È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

10.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/55294

⸱

26 aprile 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Brain Science, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare il tessuto gonadico di zebrafish larvale, che faciliterà le indagini della differenziazione sessuale zebrafish e manutenzione.

Abstract

Anche se zebrafish selvatici in possesso di un / ZW determinazione del sesso ZZ, zebrafish addomesticato hanno perso il cromosoma sessuale. Essi utilizzano un sistema di determinazione del sesso poligenica, in cui diversi geni distribuiti in tutto il genoma determinare collettivamente le identità sessuali di singoli pesci. Attualmente, i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle gonadi e come funzionano rimangono sfuggente. Normalmente, isolando tessuto gonadico è il primo passo per esaminare i processi di sviluppo del sesso. Qui vi presentiamo una procedura per isolare il tessuto gonadico da 17 dpf (giorni dopo la fecondazione) e 25 dpf larve di zebrafish. Il tessuto gonadico isolato può essere successivamente esaminati dalla morfologia e l'espressione genica.

Introduzione

Il principale determinante del sesso femminile nel selvaggio cromosoma zebrafish 4 è perso o modificato nel zebrafish addomesticato (vale a dire i ceppi più comuni di laboratorio) 1. Al contrario, hanno un sistema di determinazione del sesso poligenica accompagnato da fattori ambientali come la temperatura, l'ipossia, la disponibilità di cibo e la densità di popolazione. I meccanismi dettagliati dello sviluppo sessuale zebrafish non sono pienamente compresi. Domande fondamentali come quando si verifica determinazione del sesso zebrafish, ciò che il segnale determinazione sessuale primaria (s) è / sono, e quali geni regolano il primo passo di trasformazione gonadi restano da risolvere 2, 3.

Nel processo di sviluppo sessuale zebrafish, più tappe importanti sono state riconosciute. Nella fase iniziale di sviluppo, a partire dal 4 HPF (ore dopo la fecondazione) cellule germinali primordiali (PGC) sottoporsi specifica, migrazione cresta genitale eproliferazione. Numeri PGC e interazioni reciproche tra cellule germinali e cellule somatiche sono importanti per gonadi differenziazione 4. A 13 dpf (giorni dopo la fecondazione), le gonadi sono in fase indifferenziata. Con 17 DPF, le gonadi si sviluppano in ovaie bi-potenziali in entrambi i maschi e femmine futuri. La transizione apoptosi dipendente da ovaio al testicolo inizio alle 21 a 25 dpf e può continuare per diverse settimane. Da 35 dpf, il sesso della gonade è stata determinata e produzione di gameti sesso-specifico è in corso in entrambe le ovaie e testicoli 5, 6, 7.

Fino ad oggi, sono stati proposti diversi geni candidati ei meccanismi di determinazione del sesso. Proteomica e analisi trascrittomica hanno isolato molti geni con espressione dimorfismo sessuale e questi geni sono stati utilizzati per studiare la differenziazione del sesso in zebrafish 8, 9, 10. Ad esempio, in zebrafish larvale, il gene cyp19a1a è specificamente espresso nelle ovaie, ma non nel testicolo 11, 12. Inoltre, gene amh è debolmente espressa nelle cellule follicolo granulosa ovarica, ma fortemente nei testicoli cellule di Sertoli 13. Al contrario, gene vasa continuamente espresso nelle cellule germinali sia zebrafish maschile e femminile, che lo rendono adatto marcatore gonadi 14, 15.

Indagare gonadici livelli di espressione genica è fondamentale per capire il meccanismo molecolare di determinazione del sesso e la differenziazione soprattutto nella fase ovaie bi-potenziale 3, 9. Tuttavia, le piccole dimensioni delle zebrafish larvale e corrispondentemente piccole gonadi complicare l'isolamento di gonadal tessuti per ulteriori analisi molecolari. Precedenti studi utilizzati sezionati tutta la regione del tronco tra l'opercoli e pori anale 16. Questa preparazione, anche se contenenti gonadi, costituito da più tessuti e organi. In alternativa, gli animali transgenici con espressione GFP specifico gonade come vasa: EGFP sono stati usati per l'isolamento tessuto gonadico mediante fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e la cattura laser micro-dissezione 17, 18. Ma la loro applicazione diffusa è limitata. Qui, descriviamo una semplice procedura per isolare il tessuto gonadico da zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. Dimostriamo la posizione delle gonadi rispetto ad altri organi e isolare le gonadi morfologicamente intatte dai tessuti circostanti. Mostriamo ulteriormente i geni specifici gonade come vasa e cyp19a1a sono altamente espresso nelle gonadi isolate rispetto al tessuto tronco tramite PCR quantitativa (qPCR) analisi. Il presente protocollo permette l'identificazione, l'isolamento, la purificazione dell'RNA e l'amplificazione di geni specifici gonadici da zebrafish larvale, consentendo così successiva analisi molecolare del tessuto gonadica 19.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Esperimenti zebrafish sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Fudan University. Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard 20.

