Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Sommario

Questo studio presenta una metodologia per preparare 3D, biodegradabili, schiuma come scaffold cellulari basate su elastomeri cristalli liquidi catena laterale biocompatibili (LCEs). esperimenti di microscopia confocale mostrano che LCEs schiuma come permettere l'attacco, proliferazione, e l'allineamento spontaneo dei mioblasti C2C12s.

Abstract

Qui vi presentiamo una preparazione step-by-step di un 3D, biodegradabili, gomma-come impalcatura delle cellule. Tali ponteggi sono stati preparati mediante reticolazione blocchi a stella copolimeri dotati di unità di colesterolo come gruppi pendenti catena laterale, con conseguente smectic-A (SMA) elastomeri a cristalli liquidi (LCEs). impalcature Schiuma-like, preparati utilizzando forme in metallo, sono dotate di microcanali interconnessi, che li rende adatti come impalcature di coltura cellulare 3D. Le proprietà combinate della struttura regolare della schiuma metallo e del risultato elastomero in un'impalcatura cellule 3D che favorisce non solo superiore proliferazione cellulare rispetto alle tradizionali pellicole templated porosi, ma anche una migliore gestione del trasporto di massa (cioè, nutrienti, gas, rifiuti , ecc). La natura del modello di metallo permette una facile manipolazione del materiale espanso (cioè, rotoli o film) e per la preparazione di supporti di differenti dimensioni dei pori per diversi studi sulle cellule preservando di interfacciamentoted natura porosa del modello. Il processo di incisione non influenza la chimica degli elastomeri, conservando la loro natura biocompatibile e biodegradabile. Abbiamo dimostrato che questi LCEs smectiche, quando coltivato per lunghi periodi di tempo, permettono lo studio di clinicamente rilevanti e complessi costrutti di tessuto, favorendo la crescita e la proliferazione delle cellule.

Introduzione

Esistono numerosi esempi di materiali sintetici biologici e biocompatibili destinati ad essere applicati in studi cellulari e per la rigenerazione tissutale obiettivo di adesione cellulare e la proliferazione ^{1, 2, 3, 4, 5.} Ci sono stati alcuni esempi di materiali biocompatibili, noti come elastomeri a cristalli liquidi (LCEs), che potrebbe rispondere a stimoli esterni con anisotropico molecolare ordinare ^{6, 7.} LCEs sono materiali di stimoli reattivi che combinano le proprietà meccaniche ed elastiche elastomeri con la funzionalità ottica e ordine molecolare di cristalli liquidi ^{8, 9.} LCEs possono sperimentare cambiamenti di forma, deformazione meccanica, comportamento elastico, e proprietà ottiche in risposta a STIM esterniuli (es., calore, stress, luce, ecc) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Studi precedenti hanno dimostrato che i cristalli liquidi (LC) possono percepire la crescita e l'orientamento delle cellule ^{4, 17.} È quindi possibile supporre che LCEs possono essere adatti per applicazioni biologicamente e clinicamente rilevante, compresi ponteggi cellulare e allineamento. Abbiamo già riferito la preparazione di smectiche film biocompatibili, biodegradabili, cast-stampati, e LCEs sottili con un "tipo Swiss-formaggio" morfologia porosa ^{6, 18.} Abbiamo anche preparato LCEs biocompatibili nematici con morfologia sferica come supporti per la crescita cellulare ^{19 , 20. Il nostro lavoro è stato rivolto a punto delle proprietà meccaniche dei materiali da corrispondere a quelli del tessuto di interesse 21. Inoltre, questi studi si concentrano sulla comprensione interazioni elastomero-cellula, così come risposta cellulare quando gli elastomeri sono soggetti a stimoli esterni.}

Le sfide principali erano in parte per adattare la porosità dei LCEs per permettere l'attacco cellulare e permeazione attraverso la matrice elastomerica e per un migliore trasporto di massa. La porosità di questi film sottili ⁶ consentito per permeazione attraverso la massa delle cellule della matrice, ma non tutti i pori erano completamente interconnesso o aveva una dimensione più regolare (omogenea) poro. Abbiamo poi riportato su biocompatibili elastomeri nematici LCE con morfologie globulari. Questi elastomeri nematici consentiti per il fissaggio e la proliferazione delle cellule, ma la dimensione dei pori compresa soltanto 10-30 um, che ha impedito o limitato l'uso di questielastomeri con una più ampia varietà di linee cellulari ^{19, 20.}

