gamba con un paio di forbici e poi tirare con decisione la pelle. Isolare il tendine d'Achille dalla tibia e poi tagliare il tendine d'Achille con un paio di forbici.
      2. Bloccare saldamente il tendine con un paio di pinze e tirare delicatamente il muscolo gastrocnemio insieme al soleo. Una volta esposto il tendine prossimale del soleo, taglia l'intero polpaccio con un paio di forbici tenendo ancora il tendine d'Achille. Posizionare immediatamente il campione di tessuto nel bagno di tessuto preparatorio.
      3. Posizionare il bagno preparatorio sotto lo stereomicroscopio e fissare il vitello alla capsula in silicone utilizzando perni in acciaio inossidabile di 0,20 mm di diametro. Usando un paio di pinze, bloccare il tendine prossimale del soleo e tirarlo delicatamente per esporre l'innervazione sciatica.
      4. Una volta che l'innervazione è esposta (Figura 1), rimuovere con cura il tessuto circostante per esporre circa 5 mm del nervo. Usa un paio di forbici sottili per tagliare il nervo. Mentre stringi saldamente il soleo sul tendine prossimale con un paio di pinze, tiralo di nuovo e asportalo tagliando il tendine d'Achille con un paio di forbici.
      5. Far passare un filo di nylon attraverso il foro del braccio di leva dell'attuatore/trasduttore. Crea un cappio all'estremità del filo e afferra il tendine d'Achille prima di tirare indietro il filo fino a quando il muscolo non raggiunge il bagno dell'apparecchio di montaggio. Clamp il tendine prossimale all'interno del morsetto fisso e legare il filo di nylon attorno al braccio di leva. Lascia che il muscolo si equilibri nella soluzione.
      6. Determinare la lunghezza ottimale iniziale (L₀).
         1. Per prima cosa, allunga il muscolo per precaricarlo a 10 mN (questo valore garantisce la massima forza di contrazione (in base all'esperienza)). Quindi, allungare delicatamente il muscolo per modificare il precarico e stimolarlo con una serie di impulsi singoli. La lunghezza ottimale si ottiene quando viene misurata la forza massima di contrazione.
   3. Preparazione, dissezione e set-up diaframma-frenico
      1. Spruzzare etanolo al 70% sulla pelle del topo. Rimuovere la pelle che copre il muscolo diaframma praticando un'incisione sullo sterno con un paio di forbici e tirando con decisione la pelle.
      2. Con un paio di forbici, tagliare l'addome orizzontalmente sotto lo sterno e rimuovere delicatamente l'intestino e gli organi con un paio di pinze. Usa un paio di forbici spesse per tagliare la colonna vertebrale.
      3. Tagliate le costine di circa 1 cm sopra lo sterno e procedete orizzontalmente. Rimuovere delicatamente gli organi esterni con un paio di pinze e tagliare la colonna vertebrale per ottenere un anello circolare di costole contenente il diaframma.
      4. Lavare il preparato in una pirofila contenente il tampone Krebs Ringer e poi inserirlo nella capsula in silicone all'interno del bagno di tessuto preparatorio, con la parte superiore rivolta verso l'alto e lo sterno rivolto in avanti.
      5. Utilizzando lo stereomicroscopio, rimuovere con cura i polmoni e gli organi rimanenti; il nervo frenico sarà visibile sul lato destro (Figura 2A).
      6. Tagliare le nervature in modo da lasciare un anello di circa 2 mm lungo tutto il diaframma.
      7. Utilizzando una pinza, fissare un perno in acciaio inossidabile di 0,20 mm di diametro sul tendine centrale del diaframma nel punto corrispondente all'innervazione del nervo frenico e un altro perno sulle costole sullo stesso asse per identificare la striscia del diaframma di interesse.
      8. Fissare due perni aggiuntivi sul tendine centrale e altri due perni sulle nervature su entrambi i lati della striscia selezionata per stendere il diaframma. Se necessario, pulire il nervo frenico dal tessuto connettivo circostante utilizzando una pinza.
      9. Usando una lama curva, tagliare il diaframma su entrambi i lati dell'innervazione per identificare una striscia tendine-muscolo-costola come mostrato in Figura 2B.
      10. Far passare un filo di nylon attraverso il foro del braccio di leva dell'attuatore/trasduttore. Creare un cappio all'estremità del filo e afferrare il tendine prima di tirare indietro il filo fino a quando il muscolo non raggiunge il bagno dell'apparecchio di montaggio.
      11. Clamp le nervature all'interno del morsetto fisso e legare il filo di nylon attorno al braccio di leva.
      12. Lasciare che il muscolo si equilibri nella soluzione e determinare la lunghezza ottimale iniziale (L0).
          1. Allungare il muscolo per precaricarlo a 5 mN. Allungare delicatamente il muscolo per modificare il precarico e stimolarlo con una serie di impulsi singoli. La lunghezza ottimale si ottiene quando viene misurata la forza massima di contrazione.

