Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la funzionalità della giunzione neuromuscolare mediante un approccio sperimentale ex vivo. Questo viene ottenuto stimolando il preparato nervo-muscolo in due modi: direttamente sulla membrana muscolare e attraverso il nervo. Poiché la stimolazione della membrana bypassa il segnale di trasmissione neurogena, eventuali differenze tra le due risposte contrattili possono essere considerate una misura indiretta della funzionalità della giunzione neuromuscolare.

Qui presentiamo questa procedura in una preparazione del nervo sciatico del muscolo soleo. Il muscolo viene dissezionato insieme al suo nervo e posizionato in una camera tissutale perfusa. Viene fissato a un controllore di forza e lunghezza e una coppia di elettrodi di platino viene disposta parallelamente al muscolo.

Un elettrodo di aspirazione in vetro viene quindi avvicinato all'estremità tagliata del nervo. Viene poi applicato un protocollo di test completo per valutare accuratamente sia la giunzione neuromuscolare che la funzionalità muscolare. La connessione funzionale tra muscolo e nervo rappresenta la conclusione sia per la parte che per la frazione sopravvissuta.

Nella prima regione del livello di ciascuno dei due tessuti si osserva la comunicazione tra queste giunzioni neuromuscolari, che normalmente presenta una morfologia simile a una placca terminale. Tuttavia, in diverse condizioni patologiche, l'interazione funzionale tra muscolo e nervo è gravemente compromessa e le giunzioni neuromuscolari perdono l'organizzazione morfologica complessa. L'obiettivo generale del nostro procedimento è studiare la funzionalità delle giunzioni neuromuscolari mediante un approccio sperimentale ex vivo.

Questo viene effettuato stimolando il preparato nervo-muscolo in due modi: uno stimolando direttamente la membrana muscolare e l'altro stimolando il nervo e analizzando le proprietà del muscolo. Accendere il bagnomaria a circolazione e regolare la temperatura a 30 gradi Celsius.

Riempire il bagno con la soluzione di Krebs-Ringer. Far passare 0,4 bar di miscela gassosa attraverso l'ossitubo e nel bagno. Accendere il trasduttore dell'attuatore e i due stimolatori a impulsi.

Impostare i valori di corrente a 300 milioni di coppie per la stimolazione della membrana e a cinque milioni di coppie per la stimolazione del nervo. Dopo aver sacrificato il topo mediante dislocazione cervicale, rimuovere la pelle dalle zampe. Ora recidere il tendine d'Achille e, mantenendo saldamente pinzato il tendine, tirare verso l'alto il muscolo gastrocnemio e il soleo insieme.

Una volta esposta la tendine prossimale del soleo, recidere l'intero polpaccio al di sopra di essa e posizionare rapidamente il campione nel bagno tissutale preparatorio situato sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzando una pinzetta, bloccare saldamente la tendine prossimale del soleo e tirarla delicatamente per esporre l'innervazione sciatica. Una volta esposta l'innervazione, rimuovere i tessuti circostanti per mettere in evidenza circa cinque millimetri del nervo.

Quindi utilizzare un paio di forbici fini per tagliare con attenzione il nervo. Completare l'escissione del muscolo e del nervo tagliando il tendine d'Achille per separare il soleo dal gastrocnemio. Ora il preparato di muscolo e nervo è pronto per essere montato sull'apparato di prova.

Creare un nodo scorsoio all'estremità del filo di nylon e stringerlo intorno al tendine di Achille. Fissare il tendine prossimale all'interno della pinza fissa e legare il filo di nylon al braccio della leva del trasduttore di forza. Lasciare che il muscolo raggiunga l'equilibrio nella soluzione.

Per determinare la lunghezza iniziale ottimale, stimolare il muscolo con una serie di singoli impulsi modificando delicatamente il valore del carico di creep. La lunghezza ottimale si ottiene quando la forza del singolo spasmo è massima. Posizionare gli elettrodi a suggitore vicino al muscolo e introdurre il nervo.

Quindi, modificando delicatamente il valore della corrente impulsiva, stimolare il muscolo con una serie di singoli impulsi. La forza di contrazione muscolare generata quando il muscolo viene stimolato attraverso il nervo dovrebbe essere uguale ai valori misurati quando viene stimolato direttamente sulla membrana. Una volta determinato il valore ottimale della corrente, allontanare il nervo dall'elettrodo ed applicare alcuni impulsi di corrente.