Precedente lavoro di Kung et al. relativa alla formazione di schiume grafene utilizzando un modello metal "sacrificale" si evince che la schiuma grafene ottenuto aveva una morfologia porosa molto regolare dettata dal modello metallo scelto ^22. Questa metodologia offre il pieno controllo di porosità e dimensione dei pori. Allo stesso tempo, la malleabilità e flessibilità del modello metallo consentono la formazione di diverse forme template prima della preparazione di schiuma. Altre tecniche, come lisciviazione materiale ^23, templating gas ^24, o fibre elettro-filato ^{25, 26} offrono anche il potenziale per la preparazione di materiali porosi, ma sono più tempo e, in alcuni casi, la dimensione dei pori è limitata a solo pochi micrometri. Schiuma-come LCEs 3D preparati utilizzando forme in metallo consentono una cella di carico più elevato; un tasso di proliferazione migliorata; co-coltura; e, non ultimo, una migliore gestione del trasporto di massa (cioè, nutrienti, gas e rifiuti) per assicurare sviluppo tessuto pieno ^27. LCEs 3D gomma-come appaiono anche per migliorare l'allineamento delle cellule; questo è più probabile in relazione alle pendenti LC sensing crescita cellulare e l'orientamento delle cellule. La presenza di frazioni LC all'interno LCE sembra aumentare allineamento delle celle rispetto alla posizione della cella all'interno del scaffold LCE. Cellule allineati entro i puntoni della LCE, mentre nessun chiaro orientamento si osserva in cui i puntoni uniscono (giunzioni) ^27.

Nel complesso, la nostra piattaforma impalcatura cella LCE fungere da supporto cellulare offre la possibilità di regolare la morfologia elastomero e proprietà elastiche e di indirizzare specificamente l'allineamento (individuali) tipi cellulari per creare un ordine, disposizioni spaziali ocellule F simili ai sistemi viventi. Oltre ad un'impalcatura in grado di sostenere e dirigere la crescita cellulare a lungo termine e la proliferazione, LCEs anche consentire esperimenti dinamici, in cui l'orientamento delle cellule e interazioni possono essere modificate al volo.

Protocollo

NOTA: Le seguenti operazioni per la preparazione 3D LCE gomma-come utilizzando il blocco stella 3-braccio copolimero sono mostrati in Figura 1. Per la caratterizzazione Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), gli spettri vengono registrati in cloroformio deuterato (CDCl ₃₎ a temperatura su uno strumento Bruker DMX 400 MHz camera e internamente riferimento picchi residui a 7.26. Fourier Transform Infrared spettri (FT-IR) vengono registrati con un Bruker Vector 33 FT-IR spettrometro utilizzando la modalità riflettanza totale attenuata. Per ogni passo del seguente protocollo, è importante indossare indumenti protettivi adeguati (DPI).

