Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.
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Articolo metodologico
Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Funzionalità della giunzione neuromuscolare (NMJ) svolge un ruolo fondamentale nello studio di malattie in cui la comunicazione tra il motoneurone e il muscolo è alterata, come invecchiamento e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Qui descriviamo un protocollo sperimentale che può essere utilizzato per misurare la funzionalità NMJ combinando due tipi di stimolazione elettrica: diretta stimolazione della membrana muscolare e la stimolazione attraverso il nervo. Il confronto della risposta muscolare a queste due diverse stimolazioni può aiutare a definire, a livello funzionale, potenziali alterazioni nella giunzione neuromuscolare che portano al declino funzionale nel muscolo.
Preparazioni dix vivo E sono adatti a studi ben controllati. Qui descriviamo un protocollo intensivo per misurare diversi parametri del muscolo e funzionalità NMJ per la preparazione del nervo sciatico soleo e per la preparazione del nervo frenico a membrana. Il protocollo dura circa 60 min e viene condotta ininterrottamente per mezzo di un su misura software che misura le proprietà di cinetica di contrazione, il rapporto di forza-frequenza per stimolazioni del nervo e del muscolo e due parametri specifici per funzionalità NMJ, cioè la neurotrasmissione guasto e la fatica intratetanic. Questa metodologia è stata utilizzata per rilevare danni nelle preparazioni di nervo del muscolo soleo e diaframma utilizzando mouse transgenico SOD1G93A , un modello sperimentale di ALS che overexpresses ubiquistmente il mutante antiossidante degli enzimi superossido dismutasi 1 (SOD1).
Introduzione
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un prodotto chimico sinapsi formato dalla connessione tra il terminale del motoneurone della fibra muscolare e l'assone del neurone di motore terminal. NMJ ha dimostrato di giocare un ruolo cruciale quando la comunicazione tra il nervo e del muscolo è alterata, come si verifica nell'invecchiamento o sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Come nervo e del muscolo di comunicare in modo bidirezionale1,2, potendo misurare NMJ difetti separatamente da difetti muscolari può fornire nuove intuizioni loro interazione fisiopatologici. Infatti, questa valutazione funzionale può aiutare a valutare se le alterazioni morfologiche o biochimiche riducono neurotrasmissione funzionalità di segnalazione.
Il confronto della risposta contrattile del muscolo suscitato da stimolazione del nervo e la risposta del muscolo stesso evocata dalla stimolazione diretta della sua membrana è stata proposta come una misura indiretta di funzionalità NMJ. Infatti, dal neurotrasmissione di by-pass di stimolazione della membrana di segnalazione, eventuali differenze nelle due risposte contrattili possono essere attribuite ai cambiamenti nella giunzione neuromuscolare. Questo approccio è stato ampiamente proposto per ratti3,4,5,6,7e utilizzato anche per raccogliere informazioni su mouse modelli8,9,10,11,12.
Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per asportare e testare due preparati di nervo del muscolo, cioè i preparativi Soleo-sciatic e diaframma-frenico. Utilizzando un su misura software, abbiamo progettato un protocollo di test continuo che combina la misurazione di diversi parametri che caratterizzano la funzionalità del muscolo e NMJ, quindi ottenendo una valutazione completa del danno NMJ separatamente da quella del muscolo. In particolare, il protocollo di misura la forza di contrazione, la cinetica di muscolo, la curva di forza-frequenza per diretta e stimolazioni nervose, la neurotrasmissione guasto13 per un infornamento e le frequenze tetaniche e la fatica di intratetanic7.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Università Sapienza di Roma—Unità di Istologia ed Embriologia Medica e sono stati eseguiti in conformità con la versione vigente della legge italiana sulla protezione degli animali.
1. Impostazione sperimentale
- Configurare il sistema sperimentale composto da 1 attuatore/trasduttore, 2 stimolatori, 1 apparato muscolare in-vitro, 1 bacinella preparatoria per tessuti, 1 elettrodo a suggione, 1 oscilloscopio digitale, 1 stereomicroscopio, 1 illuminatore a luce fredda, 1 scheda di acquisizione, 1 blocco connettore e un computer personale.
