Minimamente invasiva trasversale aortica costrizione nei topi

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di dimostrare come trasversale costrizione aortica (TAC) in topi può essere modificato per produrre un intervento chirurgico più semplice e più conveniente. TAC è stato introdotto nel 1991 ¹ e abilitato biologi molecolari per studiare le vie cellulari e molecolari che portano l'ipertrofia del ventricolo sinistro ea scompenso cardiaco, soprattutto nei piccoli animali con genomi manipolati ^{2, 3, 4, 5, 6.} Nonostante la sua efficacia a produrre il sovraccarico di pressione desiderata, la tecnica è limitato dalle difficoltà di eseguire la procedura e dal suo basso tasso di sopravvivenza. Un chirurgo condurre TAC deve essere in grado di eseguire l'intubazione endotracheale, toracotomia, e utilizzare ventilazione artificiale al fine di evitare il collasso polmonare ^1.

Dopo la procedura è completata, l'ecocardiografia può essere utilizzato per valutare il successo delle strisce e morfologia cardiaca e funzione. Un sistema ad ultrasuoni ad alta frequenza può essere utilizzata per misurare il diametro e il flusso cambiamenti nella sinistra e destracarotidi, per visualizzare la costrizione aortico per misure di picco velocità di flusso, e per determinare lo spessore della parete del ventricolo sinistro e parametri funzionali ^{7, 8.} Dopo l'eutanasia, gli organi possono essere raccolti anche per studi istopatologici con ematossilina ed eosina e Picrosirius collagene colorazione, quest'ultimo particolarmente utile per l'osservazione della fibrosi.

Il protocollo segue le linee guida della commissione per l'Uso di Live animali nell'insegnamento e nella ricerca (CULATR) presso l'Università di Hong Kong.

1. operazione di preparazione del sito

1. Disinfettare il sito di operazione con il 75% di alcol isopropilico. Regolare la temperatura rilievo di riscaldamento a 37 ° C per evitare cambiamenti nel cuore e frequenza respiratoria del soggetto animale.
2. Utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati in uno sterilizzatore spostamento gravità a 121 ° C per 30 minuti o con altri metodi appropriati.
3. Take 2 - 4 aghi 30-gauge ei loro curva con una porta aghi, come si vede in figura 1, per fare uno strumento per legatura e tessuto separazione e per l'uso come un divaricatore. Montare l'ago ormai curvo su un applicatore di cotone per l'uso in chirurgia.
4. Smussare un ago calibro 27 e la curva è 90º con il porta aghi. Smooth la punta sfregando una superficie dura per fare un distanziatore 0,4 mm in fase di legatura.

1. Anestetizzare un 2 mesi, maschio, 22-25 g topo C57BL / 6N con ketamina adeguata e la miscela xilazina in rapporto al peso corporeo: 100 mg / kg + 10 mg / kg ip Confermare l'anestesia con la coda negativo pizzico reflex .
2. Rimuovere i capelli sulla parte anteriore del collo e torace con un 2 a 3 min applicazione della crema depilatoria. Rimuovere la crema con acqua tiepida e un applicatore di cotone.
3. Applicare pomata oftalmica o gel per gli occhi dell'animale per impedire l'essiccazione della cornea.
4. Posto l'animale su una piastra elettrica in posizione supina e condurre il monitoraggio intraoperatorio, avendo cura di conservare la documentazione appropriata ad ogni intervallo di 15 min.
5. Utilizzare nastro di carta chirurgico per fissare gli arti al pad di riscaldamento per mantenere l'animale in posizione corretta durante l'intervento chirurgico.
6. Disinfettare la pelle alternativamente con l'alcol e la soluzione iodopovidone tre volte.
7. Utilizzare un dr sterileape con un campo operativo esposto per evitare la contaminazione. Utilizzare nuovi guanti sterili per ogni mouse e, se necessario.

3. Procedura legatura

1. Aprire la pelle del mouse nel punto linea mediana del collo e del torace con un bisturi.
2. Tirare la ghiandola tiroidea verso la testa separando delicatamente i tessuti connettivi con le forbici spuntate.
3. Separare lo strato muscolare sulla trachea sulla linea mediana verso entrambi i lati con gli aghi curvi.
4. Utilizzando le forbici smussate, tagliare sterno alla seconda nervatura (circa 5 mm). Aprire il taglio con un divaricatore o pinze curve.
5. Separare i lobi del timo tra loro e la parete inferiore del petto separando il tessuto connettivo con l'ago curvo; aortico trasversale e due arterie carotidi saranno chiaramente visibili a questo punto.
6. Posizionare l'ago curvo sotto l'arco e forare tra la parete del vaso e del tessuto connettivo sull'altro lato da pusHing la testa ricurva fuori.
7. Utilizzando l'ago curvo, tirare la sutura 6-0 monofilamento sotto l'arco aortico.
8. Posizionare il distanziatore nel loop e fissare la sutura in posizione con un doppio nodo. Rimuovere delicatamente il distanziatore.
9. Conferma una costrizione successo con la posizione nodo e tagliare le estremità della sutura.
10. Chiudere la parete toracica utilizzando 6/0 di seta sutura con un semplice modello di sutura interrotta. Chiudere la pelle con una sutura monofilamento 6/0 in un modello sutura continua.