Figura 1 - Preparazione del nervo soleo-sciatico. Nervo soleo-sciatico durante l'intervento chirurgico per i test funzionali. Lo sciatico viene esposto utilizzando un paio di pinze. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 - Preparazione del nervo diaframma-frenico. L'immagine mostra una fase dell'escissione della preparazione del nervo diaframmenico (A) e la striscia da montare per i test funzionali (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Misurazione delle proprietà NMJ separatamente dalla contrattilità muscolare
   1. Impostare la migliore intensità di corrente per la stimolazione attraverso il nervo e verificare che gli impulsi di corrente erogati attraverso l'elettrodo di aspirazione non provochino la contrazione muscolare per diffusione di corrente nel bagno.
      1. Posizionare l'elettrodo di aspirazione vicino al muscolo e tirare il nervo verso l'interno. Aumentando delicatamente l'intensità di corrente (a partire da 5 mA), stimolare il muscolo con una serie di impulsi singoli. Il valore di corrente ottimale è determinato quando la forza di contrazione è massima.
      2. Spingere il nervo fuori dall'elettrodo ed erogare alcuni impulsi singoli. Assicurarsi che il muscolo non si contragga a causa della sovrapposizione con la stimolazione della membrana per mezzo della soluzione. Tira di nuovo il nervo.
   2. Avvia il programma e seleziona il file di input per eseguire il protocollo di test desiderato.
      NOTA: Il file di input include tutti i parametri di stimolazione necessari per eseguire l'intero protocollo. Sebbene la stessa struttura del protocollo venga utilizzata per i due muscoli, i parametri di stimolazione differiscono a seconda del protocollo riferito ai muscoli soleo o diaframma.
      1. Stimolazione del nervo soleo-sciatico (vedi Tabella 1)
         1. Utilizzare le seguenti larghezze di impulso per tutte le stimolazioni elettriche: 1,4 ms per la stimolazione del nervo sciatico e 0,1 ms per la stimolazione diretta del soleo. Il protocollo completo dura circa 65 minuti.
      2. Stimolazione del nervo diaframma-frenico (vedi Tabella 2)
         1. Utilizzare le seguenti larghezze di impulso per tutte le stimolazioni elettriche: 1,8 ms per la stimolazione del nervo frenico e 0,2 ms per la stimolazione diretta del diaframma. Il protocollo completo dura circa 55 minuti.
      3. Al termine del protocollo sperimentale, misurare la lunghezza e il peso umido del muscolo utilizzando un calibro analogico con una precisione di 0,05 mm e una bilancia di precisione con una precisione di 0,1 mg, rispettivamente.
         1. Calcola l'area della sezione trasversale (CSA) dividendo la massa muscolare per il prodotto della lunghezza ottimale delle fibre (L_f) e la densità del muscolo scheletrico dei mammiferi (1,06 mg/mm³)¹⁶.
            NOTA: L_f si ottiene moltiplicando L₀ per il rapporto lunghezza della fibra/lunghezza del muscolo (0,71 per il muscolo soleo¹⁶ e 1 per il muscolo del diaframma¹⁷).

Tabella 1 - Protocollo di stimolazione del nervo soleo-sciatico. La tabella elenca la sequenza di test che costituiscono il protocollo completo per l'analisi dei preparati del nervo soleo-sciatico.

Tabella 2 - Protocollo di stimolazione del nervo diaframma-frenico. La tabella elenca la sequenza di test che costituiscono il protocollo completo per il test delle preparazioni del nervo diaframma-frenico.

3. Analisi dei dati

NOTA: Alla fine del protocollo calcola tutti i parametri desiderati come segue.

