Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la funzionalità della giunzione neuromuscolare mediante un approccio sperimentale ex vivo. Ciò si ottiene stimolando la preparazione del nervo muscolare in due modi, direttamente sulla membrana muscolare e attraverso il nervo. Poiché la stimolazione di membrana bypassa la segnalazione della trasmissione neuronale, qualsiasi differenza tra le due risposte contrattili può essere considerata come una misurazione indiretta della funzionalità della giunzione neuromuscolare.

Qui presentiamo questa procedura nella preparazione del nervo soleo sciatico. Il muscolo viene sezionato insieme al suo nervo e posto in un bagno di tessuto perfuso. È fissato a un regolatore di forza e lunghezza e una coppia di elettrodi in platino è posizionata parallelamente al muscolo.

Un elettrodo di aspirazione in vetro viene quindi spostato vicino all'estremità tagliata del nervo. Viene quindi applicato un protocollo di test completo per valutare a fondo sia la giunzione neuromuscolare che la funzionalità muscolare. La connessione funzionale tra muscolo e nervo è la conclusione sia per la parte che per le due fazioni sopravvissute.

Nella prima regione del livello di ciascuno dei due tessuti comunica che queste giunzioni neuromuscolari, che normalmente mostrano una morfologia simile alla pressione. Tuttavia, in diverse condizioni patologiche, la funzionalità interpartita tra muscolo e nervo è gravemente compromessa e la giunzione neuromuscolare perde la complessa organizzazione morfologica. L'obiettivo generale della nostra procedura è quello di studiare la funzionalità della giunzione neuromuscolare utilizzando un approccio sperimentale ex vivo.

Ciò si ottiene stimolando la preparazione del nervo muscolare in due modi. Uno stimolando direttamente la membrana muscolare e l'altro stimolando il nervo e analizzando le proprietà muscolari. Accendere il bagnomaria di circolazione e regolare la temperatura a 30 gradi Celsius.

Riempire la vasca con la soluzione Krebs-Ringer. Lasciare che O virgola quattro bar di miscela di gas fluisca attraverso l'ossitubo e nel bagno. Accendere il trasduttore dell'attuatore e i due stimolatori di impulsi.

Impostare i valori correnti a 300 milioni di coppie per la stimolazione a membrana e a cinque milioni di coppie per la stimolazione nervosa. Dopo aver sacrificato il topo per lussazione cervicale, rimuovere la pelle dalle gambe. Ora taglia il tendine d'Achille e mentre stringi saldamente il tendine, tira insieme il muscolo gastrocnemio e il soleo verso l'alto.

Una volta esposto il tendine prossimale del soleo, tagliare l'intero polpaccio sopra di esso e posizionare rapidamente il campione nel bagno di tessuto preparatorio situato sotto lo stereomicroscopio. Usando un paio di pinze, stringi saldamente il tendine prossimale del soleo e tiralo delicatamente per esporre l'innervazione sciatica. Una volta che l'innervazione è esposta, rimuovere i tessuti circostanti per rivelare circa cinque millimetri del nervo.

Quindi usa un paio di forbici sottili per tagliare con cura il nervo. Completa l'escissione muscolare e nervosa tagliando il tendine d'Achille per separare il soleo dal gastrocnemio. Ora la preparazione del muscolo e del nervo è pronta per essere montata sull'apparato di prova.

Crea un nodo scorsoio all'estremità del filo di nylon e stringilo attorno al tendine d'Achille. Clamp il tendine prossimale all'interno del morsetto fisso e legare il filo di nylon attorno al braccio di leva del trasduttore di forza. Lascia che il muscolo si equilibri nella soluzione.

Per determinare la lunghezza ottimale iniziale, stimolare il muscolo con una serie di impulsi singoli modificando delicatamente il valore del carico di scorrimento. La lunghezza ottimale si ottiene quando la forza di contrazione è massima. Posizionare gli elettrodi di aspirazione vicino al muscolo e tirare il nervo verso l'interno.

Quindi, modificando delicatamente il valore della corrente del polso, stimolare il muscolo con una serie di impulsi singoli. La forza di contrazione generata dal muscolo quando stimolato attraverso il nervo dovrebbe essere uguale ai valori misurati quando lo si stimola sulla membrana. Una volta determinato il valore di corrente ottimale, spingere il nervo fuori dall'elettrodo ed erogare alcuni impulsi di corrente.