Se l'intensità di corrente precedentemente selezionata è eccessiva, gli impulsi di corrente erogati attraverso l'elettrodo di aspirazione provocano la contrazione muscolare conducendo la corrente attraverso il bagno. Utilizzando un software sviluppato in laboratorio, abbiamo ideato un protocollo automatizzato per lo studio della funzionalità della giunzione neuromuscolare del soleo. Il protocollo dura circa 65 minuti ed è composto da quattro parti distinte.

Nella prima parte, il muscolo viene stimolato con quattro impulsi singoli: due applicati direttamente e due attraverso il nervo. Successivamente, vengono misurati dai tracciati di contrazione il tempo per raggiungere il picco, il tempo di dimezzamento del rilassamento, il valore massimo della derivata della forza e la forza della contrazione singola.

Nella seconda parte, il muscolo viene stimolato con una serie di treni di impulsi compresi tra 20 hertz e 80 hertz, che corrisponde alla frequenza tetanica. Per calcolare le curve forza-frequenza sia per la stimolazione nervosa che per quella diretta. Nella terza e quarta parte del protocollo, il muscolo è sottoposto a due paradigmi di affaticamento per misurare il blocco della trasmissione neurogena e l'affaticamento intratetanico.

Durante questi paradigmi di affaticamento, il muscolo viene stimolato continuamente con una serie di impulsi applicata sulla membrana, seguita da 14 serie di impulsi applicate attraverso il nervo. L'intera sequenza viene ripetuta 20 volte. Il primo paradigma viene applicato a una frequenza di scarica di 35 hertz.

Il secondo alla frequenza tetanica di 80 hertz. Si ritiene che il blocco della trasmissione neuro-muscolare svolga un ruolo importante nello sviluppo della fatica, poiché è associato al blocco esterno della propagazione del potenziale d'azione, alla riduzione del rilascio del neurotrasmettitore e alla diminuita eccitabilità della giunzione neuromuscolare. Un altro aspetto della capacità di affaticamento della giunzione neuromuscolare è chiaramente espresso dalla fatica intratetanica, che rappresenta una stima della capacità del muscolo di mantenere la forza durante una singola contrazione tetanica e riflette la fatica ad alta frequenza.

Al termine del protocollo, la lunghezza netta e il peso del muscolo vengono misurati utilizzando un calibro analogico e una bilancia di precisione per calcolare l'area della sezione trasversale del muscolo. Studi sul modello murino transgenico SOD1 della sclerosi laterale amiotrofica hanno evidenziato il potenziale di questa metodologia. Infatti, i muscoli soleo transgenici mostrano una risposta contrattile ridotta sia per la derivata della forza sia per la forza tetanica quando stimolati direttamente, e una riduzione ancora maggiore quando stimolati attraverso il nervo.

Per quanto riguarda, ad esempio, la forza tetanica, questi esperimenti hanno dimostrato che la contrattilità muscolare è responsabile del 25% del danno, mentre un ulteriore 45% è legato a difetti nella trasmissione neurogena. Un altro aspetto interessante è l'assenza di differenze nei muscoli di controllo quando stimolati in modo diretto o indiretto. Questo risultato dimostra che la metodologia non induce alcun artefatto tecnico, poiché la giunzione neuromuscolare è prevista essere completamente funzionale negli animali di controllo.

Per quanto riguarda l'affaticamento intratetanico, i risultati hanno mostrato valori significativamente più bassi nei muscoli soleo transgenici rispetto ai rispettivi controlli. In modo interessante, il muscolo soleo transgenico subisce danni significativi a seguito di stimolazione ripetitiva, il che significa che la funzionalità della giunzione neuromuscolare può essere valutata per un tempo massimo di stimolazione di otto minuti. Dopo otto minuti, il muscolo transgenico ritorna a un valore di forza quasi nullo quando stimolato.

Dopo aver guardato il video, si dovrebbe aver compreso come misurare la funzionalità della giunzione neuromuscolare e del muscolo soleo del topo. Poiché questa tecnica si basa su una misurazione indiretta della funzionalità della giunzione neuromuscolare, non consente di determinare se i difetti osservati siano legati a cambiamenti morfologici o biochimici. D'altro canto, questo approccio rappresenta un metodo essenziale per valutare se tali alterazioni influiscono sulla funzionalità del segnale di trasmissione neurogena.

Infine, la proposta di protocollo può essere facilmente adottata per misurare la funzionalità della giunzione neuromuscolare del diaframma, un altro muscolo spesso coinvolto in malattie patologiche.