NOTA: In questo caso, il software di controllo è stato programmato in LabView ed è stato progettato per garantire elevata flessibilità, accuratezza e ripetibilità delle stimolazioni. Per ogni stimolazione, l'utente può selezionare la larghezza dell'impulso, la frequenza, la durata e decidere se la stimolazione viene applicata alla membrana o attraverso il nervo. L'utente può inoltre selezionare la durata del periodo di riposo prima di ogni stimolazione.
2. Valutazione delle proprietà contrattili della giunzione neuromuscolare dei muscoli soleo e diaframma
- Avvio del sistema
- Preparare il buffer di Krebs Ringer14 e posizionarlo in un bagno dell'apparato di montaggio e nel bagno tissutale preparatorio. Posizionare una capsula da 60 mm preparata con 4 ml di silicone nel bagno tissutale preparatorio.
- Accendere il bagno a circolazione d'acqua e impostare la temperatura a 30 °C per il muscolo soleo e a 27 °C per il muscolo diaframma.
- Far fluire una miscela di 95% O2 - 5% CO2 in entrambi i bagni.
- Accendere l'attuatore/trasduttore e i due stimolatori a impulsi e impostare i valori di corrente a 300 mA per la stimolazione della membrana e a 5 mA per la stimolazione del nervo.
NOTA: È stato precedentemente dimostrato che il valore di corrente di 300 mA non induce alcuna contrazione significativa sui rami nervosi quando si aggiunge D-tubocurarina alla soluzione15. Il valore di corrente di 5 mA corrisponde alla quantità necessaria per stimolare il muscolo attraverso il nervo senza sovrapposizioni con la stimolazione della membrana indotta mediante la soluzione. Poiché la distanza tra l'elettrodo a suggizione e il muscolo dipende dalla lunghezza del nervo, questo valore di corrente deve essere accuratamente regolato prima di ogni esperimento, come descritto di seguito.
- Dissezione del soleo e del diaframma
- Sacrificare il topo mediante dislocazione cervicale per minimizzare la sofferenza e prelevare immediatamente i muscoli per l'analisi come segue.
- Preparazione, dissezione e allestimento del soleo-sciatico
- Spruzzare etanolo al 70% sulla zampa del topo ed eliminare la pelle che la ricopre. Praticare un'incisione nella parte superiore della zampa con un paio di forbici, quindi tirare con fermezza la pelle. Isolare il tendine d'Achille dalla tibia e successivamente recidere il tendine d'Achille con un paio di forbici.
- Stringere saldamente il tendine con un paio di pinze ed estrarre delicatamente il muscolo gastrocnemio insieme al soleo. Una volta esposto il tendine prossimale del soleo, recidere l'intero polpaccio con un paio di forbici mantenendo ancora il tendine d'Achille. Posizionare immediatamente il campione tissutale nel bagno tissutale preparatorio.
- Posizionare il bagno preparatorio sotto il microscopio stereoscopico e fissare il polpaccio alla capsula di silicone utilizzando perni in acciaio inossidabile di diametro 0,20 mm. Con un paio di pinze, afferrare il tendine prossimale del soleo ed estrarlo delicatamente per esporre l'innervazione sciatica.
- Una volta esposta l'innervazione (Figura 1), rimuovere con attenzione i tessuti circostanti per esporre circa 5 mm di nervo. Usare un paio di forbici fini per recidere il nervo. Mentre si tiene saldamente il soleo dal tendine prossimale con un paio di pinze, estrarlo nuovamente e asportarlo recidendo il tendine d'Achille con un paio di forbici.
- Fare passare un filo di nylon attraverso il foro del braccio leva dell'attuatore/trasduttore. Creare un cappio all'estremità del filo e afferrare il tendine d'Achille prima di tirare indietro il filo finché il muscolo non raggiunge il bagno dell'apparato di montaggio. Fissare il tendine prossimale nella pinza fissa e legare il filo di nylon intorno al braccio leva. Lasciare che il muscolo si equilibri nella soluzione.