1. Dalla stimolazione a impulsi singoli
   1. Calcola la forza di contrazione (mN; forza attiva massima generata durante la contrazione) e la forza di contrazione specifica (mN/mm²). Calcolalo sottraendo il valore di precarico iniziale alla forza massima generata dal muscolo. Calcola la forza di contrazione specifica come forza di contrazione divisa per il muscolo CSA.
   2. Calcola il tempo di picco della tensione (TTP) (ms) come il tempo che intercorre tra il rilascio dell'impulso e la forza di contrazione.
   3. Calcola il tempo di rilassamento dimezzato (1/2RT) (ms) come il tempo dalla forza di contrazione al 50% della forza di contrazione.
   4. Calcola dF/dt (mN/ms) come valore massimo della derivata della forza durante la fase contrattile.
   5. Calcola -dF/dt (mN/ms) come valore massimo della derivata della forza durante la fase di rilassamento.
2. Dalle stimolazioni con treno di impulsi
   1. Calcola la forza non fusa (mN) e la forza specifica non fusa (mN/mm²). Calcolalo sottraendo il valore di precarico iniziale alla forza massima generata dal muscolo. Calcola la forza specifica non fusa come la forza non fusa divisa per il muscolo CSA.
      NOTA: La forza non fusa è la forza attiva massima generata durante un treno di impulsi con una frequenza inferiore alla frequenza tetanica.
   2. Calcola la forza tetanica (mN) e la forza tetanica specifica (mN/mm2); la forza massima è la forza attiva massima generata durante un treno di impulsi erogato a frequenza tetanica. Calcolalo sottraendo il valore di precarico iniziale alla forza massima generata dal muscolo. Calcola la forza tetanica specifica come la forza tetanica divisa per il muscolo CSA.
   3. Calcola la curva forza-frequenza. Tracciare il valore della forza (o forza specifica) ottenuta per ogni stimolazione rispetto alla frequenza crescente della stimolazione. In genere, inizia con la stimolazione a impulsi singoli e termina con la frequenza tetanica.
3. Dai paradigmi della fatica
   1. Calcolare l'errore di neurotrasmissione (NF) come:
      
      dove MF è la diminuzione della forza a seguito della stimolazione muscolare e F è la diminuzione della forza a seguito della stimolazione nervosa, misurata sul primo treno di impulsi dopo la stimolazione muscolare.
   2. Calcola la fatica intratetanica (IF) come:
      
      dove F_lp è la forza generata dal muscolo all'ultimo impulso di stimolazione e F_m è la forza massima generata dal muscolo durante lo stesso treno di impulsi. Per quanto riguarda la stimolazione nervosa, calcolare l'affaticamento intratetanico sul primo treno di impulsi subito dopo la stimolazione diretta.

4. Analisi statistica

NOTA: I modelli di analisi statistica devono essere scelti in base al fatto che la risposta muscolare alle stimolazioni nervose e di membrana venga confrontata all'interno dello stesso modello animale o tra 2 diversi modelli animali^18,19.

1. Utilizzare il test t di Student per TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt se si confrontano solo le risposte muscolari con stimolazioni dirette e indirette. Se si confrontano preparazioni muscolari ottenute da 2 diversi ceppi di topo, utilizzare l'ANOVA a 2 vie con il tipo di stimolazione e il ceppo del topo come fattori fissi. Quando l'ANOVA a 2 vie restituisce un risultato significativo, utilizzare più test di confronto per cercare le differenze statistiche.
2. Per la curva forza-frequenza (se si confrontano solo le risposte muscolari con le stimolazioni dirette e indirette), utilizzare l'ANOVA a 2 vie con il tipo di stimolazione e la frequenza di stimolazione come fattori fissi. Se necessario, utilizzare più test di confronto.
   1. Se si confrontano i preparati muscolari ottenuti da 2 diversi ceppi di topo, utilizzare l'ANOVA a 3 vie con il tipo di stimolazione, la frequenza di stimolazione e la tensione del topo come fattori fissi.
      1. Quando l'ANOVA a 3 vie produce un effetto significativo dei fattori di tensione animale e tipo di stimolazione, utilizzare l'ANOVA a 2 vie per identificare differenze significative tra 2 gruppi alla volta. Ad esempio, è possibile valutare le differenze tra la risposta muscolare dei 2 gruppi alla stimolazione di membrana o tra la risposta muscolare alle stimolazioni dirette e indirette all'interno di un gruppo.
3. Affaticamento intratetanico
   NOTA: Poiché il protocollo è stato progettato per indurre affaticamento in risposta alla stimolazione nervosa anche nei topi di controllo, questo parametro può essere utilizzato solo per studiare le differenze tra 2 ceppi di topi e un'analisi statistica all'interno di un singolo gruppo produrrebbe sempre differenze significative.
   1. Per confrontare due gruppi, utilizzare l'ANOVA a 3 vie con il tipo di stimolazione, il tempo e la deformazione del topo come fattori fissi. Quando l'ANOVA a 3 vie produce un effetto significativo dei fattori di tensione animale e tipo di stimolazione, utilizzare l'ANOVA a 2 vie per identificare differenze significative tra 2 gruppi alla volta, come per la curva forza-frequenza.
4. Per il fallimento della neurotrasmissione, utilizzare l'ANOVA a 2 vie con la tensione e il tempo dell'animale come fattori fissi. Se restituisce risultati significativi, utilizzare più test di confronto per cercare le differenze statistiche.
   NOTA: Poiché questo parametro restituisce un solo valore per ogni ceppo di topo, consente di confrontare diversi modelli di topo.
5. Per il peso, la lunghezza e la CSA muscolare, utilizzare il test t di Student per indagare le differenze quando si confrontano le preparazioni muscolo-nervose di diversi modelli animali.