Cura 4. post-operatoria

1. Applicare la soluzione povidone-iodio al sito di sutura e posto l'animale in una gabbia pre-riscaldato per il recupero e monitoraggio post-operatorio.
2. Iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg sc ogni 12 ore), dopo che l'animale ha ripreso conoscenza per alleviare il dolore e fornire il mouse con cibi morbidi appropriata.
3. Rispedire l'animale verso un / stanza buia ciclo di 12 ore di luce dopo il pieno recupero.

5.Ecocardiografia: La conferma della legatura di successo e misure

1. Dopo una settimana, anestetizzare il mouse precedentemente fasciato con 3 - 5% isoflurano, per l'induzione e 1 - 1,5%, per la manutenzione, con un / flusso dell'ossigeno min 1 L.
2. Rimuovere i peli del torace con crema depilatoria. Rimuovere accuratamente la crema con acqua tiepida e un applicatore di cotone.
3. Fissare il mouse in posizione supina alla piattaforma animale movimentazione, mantenuta a 37 ° C. Applicare il gel degli elettrodi alle zampe e incollate al pad con gli elettrodi.
4. Applicare gel per ultrasuoni al petto del mouse. Con una sonda da 40 MHz MS550D e un sistema ad ultrasuoni ad alta frequenza, eseguire Doppler colore e Doppler pulsato onda sulla carotide sinistra e destra, nonché aortico.
5. Utilizzando B-Mode, individuare il ventricolo sinistro. Utilizzando M-Mode, sistolica e diastolica spessore della parete può essere misurata. Usa Cine Store e Frame Store per salvare i dati e le immagini, come richiesto.
6. Ucantare B-Mode, individuare sinistra carotide comune prima del punto di diramazione. Utilizzare pulsata-wave e color Doppler per valutare il flusso. Ripetere con l'arteria carotide destra in un punto simile. Salvare le immagini in Cine Store e modalità memoria di quadro per analizzare in seguito.
7. Inclinare la piattaforma di gestione degli animali verso l'estrema sinistra in modo che il mouse è in decubito sinistro. Posizionare la sonda sul mouse, 30 ° da una posizione parallela alla testa nella posizione parasternale e manipolare X e Y per trovare aortico.
8. Individuare la costrizione. Utilizzare la modalità Doppler colore per rendere il sito della costrizione più visibile, come il sangue sarà fluisce attraverso uno stretto canale tra il punto in cui le due arterie carotidi diramano dall'arco aortico.
9. Utilizzare pulsato onda e color Doppler per misurare la velocità del flusso di picco. Usa Cine Store e Frame Store per salvare i dati e le immagini, come richiesto.
10. Lasciare che l'animale di recuperare su una piastra elettrica in posizione prona.Rispedire l'animale verso la gabbia originale in un / stanza buia ciclo di 12 ore di luce dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia.

MTAC consente l'induzione di ipertensione significativa nel ventricolo sinistro in modo tempestivo.

Come si vede nella figura 1, la preparazione degli strumenti principali per la procedura è semplice e minimale, richiedendo solo di 2 - 4 aghi da 30 gauge da piegare e tenuto in posizione con un tubo di poliuretano. La procedura chirurgica stessa è anche meno complicato, rispetto al TAC, e può essere eseguita facilmente. Una volta che la tiroide è stato ritirato, lo sterno viene tagliato e il timo viene spostato per cancellare la vista. L'arco aortico è facilmente localizzabile per il processo di legatura (Figura 2).

MTAC produce in modo affidabile sovraccarico di pressione ventricolare sinistra nei topi legatura. La figura 3 illustra chiaramente, come dell'aorta trasversale ristretta può osservare chiaramente in Figura 3C, come well come velocità di aumento del flusso di picco attraverso il sito costrizione in 3D. Questo può essere paragonato al mouse sham, visibile in figura 3A e 3B, che presenta alcuna costrizione con velocità di flusso di picco normale. Come conseguenza della legatura visibile nella figura 4C, la velocità del flusso è significativamente aumentata in arteria carotide destra, e la pressione può accumularsi l'aorta ascendente e nel cuore per produrre ipertrofia ventricolare sinistra. Tuttavia, in conseguenza di costrizione monte, la velocità del flusso è significativamente ridotta in sinistra arteria carotide comune, come nella figura 4D. D'altra parte, il flusso ematico dell'arteria carotidea quasi identico viene osservata nel topo sham, come nella Figura 4A (destra carotide) e 4B (arteria carotide sinistra).

