Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell'arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine e l'identificazione dei tipi di cellule nell'intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.
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Articolo metodologico
En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sezioni di tessuti embedded di paraffina vengono utilizzati abitualmente per lo studio dell'istologia del tessuto e dell'istopatologia. Tuttavia, è difficile determinare ciò che la morfologia tissutale tridimensionale deriva da tali sezioni. Inoltre, le sezioni dei tessuti esaminati non possono contenere la regione all'interno del tessuto necessaria ai fini dello studio in corso. Questa ultima limitazione ostacola gli studi istopatologici dei vasi sanguigni poiché le lesioni vascolari si sviluppano in modo focalizzato. Ciò richiede un metodo che ci permette di rilevare un'ampia area della parete del vaso sanguigno, dalla sua superficie fino alle regioni più profonde. Una preparazione completa dei vasi sanguigni è in grado di soddisfare questo requisito. In questo articolo dimostreremo come fare preparazioni in faccia dell'arte del topo e dell'arteria carotide e di immunofluorescenziarle per la microscopia confocale e altri tipi di immagini a base di fluorescenza.
Introduzione
Per gli studi istopatologici mediante microscopia leggera, i pezzi tridimensionali di tessuti biologici sono trattati in modo ordinario per l'embedment di paraffina seguito da sezionamento e colorazione. Un campione di tessuto che è stato incorporato in paraffina può essere di parecchi millimetri in tutte e tre le dimensioni. Tuttavia, ai fini della microscopia leggera, deve essere prima sezionato in modo che la luce possa passare e poi venire macchiata in modo che la sezione sottile abbia abbastanza contrasto per l'imaging. Poiché gli esemplari tagliati sono di solito 5-10 μm di spessore, si vede solo una frazione molto piccola dell'intero campione in du....
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Protocollo
I protocolli per la legatura parziale dell'arteria carotide del mouse e l'isolamento dell'arte del topo e dell'arteria carotide per l'immunocoltura del viso sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IBT 2014-9231).
1. Ligation di arteria carotide parziale sinistra
- Preparare lo spazio chirurgico mettendo un tavoletta da 12 pollici da 14 pollici sul tavolo e coprire il tappetino e la tavola con un grande teli chirurgici puliti. Regolare il braccio del basamento del braccio in modo che il campo visivo dello stereomicroscopio sia nell'area centrale del piano di riscalda....
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Risultati
Un'immagine immunofluorescenza tipica dell'endotelio è mostrata in Figura 3 . Questa immagine mostra una singola sezione ottica di un aorta di topi prese vicino all'apertura di un'arteria intercostale (la grande zona di uovo scuro). L'aorta è stato duplicato con anti-VE-cadherina (verde) e anti-VCAM-1 (molecola adesione cellulare vascolare-1) (rosso). Ogni cellula endoteliale è delineata con una colorazione lineare verde alla giunzione aderente. A cau.......
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Discussione
Quando si manipolano con i vasi sanguigni del mouse, è importante ricordare che l'endotelio è fragile e che qualsiasi eccessiva forza meccanica danneggerà le cellule endoteliali. Ad esempio, le cellule endoteliali si rompono o si staccano dalla parete del vaso se la vasca viene perfusa troppo forte, cosa che può accadere facilmente quando la vasculatura viene perfusa usando una siringa a mano.
Per ottenere una pressione costante di perfusione, usiamo un sistema di perfusione gravitaziona.......
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Ringraziamenti
Le attività di ricerca degli autori sono sostenute da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale di Salute al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione iniettabile di cloruro di sodio allo 0,9% USP Sacca da 500 ml | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| Piastre a 12 pozzetti | Fisher Scientific 12556005 | ||
| Sutura vicryl rivestita 6-0 | Ethicon | J833G | |
| AF488 capra anti-ratto IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 capra anti-coniglio IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) IgG policlonale di coniglio Santa | Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 pollici x 24 pollici | Cardinal Health | 4024 | |
| Divaricatori smussati, 2,5 mm di larghezza | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofene (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Scrub alla clorexidina, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Spugne di garza Curity 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Termoforo elettrico, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Forcipe Graefe extra fine | Strumenti per la scienza fine | 11152-10 | |
| Forbici | per irideFine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro vetro di copertura 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| di capra normale | Equitech-Bio | GS05 | |
| Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Piastre di Petri 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant con DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Tamponi di cortton puritani | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini aplicatori con punta in cotone | VWR | 82004-050 | |
| Porta ago con manico rotondo | Strumenti per scienze fini | 12076-12 | |
| Sutura in seta 6/0 | Scienze fini Strumenti | 18020-60 | |
| Forbici a molla | ROBOZ | RS-5601 | |
| Forbici per strabismo | Strumenti per scienze fini | 14075-09 | |
| Pinze Super Grip | Strumenti per scienze fini | 00649-11 | |
| Medicazione trasparente | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Riferimenti
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
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Ristampe e permessi