- Determinare la lunghezza ottimale iniziale (L0).
- Prima di tutto, stirare il muscolo per pre-caricarlo a 10 mN (questo valore garantisce la massima forza di scatto, basato sull'esperienza). Successivamente, stirare delicatamente il muscolo per modificare il pre-carico e stimolarlo con una serie di impulsi singoli. La lunghezza ottimale si ottiene quando si misura la massima forza di scatto.
- Preparazione, dissezione e allestimento del diaframma-frenico
- Spruzzare etanolo al 70% sulla pelle del topo. Rimuovere la pelle che ricopre il muscolo diaframma praticando un'incisione sopra lo sterno con un paio di forbici e tirando con fermezza la pelle.
- Con un paio di forbici, recidere orizzontalmente l'addome al di sotto dello sterno ed estrarre delicatamente l'intestino e gli organi con un paio di pinze. Usare un paio di forbici robuste per recidere la colonna vertebrale.
- Recidere le costole a circa 1 cm sopra lo sterno e procedere orizzontalmente. Rimuovere delicatamente gli organi esterni con un paio di pinze e recidere la colonna vertebrale per ottenere un anello circolare di costole contenente il diaframma.
- Lavare il preparato in una capsula contenente il buffer di Krebs Ringer, quindi posizionarlo nella capsula di silicone all'interno del bagno tissutale preparatorio, con il lato superiore rivolto verso l'alto e lo sterno rivolto in avanti.
- Utilizzando il microscopio stereoscopico, rimuovere con attenzione i polmoni e gli organi residui; il nervo frenico sarà visibile sul lato destro (Figura 2A).
- Tagliare le costole in modo da lasciare un anello di circa 2 mm lungo tutto il perimetro del diaframma.
- Utilizzando le pinze, fissare un perno in acciaio inossidabile di diametro 0,20 mm al tendine centrale del diaframma nel punto corrispondente all'innervazione del nervo frenico e un altro perno sulle costole lungo lo stesso asse per identificare la striscia di diaframma di interesse.
- Fissare altri due perni sul tendine centrale e altri due sulle costole ai lati della striscia selezionata per distendere il diaframma. Se necessario, pulire il nervo frenico dai tessuti connettivi circostanti utilizzando le pinze.
- Utilizzando una lama curva, recidere il diaframma ai lati dell'innervazione per identificare una striscia tendine-muscolo-costola come mostrato in Figura 2B.
- Fare passare un filo di nylon attraverso il foro del braccio leva dell'attuatore/trasduttore. Creare un cappio all'estremità del filo e afferrare il tendine prima di tirare indietro il filo finché il muscolo non raggiunge il bagno dell'apparato di montaggio.
- Fissare le costole nella pinza fissa e legare il filo di nylon intorno al braccio leva.
- Lasciare che il muscolo si equilibri nella soluzione e determinare la lunghezza ottimale iniziale (L0).
- Stirare il muscolo per pre-caricarlo a 5 mN. Stirare delicatamente il muscolo per modificare il pre-carico e stimolarlo con una serie di impulsi singoli. La lunghezza ottimale si ottiene quando si misura la massima forza di scatto.
Figura 1 - Preparazione del nervo sciatrico-solleo. Nervo sciatrico-solleo durante l'intervento chirurgico per i test funzionali. Il nervo sciatrico viene esposto utilizzando una coppia di pinzette. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2 - Preparazione del diaframma con il nervo frenico. L'immagine mostra una fase dell'escissione della preparazione del diaframma con il nervo frenico (A) e la striscia da montare per i test funzionali (B). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Misurazione delle proprietà della giunzione neuromuscolare separatamente dalla contrattilità muscolare
- Impostare l'intensità di corrente ottimale per la stimolazione attraverso il nervo e verificare che gli impulsi di corrente erogati tramite l'elettrodo a suggente non provochino la contrazione muscolare a causa della dispersione della corrente nel bagno.
