Determinazione della potenza relativa di un Anti-TNF anticorpo monoclonale (mAb) di neutralizzante TNF utilizzando un metodo di Bioanalytical In Vitro

Sommario

Un protocollo per la determinazione dell'attività anti-apoptotica relativa di un mAb anti-TNFα utilizzando un meccanismo di neutralizzazione con cellule WEHI 164 è presentato qui. Questo protocollo è utile per confrontare la forza di neutralizzazione di molecole diverse con la stessa funzionalità biologica.

Abstract

Questo protocollo viene visualizzata la misura della neutralizzazione attività apoptotica di TNFα in un modello di cellulare dei fibroblasti del topo (WEHI 164) utilizzando un mAb anti-TNF. Inoltre, questo protocollo può essere usato per valutare altre molecole anti-TNF, come proteine di fusione. Il modello di cellulare utilizzato qui è sensibile all'apoptosi TNFα-mediata quando un fattore di stress aggiuntivo è indotta in condizioni di coltura delle cellule (per esempio, la privazione del siero). Questa procedura esemplifica come eseguire questo test analitico, evidenziando le operazioni chiave riguardanti la preparazione del campione, diluizione delle cellule, l'induzione di apoptosi e misure spettrofotometriche che sono fondamentali per garantire risultati di successo. Questo protocollo rivela le condizioni migliori prestazioni relative all'induzione di apoptosi e segnale efficiente registrazione, portando a valori di bassa incertezza.

Introduzione

Potenza biologica è la misura quantitativa dell'attività biologica basate sugli attributi prodotto dosato che sono collegati alle proprietà biologiche rilevanti, considerando che la quantità (espressa in massa) è una misura fisico-chimica del contenuto proteico. Prove di attività, insieme ad altre metodologie analitiche, vengono effettuate nell'ambito di studi di comparabilità, la stabilità e la conformità del prodotto. In questo senso, misurazioni di potenza vengono utilizzati per dimostrare che i lotti di prodotto soddisfano gli attributi di qualità critica (CQAs) o i criteri di accettazione durante tutte le fasi della sperimentazione clinica e previa approvazione d....

Protocollo

1. preparazione dei Media e delle soluzioni

1. preparare il terreno di coltura: RPMI-1640 con 10% FBS, pH 7.4.
2. Preparare analisi colturale: RPMI-1640 senza rosso fenolo ma con 1% FBS, pH 7.4.
3. Preparare la soluzione di lavaggio della cella: soluzione di privo di Ca e Mg DPBS con 0,02% EDTA, pH 7.4.
4. Preparare soluzione di distacco delle cellule: 0,125% tripsina con 1 mM EDTA.
   1. Scongelare 100 mL di una soluzione di 0,25% di tripsina-EDTA e trasferimento in una sterile bottiglia da 500 mL.
   2. Mix con 100 mL di cella soluzione di lavaggio e dispe....

Risultati

Grafico di dose-risposta (con controlli)
Figura 1 rappresenta la risposta di luminescenza contro concentrazione di mAb. Questa funzione sigmoidale esemplifica la caspasi 3 e 7 rilascio nel terreno di coltura di dosaggio a causa di lisi delle cellule. Morte delle cellule è esaltata dalla deprivazione di siero plus TNFα induzione di segnalazione. Di conseguenza, la molecola anti-TNF (mAb) interagisce con la citochina, inibizione della sua i.......

Discussione

Questa caratterizzazione consente di determinare a priori il comportamento biologico di una molecola in fase di sviluppo prima di costosi e laboriosi studi clinici sono condotti. È anche utile per il rilascio lotto di un prodotto di farmaco approvato. Vale la pena ricordare che queste analisi sono utili per determinare se una molecola ha un effetto biologico adeguato per quanto riguarda il suo meccanismo d'azione. Il metodo bio-analitici presentato in questa esercitazione è estremamente importante per il confron.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Cellule di fibrosarcoma da Mus musculus
RPMI-1640 Medium	ATCC	30-2001	Conservare il terreno a 2 gradi C a 8 gradi C
RPMI 1640 Medio, senza rosso fenolo	GIBCO	11835-030	Conservare il terreno a 2 gradi; C a 8 gradi C
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	GIBCO	25200-056	Conservare il terreno a -10 ° C a -20 ° C
DPBS, senza calcio, senza magnesio	GIBCO	14190-136	Conservare il terreno a 2 gradi; C a 8 gradi C
Proteina TNF-alfa umana ricombinante	R& D Systems	210-TA-020	Conservare a -20 C a -70 ° C
Siero fetale bovino (USA), IgG molto basso	HyClone	SH3089803	conservare a -10 gradi C a -20 ° C
Siero fetale bovino (USA), caratterizzato	HyClone	SH3007103	conservare a -10 gradi C a -20 ° C
Kit di analisi Caspase-Glo 3/7	Promega	G8093	Conservare il substrato Caspase-Glo. 3/7 e il tampone Caspasi-Glo. 3/7 a – 20 º C protetto daLight
EDTA, sale disodico, diidrato, cristallo, A.C.S. Reagente	J.T.Baker	8993-01	--
Campione mAb Adalimumab	Probiomed	NA	Le concentrazioni finali nella micropiastra sono:  0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μ g/mL
mAb di riferimento e controllo Adalimumab	Abbvie	NA	Le concentrazioni finali nella micropiastra sono: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μ g/mL
Lettore di micropiastre	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3
	Dispositivi molecolari	-	Incubatore SoftMax Pro 6.3 GxP
	Revco	30482	Revco RNW3000TABB
	L'azienda del fornaio	200256	Panettiere SG603A-HE | Alta efficienza, classe II tipo A2

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