Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare il tessuto gonadico di zebrafish larvale, che faciliterà le indagini della differenziazione sessuale zebrafish e manutenzione.
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Articolo metodologico
La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Anche se zebrafish selvatici in possesso di un / ZW determinazione del sesso ZZ, zebrafish addomesticato hanno perso il cromosoma sessuale. Essi utilizzano un sistema di determinazione del sesso poligenica, in cui diversi geni distribuiti in tutto il genoma determinare collettivamente le identità sessuali di singoli pesci. Attualmente, i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle gonadi e come funzionano rimangono sfuggente. Normalmente, isolando tessuto gonadico è il primo passo per esaminare i processi di sviluppo del sesso. Qui vi presentiamo una procedura per isolare il tessuto gonadico da 17 dpf (giorni dopo la fecondazione) e 25 dpf larve di zebrafish. Il tessuto gonadico isolato può essere successivamente esaminati dalla morfologia e l'espressione genica.
Introduzione
Il principale determinante del sesso femminile nel selvaggio cromosoma zebrafish 4 è perso o modificato nel zebrafish addomesticato (vale a dire i ceppi più comuni di laboratorio) 1. Al contrario, hanno un sistema di determinazione del sesso poligenica accompagnato da fattori ambientali come la temperatura, l'ipossia, la disponibilità di cibo e la densità di popolazione. I meccanismi dettagliati dello sviluppo sessuale zebrafish non sono pienamente compresi. Domande fondamentali come quando si verifica determinazione del sesso zebrafish, ciò che il segnale determinazione sessuale primaria (s) è / sono, e quali geni regolano il pri....
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Protocollo
Esperimenti zebrafish sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Fudan University. Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard 20.
1. preparativi
- Coltivare 17 dpf e 25 dpf zebrafish larvale
- Trasferimento 2 maschi e 2 femmine zebrafish adulti (in buona salute, da 3 a 6 mesi di età, di laboratorio AB strain) ad un serbatoio traversata nel tardo pomeriggio prima del giorno traversata. Separare i maschi e le femmine con una barriera. La mattina seguente, rinfrescare l'acqua della vasca e togliere la barriera per consentire loro di accoppi....
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Risultati
Dissezioni delle gonadi sono state effettuate su AB strain zebrafish larvale. La figura 1 mostra tessuto tipico gonadi di zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. In primo luogo, la pelle ei muscoli di un lato dell'addome viene tagliato per esporre gli organi interni. Dopo aver rimosso la massa degli organi interni, la vescica natatoria insieme gonade rimangono nel bagagliaio. Gonade era attaccato alla faccia ventrale vescica natatoria (freccia in
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Discussione
Il pesce zebra è diventato un modello potente ed è ampiamente utilizzato nello sviluppo e nella ricerca sulle malattie correlate. I metodi per l'isolamento degli organi in zebrafish adulti come il cervello, il cuore, gonadi, e del rene, sono stati ben documentati 23, 24, 25. A causa delle piccole dimensioni e rimodellamento dinamica dei tessuti gonadici nella zebrafish larvale, isolamento di tessuto gonadico è un compito im.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo C Zhang per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (31.171.074, 31.371.099 e 31.571.067 di GP) e dal talento Progetto Pujiang (09PJ1401900 a GP).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto per coltura cellulare 100 mm | Corning | 430167 | Per l'incubazione degli embrioni |
| 20x EM | Per un 1 L necessario: aggiungere 17,5 g di NaCl, 0,75 g di KCl e 2,9 g di CaCl· 2H2O; aggiungere quindi 0,41 g di KH2PO4, 0,412 g di Na2HPO4 anidro e 4,9 g di MgSO4· 7H2O. | ||
| 1x EM | Diluire 20x EM in acqua distillata | ||
| AGAROSIO G-10 | Gene | 121985 | Per preparare le piastre di agar al 2% |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596-026 | Per l'isolamento dell'RNA |
| Misuratore di vetro | Shen Bo | 250 ml | Per preparare le piastre di agar al 2% |
| Forno a microonde | Midea | M1-211A | Per riscaldare l'AGAR |
| Pinzetta DUMONT#5INOX | World Precision Instrument 500341 | Per dissezione | |
| Stereomicroscopio | Motic | SMZ168 | Per dissezione |
| Apparecchiature per acqua pura | Millipore | ||
| Ringer' | Per 1 L necessario: aggiungere 6,78 g di NaCl, 0,22 g di KCl, 0,26 g di CaCl2 e 1,19 g di Hepes; quindi riempire fino a 1 L; Regolare il pH a 7,2. Sterilizzare per filtrazione e conservare in un contenitore in policarbonato trasparente autoclavato. | ||
| Pipetta di trasferimento | Samco | 202, 204 | |
| Bagno in metallo | QiLinbeier | Modello GL-150 | |
| Microscopio | Leica | M205 FA | fotomicrografica |
| Eppendorf | 5417R | ||
| Kit di isolamento dell'RNA su micro scala | Ambion | AM1931 | Per l'isolamento dell'RNA dai tessuti delle gonadi |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | Per la digestione del DNA nella soluzione di RNA |
| RevertAid Kit di sintesi del cDNA del primo filamento | Thermo Scientific | #K1631 | Per la sintesi del cDNA del primo filamento |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | Per digerire l'RNA residuo nella soluzione di cDNA. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | Questo prodotto è una miscela master 2x a base di DNA polimerasi Taq per la PCR in tempo reale e applicabile per il saggio di intercalazione con SYBR Green I. |
| Spettrofotometro | Ne Drop | OD-2000+ | Misurazione della concentrazione dell'RNA totale |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
Riferimenti
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
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Ristampe e permessi