1. Sintesi di α-cloro-ε-caprolattone (monomero) (secondo il procedimento in Jérôme et al. ²⁸⁾

1. Prima di iniziare la sintesi, purificare 27 g di acido 3-cloroperbenzoico come segue:
   1. In 800 ml di acqua distillata, aggiungere 1,28 g di sodiofosfato monobasico monoidrato e 8,24 g di fosfato di sodio bibasico eptaidrato. Regolare il pH a 7,4 (utilizzando idrossido di sodio o acido cloridrico) e riserva 30 ml di questa soluzione; questa è la soluzione tampone.
   2. Utilizzando un imbuto separatore, sciogliere l'acido 3-cloroperbenzoico in 35 mL di dietil etere. Lavare la soluzione organica con 10 mL di soluzione tampone (preparata nella fase 1.1.1.). Ripetere il lavaggio per tre volte.
   3. Aggiungere 3 g di solfato di sodio direttamente alla soluzione organica; questo agente essiccante assorbe l'acqua dalla soluzione organica.
   4. Filtrare la soluzione per rimuovere l'agente essiccante. Concentrare il filtrato sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante a 850 mbar e 40 ° C.
2. Solubilizzare 18,5 g di purificato acido 3-cloroperbenzoico in 150 mL di diclorometano anidro per agitazione in un bagno ad ultrasuoni; questo processo richiede in genere 20 min. Mettere la soluzione in un imbuto separatore.
3. All'interno di una a due colli, pallone a fondo tondo,sciogliere 13,1 g di 2-chlorocyclohexanone in 15 mL di diclorometano anidro con un agitatore magnetico sotto gas azoto. Continuate a mescolare.
4. Montare l'imbuto separatore contenente soluzione di acido 3-cloroperbenzoico (dal punto 1.2) al pallone a due colli nel passaggio 1.3. Lavare il sistema con azoto. Regolare l'apertura dell'imbuto separatore in modo che la soluzione di acido cloroperbenzoico cade goccia a goccia nella soluzione di 2-chlorocyclohexanone (1 goccia ogni due secondi) e continuare a mescolare la miscela sotto azoto per 96 h.
5. Raffreddare la miscela di reazione a -20 ° C per 1 h per precipitare il sottoprodotto acido m -chlorobenzoic (m -CBA).
6. Filtrare l'acido -chlorobenzoic m (m -CBA) e lavare la soluzione rimanente con soluzioni sature di tiosolfato di sodio, bicarbonato di sodio, e cloruro di sodio.
7. Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 850 mbar e 40 ° C. Purificare il giallo pallido, sapone liquid viscosoid mediante distillazione sotto pressione ridotta a 2,3 Torr e 96 ° C.
8. Monitorare il successo della sintesi utilizzando i seguenti ¹ H NMR picchi. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H ₂ O), 4,18-4,05 (m, 1H , C H ₂ O), e 2,06-1,58 (m, 6H, -CH ₂ -) ^{6, 27.}

2. Sintesi di α-tre braccia Stella copolimero a blocchi (SBC-αCl) da Ring Copolimerizzazione di apertura (Sharma et al. ⁶ e Amsden et al. ²⁹⁾

1. Prima di sintesi, silanizzare un'ampolla 20 mL riempiendolo con (v / v) soluzione al 2% di 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane in toluene e agitazione per circa 24 ore. Lavare con alcool isopropilico e asciugare ponendolo in un forno a 140 ° C per 30 min.
2. Aggiungere 3.64 g di distillato ε-caprolattone, 0,5 g di α-cloro-ε-caprolattone, e 0,25 ml di glicerolo al ampolla. Mescolare con un vortice per 1 minuto.
3. Aggiungere 4,90 g di D, L -lactide per la fiala e spurgo con azoto. Posizionare la fiala in stufa a 120 ° C per fondere il D, L -lactide; questo processo richiede in genere circa 2 ore. Mescolare di nuovo utilizzando un vortice per assicurarsi che tutti i contenuti sono ben miscelati e aggiungere 66 ml di stagno (II) 2-etilesanoato (Sn (ott) ₂₎ alla fiala.
   NOTA: D, L -lactide si raffredda durante questo processo e deve essere ri-riscaldata in forno per fondere.
4. Mescolare energicamente per l'ultima volta con il vortex e lavare con azoto.
5. Chiudere la fiala con un tappo di gomma. Inserire un ago collegato ad un tubo a vuoto (il vuoto casa è di solito sufficiente) attraverso il tappo di gomma. Attivare il vuoto e, utilizzando una fiamma, sciogliere il lungo collo del bicchiere, torcendo lentamente fino alla glass collassa su se stessa. Fare attenzione a non sciogliere il tappo di gomma. Una volta che la fiala è fiamma sigillato, posizionarlo in un bagno di sabbia, un forno, o appropriato elemento riscaldante a 140 ° C per 48 h.
6. Estrarre la fiala e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
7. Rompere la fiala in boa sigillato e sciogliere il liquido altamente viscoso aggiungendo 10 mL di diclorometano. Trasferire la soluzione in un imbuto separatore.
8. Preparare un pallone contenente 100 mL di metanolo freddo (raffreddato con un bagno di ghiaccio secco / acetone a una temperatura di circa -78 ° C). Fissare l'imbuto separatore (passo 2.7) sulla parte superiore del pallone. Regolare l'apertura dell'imbuto separatore in modo che circa due gocce cadono ogni due secondi (a gocce).
9. Raccogliere il precipitato bianco mediante filtrazione (utilizzando un filtro di carta) e asciugare in un forno sotto vuoto tra 50 e 60 ° C.
10. Monitorare il successo della sintesi utilizzando i seguenti ¹ H NMR e FT-IR picchi. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC H C H _3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24-4,12 (m, C H ₂ O), 4,11-4,03 (t, J = 4.6 Hz, C H ₂ O), 3,80-3,68 (m, C H C H _2), 3,09-2,64 (ampio, s, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-), e 1,77-1,25 (m, C H _2, C H _3); FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2.932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, e 735 (m) ^{6, 27.}
    Nota: Per preparare un LCE 3D più idrofila, preparare un copolimero a blocchi lineare (LBC) invece di uno SBC, seguendo la procedura di apertura dell'anello copolimerizzazione (ROP) sopra descritto.
    1. Aggiungere 0,3 g di polietilene glicole (PEG), 3,15 g ε-caprolattone, 1,0 g di α-cloro-ε-caprolattone, e 5,0 g di D, L-lattide al mix flaconcino silanizzato.