- Posizionare l'elettrodo a suggente vicino al muscolo ed introdurre il nervo all'interno. Aumentando gradualmente l'intensità di corrente (a partire da 5 mA), stimolare il muscolo con una serie di singoli impulsi. Il valore ottimale di corrente viene determinato quando la forza del singolo scatto (twitch) è massima.
- Estrarre il nervo dall'elettrodo ed erogare alcuni singoli impulsi. Assicurarsi che il muscolo non contragga a causa di un sovrapposizione con la stimolazione della membrana tramite la soluzione. Reintrodurre nuovamente il nervo all'interno dell'elettrodo.
- Avviare il programma e selezionare il file di input per eseguire il protocollo di prova desiderato.
NOTA: Il file di input contiene tutti i parametri di stimolazione necessari per eseguire l'intero protocollo. Sebbene la stessa struttura di protocollo venga utilizzata per i due muscoli, i parametri di stimolazione differiscono a seconda che il protocollo si riferisca ai muscoli soleo o diaframma.- Stimolazione del nervo sciatico-muscolo soleo (vedere Tabella 1)
- Utilizzare le seguenti durate degli impulsi per tutte le stimolazioni elettriche: 1,4 ms per la stimolazione del nervo sciatico e 0,1 ms per la stimolazione diretta del soleo. L'intero protocollo dura circa 65 minuti.
- Stimolazione del nervo frenico-diaframma (vedere Tabella 2)
- Utilizzare le seguenti durate degli impulsi per tutte le stimolazioni elettriche: 1,8 ms per la stimolazione del nervo frenico e 0,2 ms per la stimolazione diretta del diaframma. L'intero protocollo dura circa 55 minuti.
- Al termine del protocollo sperimentale, misurare la lunghezza e il peso fresco del muscolo utilizzando un calibro analogico con precisione di 0,05 mm e una bilancia analitica con precisione di 0,1 mg, rispettivamente.
- Calcolare l'area della sezione trasversale (CSA) dividendo la massa muscolare per il prodotto tra la lunghezza ottimale della fibra (Lf) e la densità del muscolo scheletrico dei mammiferi (1,06 mg/mm3)16.
NOTA: Lf si ottiene moltiplicando L0 per il rapporto tra lunghezza della fibra e lunghezza del muscolo (0,71 per il muscolo soleo16 e 1 per il muscolo diaframma17).
- Calcolare l'area della sezione trasversale (CSA) dividendo la massa muscolare per il prodotto tra la lunghezza ottimale della fibra (Lf) e la densità del muscolo scheletrico dei mammiferi (1,06 mg/mm3)16.
- Stimolazione del nervo sciatico-muscolo soleo (vedere Tabella 1)
- Impostare l'intensità di corrente ottimale per la stimolazione attraverso il nervo e verificare che gli impulsi di corrente erogati tramite l'elettrodo a suggente non provochino la contrazione muscolare a causa della dispersione della corrente nel bagno.
| Tipo di esperimento | Frequenza | Durata | Ripetizioni | Stimolazione muscolare o nervosa | Scopo |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Muscolo | Forza e cinetica della contrazione singola | |
| Riposo | 30 | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Nervo | ||
| Riposo | 30 | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Muscolo | ||
| Riposo | 30 | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Nervo | ||
| Riposo | 120 | ||||
| Tetano incompleto | 40 | 0,8 | 1 | Nervo | Curve forza/frequenza per stimolazioni nervose e muscolari |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 60 | 0,8 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano completo | 80 | 0,8 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 20 | 0,8 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 60 | 0,8 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano completo | 80 | 0,8 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 20 | 0,8 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 40 | 0,8 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 300 | ||||
| Paradigma di affaticamento | 35 | 0,8 | 1 stimolazione muscolare seguita da 14 stimolazioni nervose con un tempo di riposo di 1,2 s ciascuna, ripetuta 20 volte | Insufficienza della trasmissione neuro-muscolare (NF) | |
| Riposo | 900 | ||||
| Paradigma di affaticamento | 80 | 0,8 | 1 stimolazione muscolare seguita da 14 stimolazioni nervose con un tempo di riposo di 1,2 s ciascuna, ripetuta 20 volte | Insufficienza della trasmissione neuro-muscolare (NF) e affaticamento intratetanico (IF) | |
Tabella 1 - Protocollo di stimolazione del nervo sciatrico-solenoide. La tabella elenca la sequenza di test che costituiscono il protocollo completo per la valutazione dei preparati del nervo sciatrico-solenoide.