Se la quantità di corrente precedentemente selezionata è eccessiva, gli impulsi di corrente erogati attraverso l'elettrodo di aspirazione provocano la contrazione muscolare conducendo la corrente attraverso il bagno. Utilizzando un software fatto in casa abbiamo ideato un protocollo di test automatizzato per lo studio della funzionalità della giunzione neuromuscolare soleo. Il protocollo dura circa 65 minuti ed è composto da quattro parti diverse.

Nella prima parte, il muscolo viene stimolato con quattro impulsi singoli. Due erogati direttamente e due attraverso il nervo. Il tempo al picco, il tempo di rilassamento dimezzato, il valore massimo della derivata della forza e la forza di contrazione vengono quindi misurati dalle risposte di contrazione.

Nella seconda parte, il muscolo viene stimolato con una serie di treni di impulsi che vanno da 20 hertz a 80 hertz, che è la frequenza tetanica. Per calcolare la forza, le curve di frequenza sia per le stimolazioni nervose che per quelle dirette. Nella terza e quarta parte del protocollo, il muscolo è sottoposto a due paradigmi di fatica per misurare l'insufficienza neurotrasmissiva e la fatica intratetanica.

Durante questi paradigmi di affaticamento, il muscolo viene continuamente stimolato con un treno di impulsi erogato sulla membrana seguito da 14 treni di impulsi erogati attraverso il nervo. L'intera sequenza viene ripetuta 20 volte. Il primo paradigma viene erogato a una frequenza di sparo di 35 hertz.

Il secondo alla frequenza tetanica di 80 hertz. Si ritiene che l'insufficienza neurotrasmissiva svolga un ruolo importante nello sviluppo dell'affaticamento in quanto è correlata al blocco esterno della propagazione del potenziale d'azione, alla diminuzione del rilascio del trasmettitore e alla diminuzione dell'eccitabilità della capacità di affaticamento della giunzione. Un altro aspetto della capacità di affaticamento della giunzione neuromuscolare è chiaramente espresso dall'affaticamento intratetanico, che è una stima della capacità del muscolo di mantenere la forza durante una singola contrazione tetanica e riflette l'affaticamento ad alta frequenza.

Alla fine del protocollo, la lunghezza e il peso netto del muscolo vengono misurati utilizzando un calibro analogico e una bilancia di precisione per calcolare l'area della sezione trasversale del muscolo. Gli studi sul modello murino transgenico SOD1 di sclerosi laterale amiotrofica hanno evidenziato le potenzialità di questa metodologia. Infatti, i muscoli soleo transgenico producono una ridotta risposta contrattile sia per la forza derivata che per la forza tetanica quando stimolati direttamente e una riduzione ancora maggiore quando stimolati attraverso il nervo.

Per quanto riguarda la forza tetanica, ad esempio, questi esperimenti hanno dimostrato che la contrattilità muscolare rappresenta il 25% del danno, mentre un ulteriore 45% è correlato a difetti nella neurotrasmissione. Un altro punto interessante è l'assenza di qualsiasi differenza nei muscoli di controllo quando stimolati direttamente o indirettamente. Questa scoperta dimostra che la metodologia non induce alcun artefatto tecnico poiché si prevede che la giunzione neuromuscolare sia pienamente funzionale negli animali di controllo.

Per quanto riguarda l'affaticamento intratetanico, i risultati hanno mostrato valori significativamente più bassi nei muscoli soleo transgenico rispetto alle loro controparti di controllo. È interessante notare che il muscolo soleo transgenico è significativamente danneggiato dalla stimolazione ripetitiva, il che significa che la funzionalità della giunzione neuromuscolare può essere valutata per un tempo massimo di stimolazione di otto minuti. Dopo otto minuti, il muscolo transgenico ritorna a un valore di forza quasi nullo quando viene stimolato.

Dopo aver visto il video dovresti aver capito come misurare la funzionalità della giunzione neuromuscolare e il muscolo soleo del topo. Dato che questa tecnica si basa sulla misurazione indiretta della funzionalità della giunzione neuromuscolare, non consente di effettuare laddove i difetti riportati siano correlati a cambiamenti morfologici o biochimici. D'altra parte, questo approccio rappresenta un modo essenziale per valutare se queste aggressioni influenzano all'utente la funzionalità del segnale di trasmissione neuronale.

Infine, la proposta di protocollo può essere facilmente adottata per misurare la funzionalità della giunzione neuromuscolare del diaframma, un altro muscolo spesso coinvolto in malattie patologiche.