Il protocollo che abbiamo descritto fornisce informazioni su denervazione funzionale in diverse malattie neuromuscolari o invecchiamento-sarcopenia. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se (e, in caso affermativo, a quale livello) le alterazioni muscolari sono dovuti a cambiamenti selettivi che si verificano nel muscolo stesso o nella trasmissione neuromuscolare. I dati riportati qui sotto sono i risultati di un precedente lavoro di nostro gruppo18, condotto sul modello di topo transgenico SOD1G93A della sclerosi laterale amiotrofica presso lo stadio finale della malattia20. Il topo transgenico SOD1G93A overexpresses ubiquistmente il mutante antiossidante degli enzimi superossido dismutasi 1 (SOD1). Figure 3 e 4 mostrano i valori di forza tetanica per il nervo sciatico Soleo (a sinistra) e per le preparazioni del nervo frenico a diaframma (a destra) e dF/dt. Questi risultati dimostrano la capacità della tecnica qui proposta per rilevare i difetti funzionali in muscoli transgenici che riguardano NMJ al contrario di quelle strettamente legate al muscolo stesso. Infatti, per entrambi dF/dt e forza tetanica, i muscoli soleo SOD1G93A visualizzata una ridotta risposta contrattile, rispetto al muscolo di controllo, quando direttamente stimolato e visualizzata un'ulteriore riduzione quando stimolato tramite il nervo. Al contrario, lievi alterazioni sono state osservate in questi due parametri quando strisce del muscolo diaframma sono stati stimolati attraverso la membrana, mentre le alterazioni significative sono state rilevate quando il muscolo del diaframma è stato stimolato attraverso il nervo.

Figura 3 - Cinetica contrattile. Media ± SEM di dF/dt per le preparazioni Soleo (A) e diaframma (B). Gli esemplari Soleo visualizzato un significativo rallentamento giù quando direttamente stimolato (-27%) e una diminuzione ulteriore quando stimolato tramite il nervo (-58%). Esemplari di diaframma visualizzato un rallentamento solo quando stimolato tramite il nervo (-30%). Adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 - Forza tetanica. Media ± SEM di tetanica force specifica per le preparazioni Soleo (A) e diaframma (B). Gli esemplari Soleo visualizzato un significativo rallentamento giù quando direttamente stimolato (-26%) e una diminuzione ulteriore quando stimolato tramite il nervo (-50%). Esemplari di diaframma ha visualizzato una diminuzione di forza solo quando stimolato tramite il nervo (-44%). Adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La valutazione della fatica di intratetanic e di neurotrasmissione fallimento ha permesso di misurare i parametri specifici NMJ. La figura 5 Mostra i valori medi della fatica intratetanic (se) misurata durante il paradigma di affaticamento tetanica per muscoli soleo (Figura 5A) e diaframma strisce (figura 5B). Come riportato nella sezione protocollo, il paradigma di affaticamento che abbiamo applicato è stato sviluppato in modo da sottolineare le NMJ però non il muscolo. Di conseguenza, se misurata per la stimolazione muscolare diretto mai è stata alterata. Infatti, se calcolato per la stimolazione del nervo è il parametro che deve essere considerato per i confronti tra diversi ceppi di topi diversi. I nostri risultati indicano che il se era significativamente più basso in transgenico soleo e muscoli del diaframma rispetto negli omologhi controllo. Questa differenza era maggiore nel diaframma, in cui è stato rilevato un difetto piccolo muscolo, e minore nel Soleo, in cui danno muscolare significativa aveva già misurato. Da tener presente che, poiché il muscolo soleo transgenico è stato significativamente danneggiato, la valutazione di NMJ solo era corretta per fino a 8 min di stimolazione, che è il tempo che necessario per il muscolo transgenico restituire il valore null di forza quando stimolati. Soleo transgenico se valori dopo 8 min di stimolazione fondamentalmente express rumore.

Figura 5 - Fatica intratetanic. Intratetanic fatica per muscoli soleo (A) e diaframma (B) visualizzato una diminuzione significativa nella funzionalità di NMJ transgenici. I valori sono la media ± SEM. adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 Mostra il fallimento di neurotrasmissione alla frequenza tetanica misurata nel Soleo (Figura 6A) e campioni di membrana (Figura 6B). In linea con i risultati se, nessun difetto nella neurotrasmissione è stato rilevato nel muscolo soleo, mentre gli esemplari del muscolo diaframma visualizzato un aumento significativo nella affaticabilità della giunzione neuromuscolare.

Figura 6 -Errore di neurotrasmissione. Neurotrasmissione guasto non ha visualizzato tutte le alterazioni in muscoli soleo (A), mentre ha evidenziato una diminuzione significativa nella funzionalità di NMJ in transgenici diaframma strisce (B). I valori sono la media ± SEM. adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.