| Tipo di esperimento | Frequenza | Durata | Ripetizioni | Stimolazione muscolare o nervosa | Scopo |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Muscolo | Forza e cinetica della contrazione singola | |
| Riposo | 30 | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Nervo | ||
| Riposo | 30 | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Muscolo | ||
| Riposo | 30 | ||||
| Contrazione singola | Impulso singolo | 1 | Nervo | ||
| Riposo | 120 | ||||
| Tetano incompleto | 60 | 0,5 | 1 | Nervo | Curve forza/frequenza per stimolazioni nervose e muscolari |
| Riposo | 120 | ||||
| Tetano completo | 100 | 0,5 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 40 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 120 | ||||
| Tetano incompleto | 20 | 0,5 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 120 | ||||
| Tetano incompleto | 80 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 150 | ||||
| Tetano incompleto | 80 | 0,5 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 150 | ||||
| Tetano incompleto | 20 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 120 | ||||
| Tetano completo | 100 | 0,5 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 150 | ||||
| Tetano completo | 100 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Riposo | 180 | ||||
| Tetano incompleto | 60 | 0,5 | 1 | Muscolo | |
| Riposo | 300 | ||||
| Paradigma di affaticamento | 35 | 0,33 | 1 stimolazione muscolare seguita da 14 stimolazioni nervose con un tempo di riposo di 0,67 s ciascuna, ripetuta 20 volte | Insufficienza della trasmissione neuro-muscolare (NF) | |
| Riposo | 900 | ||||
| Paradigma di affaticamento | 80 | 0,33 | 1 stimolazione muscolare seguita da 14 stimolazioni nervose con un tempo di riposo di 0,67 s ciascuna, ripetuta 20 volte | Insufficienza della trasmissione neuro-muscolare (NF) e affaticamento intratetanico (IF) | |
Tabella 2 - Protocollo di stimolazione del nervo frenico-diaframma. La tabella elenca la sequenza di test che costituiscono il protocollo completo per la valutazione dei preparati del nervo frenico-diaframma.
3. Analisi dei dati
NOTA: Alla fine del protocollo, calcolare tutti i parametri desiderati come segue.
- Da stimolazione con singolo impulso
- Calcolare la forza tetanica (mN; forza attiva massima generata durante la contrazione singola) e la forza tetanica specifica (mN/mm2). Calcolarla sottraendo il valore iniziale del pre-carico alla forza massima generata dal muscolo. Calcolare la forza tetanica specifica come rapporto tra la forza tetanica e la superficie trasversale del muscolo (CSA).
- Calcolare il tempo per raggiungere la tensione massima (TTP) (ms) come intervallo di tempo tra il rilascio dell'impulso e la forza del singolo scatto.
- Calcolare il tempo di dimezzamento del rilassamento (1/2RT) (ms) come il tempo necessario perché la forza della contrazione si riduca al 50% della forza massima.
- Calcolare dF/dt (mN/ms) come il valore massimo della derivata della forza durante la fase contrattile.
- Calcolare -dF/dt (mN/ms) come valore massimo della derivata della forza durante la fase di rilassamento.
- Da stimolazioni con treni di impulsi
- Calcolare la forza non fusa (mN) e la forza specifica non fusa (mN/mm)2). Calcolarla sottraendo il valore iniziale del pre-carico alla forza massima generata dal muscolo. Calcolare la forza non fusa specifica come rapporto tra la forza non fusa e la sezione trasversale anatomica (CSA) del muscolo.