1. preparativi

  1. Coltivare 17 dpf e 25 dpf zebrafish larvale
    1. Trasferimento 2 maschi e 2 femmine zebrafish adulti (in buona salute, da 3 a 6 mesi di età, di laboratorio AB strain) ad un serbatoio traversata nel tardo pomeriggio prima del giorno traversata. Separare i maschi e le femmine con una barriera. La mattina seguente, rinfrescare l'acqua della vasca e togliere la barriera per consentire loro di accoppiarsi. Raccogliere uova a 100 mm di Petri 1 a 2 h dopo la fecondazione.
    2. Tenere circa 40 embrioni in un piatto 100 millimetri con 40 ml di media embrione (EM) a 28,5 ° C durante il periodo di sviluppo iniziale (4 giorni) e aggiornare la EM due volte al giorno. Trasferimento larve a 1 serbatoi L (40 larve per 300 dell'acqua del sistema mL) e si nutrono con rotiferi dal vivo (fornitura completa, due volte al giorno), dopo 5 dpf.Live feed artemie, invece di dieta rotifero dopo 10 dpf. Trasferire il pesce nel sistema ricircolo dell'acqua a 14 dpf 21.
    3. Sollevare zebrafish larvale nel sistema di ricircolo dell'acqua fino al 17 dpf o 25 dpf. Garantire il ciclo luce / buio è 14/10 h ed il pH valore dell'acqua sistema è di circa 7.2. Misurare la lunghezza del corpo di 17 dpf (5,5 a 6,8 millimetri) e 25 dpf (da 8 a 11 mm) larve 22.
  2. Preparare 2% agar per la dissezione.
    1. Aggiungere 4 g di agar a 200 ml di acqua sterile. Scaldare la miscela in un forno a microonde fino a quando si scopre trasparente.
    2. Raffreddare la soluzione di agar per circa 15 minuti, poi versarlo in 60 mm di diametro Petri piatti (circa 1/3 del volume della piastra). Conservare le piastre di agar solidificato a 4 ° C.

2. Protocollo 1: sezionare il tessuto gonadico del 17 e 25 dpf Larve

  1. Aggiungere ghiaccio tritato nel serbatoio per anestetizzare 17 dpf larve. trasferire illarve anestetizzato a un 100 mm refrigerate Petri con la soluzione di 30 ml di freddo Ringer. Mantenere il pesce incubate in soluzione della refrigerate di Ringer per almeno 15 minuti per anestetizzare completamente le larve.
  2. Trasferire le larve di una piastra di agar pre-raffreddata con un cucchiaio di plastica di piccole dimensioni. Immergere l'intero corpo di pesce in 10 ml refrigerate soluzione di Ringer e delicatamente adagiarla su un fianco.
  3. Effettuare le seguenti operazioni sotto il campo di visione stereo microscopio 25X. Bloccare il tronco di pesce con una pinzetta per la stabilizzazione. Strappare l'addome longitudinalmente dall'ano al cuore con un altro paio di pinzette. Rimuovere delicatamente la pelle ed i muscoli su un lato del corpo per esporre gli organi interni.
  4. Rimuovere la massa di organi ventrali alla vescica natatoria con attenzione. Evitare di danneggiare gonade attaccato alla vescica natatoria.
  5. Tagliare il collegamento tra la vescica natatoria e il corpo anteriore. Estrarre l'intera vescica natatoria e tessuto gonadico delicatamente.
    NOTA: Nella maggior parte casos, il tessuto gonadico a 17 dpf contiene circostante tessuto epiteliale e protonephridium. Essi non sono facilmente separati l'uno dall'altro, ma a 25 dpf può essere facilmente separati. Gonade è collegato anche l'ano. Una giunzione con gonadi sinistra e destra collegati tra loro alle ano sarà chiaramente visibile.
  6. Utilizzare le pinzette per separare con attenzione il tessuto gonadico dalla vescica natatoria e ripulire i tessuti adiposi circostanti.
  7. trasferire immediatamente il tessuto gonadico isolato ad un prechilled 1,5 mL provetta contenente una soluzione di 200 microlitri Ringer. Tenere la provetta in ghiaccio fino a quando tutti i tessuti gonadici sono separati dal larve.
  8. Sezionare le gonadi di 25 DPF larve come descritto nei punti 2.1 - 2.7.