3. Modifica sintetico di α-Cl-braccio tre SBC αN ₃ -Three Braccio SBC (SBC-αN ₃₎ (Secondo Sharma et al. ⁶⁾

1. In un pallone a fondo tondo e sotto azoto, sciogliere 5 g di SBC-αCl in 30 mL di N secca, dimetilformammide N'.
2. Aggiungere 0,22 g di sodio azide e lasciare reagire per una notte a temperatura ambiente.
   Attenzione: sodio azide è tossica; indossare indumenti di protezione adeguati (DPI).
3. Rimuovere la N, N-dimetilformammide' sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 11 mbar e 40 ° C. Sciogliere il composto in 30 mL di toluene. Centrifugare la soluzione tre volte a 2800 xg per 15 minuti per eliminare il sale formatosi. Evaporare il toluene sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 77 mbar e 40 ° C.
4. Monitorare il successo della sostituzione azide mediante ¹ H NMR e FT-IR picchi.
   NOTA: ^{Spettro 1 H NMR era simile al genitore SBC-αCl, con l'eccezione della comparsa di un picco a 3,90 ppm riferite al gruppo azide; FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2.928, 2.108 (s, azide), 1.754 (s), 1.450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), e 696 (m).}

4. Sintesi di Cholesteryl 5-Hexynoate (LC Moiety) (Secondo Sharma et al. ⁶ e Donaldson et al. ³⁰⁾

1. In un pallone a fondo tondo, miscela 3 g di acido 5-hexynoic e 130 mL di diclorometano. Raffreddare a 0 ° C con un bagno di ghiaccio.
2. In un altro pallone a fondo tondo, mescolare 8,28 g di N, N -dicyclohexylcarbodiimide', 10,3 g di colesterolo, e 0,2 g di 4-dimetilamminopiridina.
3. Trasferire la soluzione di acido 5-hexynoic goccia a goccia al pallone contenente la miscela colesterolo e mantenere la miscela finale a 0 ° C per 1 h.
4. Lasciare il composto si riscaldi a temperatura ambiente per una notte.
5. Rimuovere la dicicloesilurea precipitato risultante mediante filtrazione con un filtro di carta di grado 415 e scartarla.
6. Concentrare il filtrato sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 850 mbar e 40 ° C. Sciogliere il residuo raccolto in 150 ml di esano.
7. Evaporare il solvente sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 335 mbar e 40 ° C. Aggiungere 350 ml di etanolo al residuo oleoso per raccogliere il prodotto finale. Lavare il solido biancastro formata con etanolo e asciugare il prodotto solido sotto vuoto a 50 ° C.
8. Monitorare la sintesi utilizzando i seguenti ¹ H NMR e FT-IR picchi. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C = C H), 4,70-4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2.5 Hz, 2H, C H ₂ CO), 2,34 (m, 2H, H C ₂ -C = H), 2,31 (m, 2H, C H ₂ C H ₂ COO), 2,28 (s, 1H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2.3 Hz, 2H, ≡CC H _2), 2,07-1,06 (m, 2H, C H _2, C H), 0,94 (s, 3H, C H _3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H ₃ C H), e 0.88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H ₃ -C H), 0,67 (s, 3H, C H _3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2,830-2,990 (ampio e forte picco), 2.104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1.135 (m), 999 (s), 798 (s), e 667 (s).