NOTA: La forza non fusa è la forza attiva massima generata durante un treno di impulsi con una frequenza inferiore alla frequenza tetanica. - Calcolare la forza tetanica (mN) e la forza tetanica specifica (mN/mm²); la forza massima corrisponde alla forza attiva massima generata durante una serie di impulsi applicata alla frequenza tetanica. Calcolarla sottraendo il valore iniziale del precarico dalla forza massima generata dal muscolo. Calcolare la forza tetanica specifica come rapporto tra la forza tetanica e la sezione trasversale anatomica del muscolo (CSA).
- Calcola la curva forza-frequenza. Riporta in un grafico il valore di forza (o forza specifica) ottenuto per ogni stimolazione in funzione della frequenza crescente di stimolazione. Solitamente, si inizia con la stimolazione a impulso singolo e si termina con la frequenza tetanica.
- Calcolare la forza non fusa (mN) e la forza specifica non fusa (mN/mm)2). Calcolarla sottraendo il valore iniziale del pre-carico alla forza massima generata dal muscolo. Calcolare la forza non fusa specifica come rapporto tra la forza non fusa e la sezione trasversale anatomica (CSA) del muscolo.
- Da paradigmi di affaticamento
- Calcolare il fallimento della trasmissione neurochimica (NF) come:
dove MF è la diminuzione della forza successiva alla stimolazione muscolare e F è la diminuzione della forza successiva alla stimolazione nervosa, misurata sul primo treno di impulsi dopo la stimolazione muscolare. - Calcolare l'affaticamento intratetanico (IF) come:
dove Flp è la forza generata dal muscolo all'ultimo impulso di stimolazione, e Fm è la forza massima generata dal muscolo durante lo stesso treno di impulsi. Per quanto riguarda la stimolazione del nervo, calcolare la fatica intratetanica sul primo treno di impulsi immediatamente dopo la stimolazione diretta.
- Calcolare il fallimento della trasmissione neurochimica (NF) come:
4. Analisi statistica
NOTA: I modelli di analisi statistica devono essere scelti in base al fatto che la risposta muscolare a stimolazioni nervose e della membrana venga confrontata all'interno dello stesso modello animale o tra due modelli animali diversi18,19.
- Utilizzare il test t di Student per TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt se si confrontano solo le risposte muscolari a stimolazioni dirette e indirette. Se si confrontano preparati muscolari ottenuti da due ceppi diversi di topi, utilizzare l'ANOVA a due vie con il tipo di stimolazione e il ceppo del topo come fattori fissi. Quando l'ANOVA a due vie restituisce un risultato significativo, utilizzare test di confronto multiplo per individuare differenze statistiche.
- Per la curva forza-frequenza (se si confrontano solo le risposte muscolari a stimolazioni dirette e indirette), utilizzare l'ANOVA a due vie con il tipo di stimolazione e la frequenza di stimolazione come fattori fissi. Utilizzare test di confronto multiplo se necessario.
- Se si confrontano preparati muscolari ottenuti da due ceppi diversi di topi, utilizzare l'ANOVA a tre vie con il tipo di stimolazione, la frequenza di stimolazione e il ceppo del topo come fattori fissi.
- Quando l'ANOVA a tre vie mostra un effetto significativo dei fattori ceppo animale e tipo di stimolazione, utilizzare l'ANOVA a due vie per identificare differenze significative tra due gruppi alla volta. Ad esempio, possono essere valutate le differenze tra la risposta muscolare dei due gruppi alla stimolazione della membrana, oppure tra la risposta muscolare a stimolazioni dirette e indirette all'interno di un singolo gruppo.
- Se si confrontano preparati muscolari ottenuti da due ceppi diversi di topi, utilizzare l'ANOVA a tre vie con il tipo di stimolazione, la frequenza di stimolazione e il ceppo del topo come fattori fissi.
- Fatica intratetanica
NOTA: Poiché il protocollo è stato progettato per indurre affaticamento in risposta alla stimolazione del nervo anche nei topi di controllo, questo parametro può essere utilizzato solo per indagare differenze tra due ceppi di topi, e un'analisi statistica all'interno di un singolo gruppo produrrebbe sempre differenze significative.- Per confrontare due gruppi, utilizzare l'ANOVA a tre vie con il tipo di stimolazione, il tempo e il ceppo del topo come fattori fissi. Quando l'ANOVA a tre vie mostra un effetto significativo dei fattori ceppo animale e tipo di stimolazione, utilizzare l'ANOVA a due vie per identificare differenze significative tra due gruppi alla volta, come per la curva forza-frequenza.