3. Protocollo 2: Analisi di espressione genica dei tessuti gonadici isolati

  1. Estrarre l'RNA totale dai tessuti gonadici larvali.
    1. Trasferire i isolati tessuti gonadici ad un nuovo RNase-free 1.5 ml di tubo e rimuovere soluzione di Ringer. Aggiungere 100 microlitri soluzione di lisi. Vortice finché i tessuti sono completamente lisato.
    2. Eseguire la procedura di estrazione dell'RNA totale secondo le istruzioni del produttore.
    3. Aggiungere 1/10 volume di 10x DNasi I buffer e 1 ml di DNasi I per la soluzione di RNA e mescolare delicatamente. Incubare per 20 minuti a 37 ° C.
    4. Aggiungere 1/10 del volume di reagente DNasi inattivazione alla soluzione di RNA. Incubare per 10 minuti a 70 ° C. Misurare la concentrazione di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro. Conservare a -20 ° C.
  2. Eseguire sintesi del DNA prima filamento
    1. Utilizzare un oligo (dT) Primer -linker per eseguire la sintesi del primo filamento di cDNA seguendo il protocollo del produttore. Aggiungere 1 a 2 mg di RNA per un volume totale di reazione a 20 ml.
    2. Incubare la soluzione di reazione per 90 minuti a 45 ° C. Terminare la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 5 min.
    3. Aggiungere 1 ml RNasi H al cDNA cosìluzione per rimuovere l'RNA residua. Mescolare delicatamente e centrifugare per 10 s a ~ 13.000 x g. Incubare per 20 minuti a 37 ° C. Aggiungere 20 ml di acqua priva di nucleasi. Conservare a -70 ° C.
  3. Eseguire fluorescente PCR quantitativa
    1. Eseguire qPCR su un sistema ciclatore con un colorante fluorescente. Utilizzare i seguenti PCR condizioni di ciclo: 35 cicli a 95 ° C per 15 s, Tm-5 ° C per 15 s, 68 ° C per 30 s. Utilizzare sequenze primer come segue: AMH (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) e β-actina (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Dissezioni delle gonadi sono state effettuate su AB strain zebrafish larvale. La figura 1 mostra tessuto tipico gonadi di zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. In primo luogo, la pelle ei muscoli di un lato dell'addome viene tagliato per esporre gli organi interni. Dopo aver rimosso la massa degli organi interni, la vescica natatoria insieme gonade rimangono nel bagagliaio. Gonade era attaccato alla faccia ventrale vescica natatoria (freccia in

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il pesce zebra è diventato un modello potente ed è ampiamente utilizzato nello sviluppo e nella ricerca sulle malattie correlate. I metodi per l'isolamento degli organi in zebrafish adulti come il cervello, il cuore, gonadi, e del rene, sono stati ben documentati 23, 24, 25. A causa delle piccole dimensioni e rimodellamento dinamica dei tessuti gonadici nella zebrafish larvale, isolamento di tessuto gonadico è un compito im...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Ringraziamo C Zhang per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (31.171.074, 31.371.099 e 31.571.067 di GP) e dal talento Progetto Pujiang (09PJ1401900 a GP).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piatto per coltura cellulare 100 mmCorning430167Per l'incubazione degli embrioni
20x EMPer un 1 L necessario: aggiungere 17,5 g di NaCl, 0,75 g di KCl e 2,9 g di CaCl· 2H2O; aggiungere quindi 0,41 g di KH2PO4, 0,412 g di Na2HPO4 anidro e 4,9 g di MgSO4· 7H2O.
1x EMDiluire 20x EM in acqua distillata
AGAROSIO G-10Gene121985Per preparare le piastre di agar al 2%
Reagente TrizolInvitrogen15596-026Per l'isolamento dell'RNA
Misuratore di vetroShen Bo250 mlPer preparare le piastre di agar al 2%
Forno a microondeMideaM1-211APer riscaldare l'AGAR
Pinzetta DUMONT#5INOXWorld Precision Instrument 500341Per dissezione
StereomicroscopioMoticSMZ168Per dissezione
Apparecchiature per acqua puraMillipore
Ringer' Per 1 L necessario: aggiungere 6,78 g di NaCl, 0,22 g di KCl, 0,26 g di CaCl2 e 1,19 g di Hepes; quindi riempire fino a 1 L; Regolare il pH a 7,2. Sterilizzare per filtrazione e conservare in un contenitore in policarbonato trasparente autoclavato.
Pipetta di trasferimentoSamco202, 204
Bagno in metalloQiLinbeierModello GL-150
MicroscopioLeica M205 FAfotomicrografica
Eppendorf5417R
Kit di isolamento dell'RNA su micro scalaAmbionAM1931Per l'isolamento dell'RNA dai tessuti delle gonadi
Dnase ISigmaAMPD1-1KTPer la digestione del DNA nella soluzione di RNA
RevertAid Kit di sintesi del cDNA del primo filamentoThermo Scientific#K1631Per la sintesi del cDNA del primo filamento
Rnase HThermo Scientific#EN0202Per digerire l'RNA residuo nella soluzione di cDNA.
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201Questo prodotto è una miscela master 2x a base di DNA polimerasi Taq per la PCR in tempo reale e  applicabile per il saggio di intercalazione con SYBR Green I.
SpettrofotometroNe DropOD-2000+Misurazione della concentrazione dell'RNA totale
MastercyclerEppendorfAG 22331 Hamburggene expression profiling
Per centrifuga

Riferimenti

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579(2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397(2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Dissezione di larve di zebrafishisolamento del tessuto gonadicosviluppo sessuale dello zebrafishanalisi dei marker gonadiciprotocollo di estrazione dell RNAespressione genica tramite qPCRdissezione al stereomicroscopiopreparazione di piastre di agarsoluzione di Ringer
La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.