5. Modifica sintetico di α-N ₃ -Tre Braccio SBC di alfa-del colesterolo-braccio tre SBC (SBC-αCLC) tramite una reazione Azide-Acetilene Huisgen Cyclo-addizione ( "Click" Reaction) per ottenere SBC-Chol (Secondo Sharma et al. ⁶⁾

1. In un pallone a fondo tondo, sciogliere 1 equivalente molare di SBC-αN ₃ (1,5 g) in 100 mL di tetraidrofurano distillata di fresco (THF). Aggiungere 1,2 equivalen molarit di colesteril-5 hexynoate (1,94 g), 0,1 equivalenti molari di rame (I) ioduro (0,06 g), e 0,1 equivalente molare di trietilammina (0,03 g). Agitare la miscela per una notte a 35 ° C sotto azoto.
2. Evaporare il solvente sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 357 mbar e 40 ° C.
3. Sciogliere la miscela residua in 80 mL di diclorometano e centrifugare per 5 min a 2800 xga temperatura ambiente per rimuovere i materiali non reagiti e prodotti collaterali.
4. Monitorare la sintesi utilizzando i seguenti ¹ H NMR e FT-IR picchi. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazolo), 5,43-5,34 (m, C = CH colesterolo), 5,10-5,06 (m, COCHCH _3), 4,68 -4,55 (m, O-CH colesterolo), 4,24-4,19 (m, CH ₂ O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH ₂ O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH ₂ O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH _2), 2,31-2,25 (m, COCH _2), 2,07-1,02 (m, CH ₂ , CH _3), 1,05-1,03 (s, CH _2, CH _3), 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH _2, CH _3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH _3), e 0,71-0,68 (s, CH _3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 3.260 (s), 2.920 (s), 1710 (s), 1.460 (s), 1.370 (s), 1.240 (m), 1190 (s), 733 (s), e 668 (s).

6. Sintesi di 2,2-bis (1-caprolattone-4-il) propano (Crosslinker, BCP) (Secondo Gao et al. ²⁷ e Albertsson et al. ³¹⁾

1. In un pallone a fondo tondo, preparare una soluzione contenente 10,8 g di 2-bis (4-idrossi-cicloesil) propano e 52 ml di acido acetico.
2. Preparare una soluzione contenente 11 g di triossido di cromo in 50 mL di acido acetico e 8 ml di acqua distillata. Aggiungere questa soluzione goccia a goccia alla soluzione preparata nella fase 6.1, mantenendo la temperatura della miscela tra 17 e 20 ° C (ad esempio, in unbagnomaria); questo processo richiede goccia a goccia 2 h. Una volta che il processo è completo, riportare la soluzione a mescolare per circa 30 min.
3. Aggiungere 50 ml di 2-propanolo. Agitare la soluzione notte a temperatura ambiente.
4. Concentrare la soluzione viola scuro sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 137 mbar e 40 ° C. Aggiungere 300 ml di acqua distillata per precipitare; il precipitato deve essere leggera viola.
5. Filtrato il prodotto grezzo utilizzando un filtro di carta di grado 415. Lavare il materiale solido con ~ 250 mL di acqua distillata o finché il solido diventa bianco.
6. Sciogliere il materiale solido in 15 mL di benzene a 40 ° C e lasciate ricristallizzare a 25 ° C.
7. Aggiungere 8,34 g di dichetone secca disciolto in diclorometano anidro ed una soluzione contenente 6,0 g di acido 3-cloroperbenzoico in 75 mL di diclorometano nel matraccio.
8. Riflusso la soluzione a 40 ° C per 24 h.
9. Raffreddare la miscela di reazione a -20 ° C per 10 minuti per precipitare il m -chlorobenzoic sottoprodotto acido.
10. Rimuovere l'acido -chlorobenzoic m per filtrazione (utilizzando un filtro di carta) e concentrare la soluzione a pressione ridotta.
11. Lavare il prodotto grezzo di viscosa con 200 ml di 2-eptanone ed essiccare il precipitato sotto vuoto a 50 ° C durante la notte.
12. Monitorare la sintesi utilizzando i seguenti ¹ H NMR e FT-IR picchi. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H ₂ OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H ₂ OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -CH ₂ CH ₂ OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H ₂ C H ₂ COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH _{3) 2),} 0,84 (s, 6H, C H ₃ C-).

