Method Article

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

DOI:

10.3791/55227

⸱

August 6th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funzionalità della giunzione neuromuscolare (NMJ) svolge un ruolo fondamentale nello studio di malattie in cui la comunicazione tra il motoneurone e il muscolo è alterata, come invecchiamento e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Qui descriviamo un protocollo sperimentale che può essere utilizzato per misurare la funzionalità NMJ combinando due tipi di stimolazione elettrica: diretta stimolazione della membrana muscolare e la stimolazione attraverso il nervo. Il confronto della risposta muscolare a queste due diverse stimolazioni può aiutare a definire, a livello funzionale, potenziali alterazioni nella giunzione neuromuscolare che portano al declino funzionale nel muscolo.

Preparazioni dix vivo E sono adatti a studi ben controllati. Qui descriviamo un protocollo intensivo per misurare diversi parametri del muscolo e funzionalità NMJ per la preparazione del nervo sciatico soleo e per la preparazione del nervo frenico a membrana. Il protocollo dura circa 60 min e viene condotta ininterrottamente per mezzo di un su misura software che misura le proprietà di cinetica di contrazione, il rapporto di forza-frequenza per stimolazioni del nervo e del muscolo e due parametri specifici per funzionalità NMJ, cioè la neurotrasmissione guasto e la fatica intratetanic. Questa metodologia è stata utilizzata per rilevare danni nelle preparazioni di nervo del muscolo soleo e diaframma utilizzando mouse transgenico SOD1G93A , un modello sperimentale di ALS che overexpresses ubiquistmente il mutante antiossidante degli enzimi superossido dismutasi 1 (SOD1).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un prodotto chimico sinapsi formato dalla connessione tra il terminale del motoneurone della fibra muscolare e l'assone del neurone di motore terminal. NMJ ha dimostrato di giocare un ruolo cruciale quando la comunicazione tra il nervo e del muscolo è alterata, come si verifica nell'invecchiamento o sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Come nervo e del muscolo di comunicare in modo bidirezionale1,2, potendo misurare NMJ difetti separatamente da difetti muscolari può fornire nuove intuizioni loro interazione fisiopatologici. Infatti, questa valutazione funzionale può aiutare ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della Sapienza Università di Roma-Unità di Istologia ed Embriologia Medica e sono stati eseguiti in conformità con l'attuale versione della Legge Italiana sulla Protezione degli Animali.

1. Set-up sperimentale

  1. Set-up del sistema sperimentale composto da 1 attuatore/trasduttore, 2 stimolatori, 1 apparato muscolare in vitro, 1 bagno tissutale preparatorio, 1 elettrodo di aspirazione, 1 oscilloscopio digitale, 1 stereomicroscopio, 1 illuminatore a luce fredda, 1 scheda di acquisizione, 1 blocco connettore e un personal computer.
    NOTA: Qui il s....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo che abbiamo descritto fornisce informazioni su denervazione funzionale in diverse malattie neuromuscolari o invecchiamento-sarcopenia. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se (e, in caso affermativo, a quale livello) le alterazioni muscolari sono dovuti a cambiamenti selettivi che si verificano nel muscolo stesso o nella trasmissione neuromuscolare. I dati riportati qui sotto sono i risultati di un precedente lavoro di nostro gruppo18

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo sperimentale descritto sopra fornisce un modo ideale di misurazione e discriminare eventuali alterazioni funzionali che si sono verificati direttamente nel muscolo o indirettamente a livello della giunzione neuromuscolare. Poiché questa tecnica è basata su una misura indiretta di funzionalità NMJ, non può essere utilizzato per stabilire se qualsiasi difetto è correlato a cambiamenti morfologici o cambiamenti biochimici. Al contrario, fornisce un modo efficace di determinare se eventuali alterazioni morfolog.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lavoro in laboratorio degli autori è stato sostenuto dalla Fondazione Roma e Telethon (grant no. GGP14066).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema di leve a doppia modalità Aurora Scientifica Inc.Attuatore/trasduttore300B
Stimolatore bifase ad alta potenza Aurora Scientifica Inc.Stimolatore a impulsi 701B(nervo)
Stimolatore bifase ad alta potenza Aurora Scientifica Inc.Stimolatoredi impulsi 701C (muscolo)
Apparato muscolare in vitro Aurora Scientifica Inc.800A
Bagno di tessuto preparatorioRadnoti158400
Elettrodo di aspirazione monopolareA-M Systems573000con un riferimento fatto in casa 
Oscilloscopio TektronixTDS2014
StereomicroscopioNikonSMZ 800
Illuminatore a luce fredda Scheda di acquisizione Photonic OpticsPL 3000
National InstrumentsNI PCIe-6353
Blocco connettoreNational InstrumentsNI 2110
Personal computerAMD Phenom II x4 970Processore 3.50 Ghz con software Windows 7
LabView 2012National Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonato Tampone Sigma-AldrichK4002 tampone fisiologico
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761 
Cloruro di calcio CaCl2Sigma-AldrichC4901anidro, polvere, ≥ 97%
Tampone HEPESSigma-AldrichH3375≥ 99,5% (titolazione)
Piatti 60 mm x 15 mmFalcon353004Polistirene
SiliconeSylgard 184 Silicone Kit elastomero  0,5Kg.
TermostatoDennerleDigitalDuomat 1200
PompaNewa MiniMN 606per acquario
Resistenza al calore Cavo termicoLucky Reptile61403-150/60Hz 50W
Secchioqualsiasi 10 litriPolipropilene
O2 + 5%CO2siadMix gas
#5 Pinze Fine Science Tools11252-202 pezzi
Forbici a molla - Lame da 8 mmFine Science Tools15024-10escissione nervosa
Forbici affilate Strumenti di Fine Science 14059-11rimozione muscolare
Forbici delicateWagner02.06.32esterno dell'animale
Studente Bisturi Manico #3Strumenti di Fine Science91003-12 
Lame per bisturi #10Strumenti per la scienza fine 10010-00
Lame per bisturi #11Strumenti per la scienza fine 10011-00
filo di nylon & Oslash; 0,16 mmqualsiasi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

Related Articles