Il parametro ipertrofia legati risultantes e curva di sopravvivenza sono prontamente notato in figura 5, in cui il cuore del mouse MTAC-ligato può essere osservato significativamente allargata e deformata. Questo è ulteriormente soltanto visibile a livello cellulare, come mostrato nella Figura 6A e 6B, che espone cuore allargata del mouse MTAC azionamento rispetto al mouse sham-operati. Ciò che può essere ulteriormente osservato è l'aumento delle dimensioni del muscolo cardiaco di cellule e la fibrosi nei topi MTAC (Figura 6D, 6F, e 6H) rispetto ai topi non-legatura (Figura 6C, 6E, e 6G).

Poiché MTAC può essere verificata da un sistema ad ultrasuoni ad alta frequenza, la mancata costringere successo aortico sarà rivelato dalla mancanza di una costrizione visibile dell'aorta radiale nel ecocardiografia bidimensionale, come nella Figura 3B 3D. Questo può essere ulteriormente verificata con i pulsata-onde e colori modalità Doppler, una costrizione successo dovrebbe dimostrare una velocità di flusso superiore nella carotide destra e velocità del flusso ridotta in arteria carotide sinistra (Figura 4C e 4D).

Figura 1: processo di formazione dell'ago Ganci desiderati piegando un 1-in, 30-gauge a punta d'ago. A) L'originale 1-a, 30-gauge punta dell'ago. B) Afferrare la punta dell'ago con il porta-aghi e piegare a circa metà strada lungo la sua lunghezza. Piegare l'ago in un ciclo, utilizzando il porta-aghi e le mani, se necessario, per formare l'anello raffigurata in alto a destra della figura. C) coprire l'ago con un tubo di poliuretano per tenere il tratto ripiegato in posizione. D) Con ilporta-aghi, piegare la punta del ciclo nella forma desiderata. In questo caso, la punta dell'ago con due 45 - 60 ° curve è stato dimostrato per scopi illustrativi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il processo di legatura della trasversale aortico. A) L'arco aortico è chiaramente visibile. B) Utilizzo del suddetto crochet, separare aortico dal tessuto connettivo vicina. C) Mediante l'ago ad uncino, guida la sutura sotto l'arco aortico, e con l'uso di un distanziatore, legare una costrizione del diametro desiderato. D) legatura completato. Pl facilità clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: colore e pulsato Doppler Ultrasound Imaging dal aortico di legatura e topi non-legatura. A) color Doppler dell'arco aortico di un mouse non legatura. Le due arterie carotidi sono chiaramente visibili, così come la mancanza di una costrizione tra loro. B) velocità del flusso aortico di picco di un mouse non-legatura. C) color Doppler dell'arco aortico di un mouse legatura. La costrizione tra le due arterie carotidi sul arco aortico è visibile (frecce gialle). D) la velocità del flusso di picco presso il sito costrizione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: ipertrofia cardiaca e dei parametri correlati con una curva di sopravvivenza da 3 settimane legata e non-legatura topi. A) Il cuore da un mouse a 3 mesi senza trasversale costrizione aortica. Il cuore è sano e di una forma normale, senza patologie immediatamente evidenti. B) Il cuore di un mouse a 3 mesi che ha subito MTAC per 3 settimane. Si noti la natura chiaramente deforme del cuore a causa di sinistra allargamento della parete ventricolare. La legatura sulla aortico è anche visibile. C) Una sezione trasversale del cuore di 3 mesi del mouse non-legatura. D) Una sezione trasversale del cuore di un 3-MONTH-vecchio mouse che ha subito trasversale costrizione aortica per 3 settimane. L'allargamento del ventricolo sinistro è chiaramente visibile. Il cuore, in generale, è anche allargata a causa del sovraccarico di pressione ventricolare sinistra causata da MTAC. E) Il rapporto cuore a peso è significativamente aumentata nei topi banda per 3 settimane. F) La tibia rapporto lunghezza osso cuore a sinistra è significativamente aumentata nei topi fasciato per 3 settimane (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0.001). Curva G) di sopravvivenza per un 3-settimana di esperimento (MTAC = 12 e SHAM = 12). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6: istologica diapositive del Cuore Mouse. A) Una sezione trasversale di un sham-operated cuore del mouse. B) Una sezione trasversale di un cuore MTAC-ligato per 3 settimane, con una parete ventricolare sinistra ispessita e fibrosi parziale. La dimensione complessiva cuore è aumentata. C) Sezione longitudinale delle fibre muscolari cardiache da un topo sham-operated. D) Sezione longitudinale delle fibre muscolari cardiache da un mouse MTAC-legatura. Le cellule vengono ingrandite in modo significativo, come dimostra il loro diametro maggiorato, mentre il nucleo è rimasta la stessa dimensione. E) La sezione trasversale delle fibre muscolari di un topo sham-operati. F) Sezione trasversale delle fibre muscolari cardiache da un mouse MTAC-legatura. Le cellule vengono ingrandite causa del sovraccarico di pressione a causa della MTAC. G) arterie coronarie da un topo sham-operated macchiato con Picrosirius Red per il collagene. H) arterie coronarie da un mouse MTAC-legatura. Una quantità significativa di tessuto collagene si osserva around il vaso sanguigno dilatato, indicative di fibrosi perivascolare causa del sovraccarico di pressione nelle arterie coronarie. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.