7. Creazione di Porous 3D elastomero impalcatura Utilizzando uno esametilendiisocianato (HDI) o 2,2-bis (1-caprolattone-4-il) propano (BCP) ²⁷ come reticolante (Secondo Gao et al. ²⁷⁾

1. Preparare miscela di elastomero tre bracci utilizzando 0,75 g di SBC-αCLC aggiungendo 0,25 mL di HDI (o 0,45 ml di BCP) e 0,24 mL di acqua distillata monomero ε-caprolattone. Aggiungere 60 ml di Sn (ottobre) _2. Se si utilizza BCP invece di HDI, mescolare SBC-αCLC e BCP utilizzando un vortice e metterli in forno a 140 ° C fino a quando la BCP fonde e si dissolve completamente (questo passaggio può richiedere fino a 2 ore). Una volta che la BCP è stato sciolto, estrarlo dal forno e, Sn (ottobre) _2, e vortex.
2. Preparare un modello di spugna di nickel "sacrificale" tagliando un pezzo di metallo cm 1 x 4. Rotolare da uno dei lati corti in modo che il rotolo finale è di circa un pezzo metallico 1 x 1 cm (vedi Figura 4).
3. Inserire la spugna di nickel in un pacchetto foglio fiala in vetro o alluminio e versare il composto preparato al punto 7.1 a coprire completamente la schiuma per 2 min. Rimuovere l'impasto in eccesso con una pipetta Pasteur. Lasciarlo in una notte forno a 80 ° C.
4. Staccare il foglio di alluminio o rompere il vetro. Utilizzando una lama di rasoio, radere l'elastomero intorno alla schiuma metallica per esporre il metallo nichel.
5. Preparare la soluzione in 100 mL di acqua 1 M di ferro (III) cloruro (FeCl _3). Mettere la schiuma in un pallone e aggiungere 70 ml di FeCl ₃ soluzione. Mescolare per tre giorni a temperatura ambiente e cambiare il ₃ soluzione di FeCl ogni giorno. Prima di ogni cambiamento, mescolare la schiuma con acqua ionizzata per 0,5 h.
   NOTA: Il processo di incisione è tipicamente completato dopo tre giorni. Per garantire che il processo di attacco viene completata, effettuare prove di compressione tattili fino schiume ritengono molli. resistenza schiuma per prove di compressione tattili indica la presenza di un modello di metallo residuo.
6. Sciacquare l'elastschiuma omer con etanolo e posto in un forno sotto vuoto per una notte a 40 ° C.
7. Caratterizzare i materiali utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM), calorimetria a scansione differenziale (DSC), prove di compressione meccanica, e analisi gravimetrica termica (TGA) ^27.
   NOTA: Nel preparare un LCE 3D più idrofila, sostituire lo SBC con LBC (assicurandosi che il LBC contiene anche una porzione LC) seguendo la procedura descritta nel passaggio 7.5.

8. Semina di elastomero Ponteggio a cellule SH-SY5Y neuroblastoma e coltura utilizzando tecniche sterili

1. Sterilizzare l'elastomero lavandolo due volte con 1 ml di etanolo al 70%. Eseguire irradiazione UV per 10 minuti e lavare con 1 ml di etanolo al 70%. Risciacquare due volte con 1 ml di acqua sterile e 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Posizionare gli elastomeri in piastre di coltura da 24 pozzetti.
2. Preparare terreno di coltura cellulare per SH-SY5Y contenente il 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplemENTED con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (Pen-Strep).
3. Dopo contando le cellule utilizzando un hematocytometer, preparare 1,5 x 10 ⁵ cellule SH-SY5Y sospesi in 100 ml di mezzo di crescita (soluzione seme). Aggiungere la soluzione sulla parte superiore degli elastomeri, avendo cura di formare una goccia.
4. Incubare le elastomeri seminati a 37 ° C e 5% CO ₂ per 2 h per favorire l'adesione delle cellule. Aggiungere 0,5 ml di terreno di coltura. Incubare nuovamente a 37 ° C con 5% di CO _2.
5. Cambiare il mezzo di ogni altro giorno dopo il lavaggio con 1 ml di PBS.

9. Imaging microscopico di elastomero Construct

1. Fissare le cellule cresciute su elastomeri con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 min. Risciacquare con 3 mL di PBS tre volte per 5 minuti ciascuno e posizionare l'elastomero con le cellule fissate in un piatto di coltura con un coprioggetto allegata.
   Attenzione: PFA è tossico. Indossare indumenti di protezione adeguati (DPI).
2. Stanei campioni fisse con 0,1% di 4' , 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in 500 ml di PBS per 10 minuti e risciacquare due volte con 1 ml di PBS per 5 min.
3. Immediatamente immagine elastomeri usando la microscopia confocale a fluorescenza con DAPI, acquisendo pile di immagini che abbracciano il campione.
   NOTA: Qui, pile di immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 20X e un obiettivo 60X.
4. Analizzare le pile di immagini confocale ottico utilizzando ImageJ ^32.