- Per il fallimento della trasmissione neuro-muscolare, utilizzare l'ANOVA a due vie con il ceppo animale e il tempo come fattori fissi. Se il risultato è significativo, utilizzare test di confronto multiplo per individuare differenze statistiche.
NOTA: Poiché questo parametro fornisce un solo valore per ciascun ceppo di topo, consente di confrontare diversi modelli murini. - Per il peso, la lunghezza e l'area della sezione trasversa (CSA) del muscolo, utilizzare il test t di Student per valutare le differenze quando si confrontano preparati muscolo-nervo provenienti da diversi modelli animali.
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Risultati
Il protocollo che abbiamo descritto fornisce informazioni su denervazione funzionale in diverse malattie neuromuscolari o invecchiamento-sarcopenia. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se (e, in caso affermativo, a quale livello) le alterazioni muscolari sono dovuti a cambiamenti selettivi che si verificano nel muscolo stesso o nella trasmissione neuromuscolare. I dati riportati qui sotto sono i risultati di un precedente lavoro di nostro gruppo18
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Discussione
Il protocollo sperimentale descritto sopra fornisce un modo ideale di misurazione e discriminare eventuali alterazioni funzionali che si sono verificati direttamente nel muscolo o indirettamente a livello della giunzione neuromuscolare. Poiché questa tecnica è basata su una misura indiretta di funzionalità NMJ, non può essere utilizzato per stabilire se qualsiasi difetto è correlato a cambiamenti morfologici o cambiamenti biochimici. Al contrario, fornisce un modo efficace di determinare se eventuali alterazioni morfolog...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Lavoro in laboratorio degli autori è stato sostenuto dalla Fondazione Roma e Telethon (grant no. GGP14066).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di leve a doppia modalità | Aurora Scientifica Inc. | Attuatore/trasduttore | 300B |
| Stimolatore bifase ad alta potenza | Aurora Scientifica Inc. | Stimolatore a impulsi 701B | (nervo) |
| Stimolatore bifase ad alta potenza | Aurora Scientifica Inc. | Stimolatore | di impulsi 701C (muscolo) |
| Apparato muscolare in vitro | Aurora Scientifica Inc. | 800A | |
| Bagno di tessuto preparatorio | Radnoti | 158400 | |
| Elettrodo di aspirazione monopolare | A-M Systems | 573000 | con un riferimento fatto in casa |
| Oscilloscopio | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscopio | Nikon | SMZ 800 | |
| Illuminatore a luce fredda | Scheda di acquisizione Photonic Optics | PL 3000 | |
| National Instruments | NI PCIe-6353 | ||
| Blocco connettore | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processore 3.50 Ghz con software Windows 7 | |
| LabView 2012 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonato Tampone | Sigma-Aldrich | K4002 | tampone fisiologico |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Cloruro di calcio CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anidro, polvere, ≥ 97% |
| Tampone HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥ 99,5% (titolazione) |
| Piatti 60 mm x 15 mm | Falcon | 353004 | Polistirene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Kit elastomero 0,5Kg. |
| Termostato | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pompa | Newa Mini | MN 606 | per acquario |
| Resistenza al calore Cavo termico | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Secchio | qualsiasi 10 litri | Polipropilene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Pinze | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 pezzi |
| Forbici a molla - Lame da 8 mm | Fine Science Tools | 15024-10 | escissione nervosa |
| Forbici affilate | Strumenti di Fine Science | 14059-11 | rimozione muscolare |
| Forbici delicate | Wagner | 02.06.32 | esterno dell'animale |
| Studente Bisturi Manico #3 | Strumenti di Fine Science | 91003-12 | |
| Lame per bisturi #10 | Strumenti per la scienza fine | 10010-00 | |
| Lame per bisturi #11 | Strumenti per la scienza fine | 10011-00 | |
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Riferimenti
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
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