Risultati

Questo rapporto mostra il metodo di preparazione di un LCE 3D poroso come impalcatura per la coltura cellulare utilizzando un modello di nichel metallico. Il ottenuto 3D LCE dimostra una complessa rete di canali interconnessi che permette una facile infiltrazione di cellule, così come più adatto trasporto di massa ^27. Si è constatato che le cellule sono in grado di penetrare completamente la rete di canali interconnessi e sono anche in grado di allineare all'i...

Discussione

elastomeri liquido cristallini sono stati recentemente studiati come scaffold cellulari biocompatibili a causa della loro reattività stimoli. Essi hanno dimostrato di essere le piattaforme ideali come ponteggi cellulari. Tuttavia, un fattore importante da tenere a mente durante la preparazione e la progettazione di un nuovo scaffold LCE è la porosità. L'incorporazione di solidi lisciviabili ²³ o gas non sempre comporta porosità omogenea o pori completamente interconnessi. L'uso di un mode...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottiltrietossisilano	Alfa Aesar	L16606	Agente silanizzante
2-bis(4-idrossi-cicloesil)propano	TCI	a href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928	Reagente
2-cloroesanone	Alfa Aesar	A18613	Reagente
2-eptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvente
2-propanolo	Sigma Aldrich	278475	Solvente
acido 3-cloroperbenzoico, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagente
4-dimetilamminopiridina	Alfa Aesar	A13016	Reagente
4',6-diamidino-2-fenilidolo, DAPI	Invitrogen	D1306	Colorazione nucleare
Acido 5-esinoico	Alfa Aesar	B25132-06	Reagente
Acido acetico	VWR	36289	Solvente
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvente
Alcool 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagente
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvente
ε-caprolattone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagente
Cloroformio	VWR	BDH1109	Solvente
Colesterolo	Sigma Aldrich	C8503	Reagente
Ossido di cromo (VI)	Sigma Aldrich	232653	Reagente
Ioduro di rame (I)	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagente
Diclorometano	Sigma Aldrich 320269		Solvente
Etilico etere	Emd Millipore	EX0190	Solvente
N,N-Dimetilformammide	Sigma Aldrich	270547	Solvente
Dulbecco' s modificato Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Etanolo	Alfa Aesar	33361	Solvente
Formaldeide	SIGMA Life Science	F8775	Siero
fetale fissativo per bovini, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Carta da filtro, Grado 415, qualitativa, crespa	VWR	28320	Filtrazione
Glicerolo	Sigma Aldrich	G5516	Nodo centrale (3 bracci)
Esametilene diisocianato, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Ferro (III) cloruro	Alfa Aesar	12357	Agente mordenzante
Alcool isopropilico	VWR	BDH1133	Solvente
Metanolo	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N'-dicicloesilcarbodiimmide	Aldrich	D80002
SolventeN,N-Dimetilformammide	Sigma Aldrich	270547	Solvente
Modello in metallo nichel	American Elements	Ni-860	Modello in schiuma
Cellule di neuroblastomi (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Linea cellulare
Streptomicina penicillina	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotici
Polietilenglicole 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagente
Sodio azide	VWR	97064-646	Reagente
Bicarbonato di sodio	AMRESCO	865	Sale essiccante
Cloruro di sodio	BDH	BDH9286	Sale essiccante
Fosfato di sodio eptaidrato bibasico Fisher	Scientific	S-374	Sale essiccante
Fosfato di sodio monobasico monoidrato	Sigma Aldrich	S9638	Sale essiccante
Solfato di sodio	Sigma Aldrich	239313	Sale essiccante
Tetraidrofurano	Alfa Aesar	41819	Solvente
Tiosolfato di sodio	AMRESCO	393	Sale essiccante
Stagno (II) 2-etilesanoato	Aldrich	S3252	Reagente
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvente
Trietilammina	Sigma Aldrich	471283	Reagente
Tripsina	HyClone	SH30042.01	Distacco di cellule
Olympus FV1000