Summary
该协议描述了将啮齿动物暴露于电子烟蒸气（E蒸汽）和香烟烟雾的方法。通过用自动泵送系统修改麻醉室来构建暴露室，其将电子蒸气或香烟烟雾传递给啮齿动物。该系统可以轻松修改，以适应许多实验端点。
Abstract
电子香烟（电子烟 ）正在被广泛使用，并越来越受欢迎。据估计有超过900万成年人经常使用它们。电子烟雾（E-vapor）暴露潜在的不良健康影响定义不明确。虽然已经开发了几种动物模型的电子 蒸气暴露，但很少有模型将啮齿动物暴露于临床相关量的尼古丁，并在同一暴露系统内直接与香烟烟雾进行比较。在这里，我们提出了一个构建和操作E 蒸气室和香烟烟雾室的方法。这些室是通过装备有麻醉室的计算机控制的泵送系统构成的，其输送一定量的E尼古丁暴露量通过量化前后暴露后的血清可替宁水平进行间接测量，该暴露系统可以修改以适应各种类型的电子 烟和烟草香烟，并且可以用于比较电子 烟和香烟烟雾在体内的影响 。
Introduction
自从2004年进入美国市场以来，电子香烟（电子香烟）已经扩大到十亿美元的行业，据估计有近900万成年人经常使用它们1 。在2014年和2015年，更多的高中生使用电子香烟比传统香烟2 。越来越多的电子烟用户已经开展了一项研究工作，以评估其潜在的不利健康影响。
电子香烟通过加热通常含有水，聚乙二醇或植物甘油，尼古丁和调味剂3,4的混合物的粘稠溶液产生蒸汽（称为“E蒸气”）。已经表明，电子蒸气含有几种有害化合物，包括活性氧物质（ROS），尼古丁，各种醛和多环芳烃5 ，6。许多这些化合物在吸入之前的E液体的蒸发过程中形成7 。值得注意的是，这些有害化合物中的几种也存在于香烟烟雾中，引起人们关注的是，电子烟使用可能具有类似的不良健康后果7 。
对电子香烟的健康影响几乎没有共识。为了解决这个问题，已经开发了几种电子蒸气暴露的动物模型（ 表1 ）。这些模型采用各种方法，如全身电子蒸气暴露和机械通气。虽然目前的模型已经提供了有见地的数据，但很少能够在同一曝光系统中直接比较香烟烟雾（ 表1 ）。此外，虽然几项人类研究显示，电子烟用户和吸烟者的血清可替宁水平在30-200ng / mL之间，但许多型号的电子蒸气和香烟烟雾暴露量下降这个范围是8，9，10，11，12。
在这里，我们提出一种比较香烟烟雾和体内电子蒸气暴露的影响的方法 ，产生与人类研究相似的血清可替宁水平。
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Protocol
以下协议是在密歇根大学体育动物护理和使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行的。
电子烟气室组装
注意：使用过程中，整个室应放置在通风橱中。这里的室被安置在温度控制和过滤的实验室环境中。调查员可以选择监测系统的这些方面，以确保房间空气质量的一致性。作为选择，用金属笼盖覆盖显示器可以防止啮齿动物篡改，同时允许监视器对室内环境进行采样。
- 获得体积为20升的带气密性可拆卸盖的麻醉室。
- 使用装有适于切割材料的刀片的夹具锯，在室的盖子上切下10.2厘米直径的孔，距离后边缘大约7.6厘米室。
- 将可调节排气孔插入孔中，并用任何填缝胶粘固定到位。
注意：确保胶囊不能接触到室内的啮齿动物，因为它们可能会堵塞填隙物。为了防止这种可能的问题，将填缝物施加到室壁的外部以安装通风口。 - 将硅胶管切成两个15厘米的段，并将端部连接到T型连接器的两侧。
注意：硅胶管有可能与电子蒸气或香烟烟雾的某些组分发生反应。因此，研究者可以考虑使用非反应性管。 - 通过在室盖前部附近的预制孔将两个硅胶管穿过，使得T型连接器在室内。确保使用粘合剂填缝或电气胶带将管道固定到盖子上。
- 将硅胶管的自由端连接到两个微型气泵的输出端。泵应安装在室内的盖子上，双面胶带或填缝料。
注意：连接到泵的输出端的管子的长度应该很短，以限制使用过程中管道内表面的蒸气收集量。 - 使用新的硅胶管，将一端连接到其中一个空气泵（ 图1中的泵A）的输入侧，并将该管切割成约4厘米长。这是在室使用期间将插入电子烟的地方。确保管的直径允许在电子烟囱末端附近贴合。
- 使用新的硅胶管，将一端连接到另一个空气泵的输入侧（ 图1中的泵B）。该泵将室内空气引入。因此，管的端部必须放置在通风橱的外面。该管的长度不是关键的，但应尽可能短以限制气流阻力。
- 在室内安装两个小钩，双面胶，以保持oxygen和一氧化碳气体监测仪。
电子烟雾室示意图。
室内装有通风橱（未显示）。室内空气泵（B泵）将通风柜外部的室内空气以2L / min连续引入室内。 E-cig泵（泵A）在4秒内抽出133毫升的电子蒸气，30秒的休息间隔。电蒸汽和室内空气混合，然后泵入室内。气体监测器连续测量室内的一氧化碳（CO）和氧（O 2 ）浓度。电子蒸气被动地通过通风橱通风。 请点击此处查看此图的较大版本。
香烟烟雾室装配
注：几乎任何品牌of香烟可以与该系统一起使用，但是标准化的研究香烟，如肯塔基大学1R6F研究香烟是经济高效，可靠和最适合这种应用。
- 按照步骤1.1 - 1.6和步骤1.9。
- 使用新的硅胶管，将一端连接到香烟照明装置，另一端连接到空气泵的输入侧（ 图2中的泵A）。香烟照明装置应在使用过程中放置在通风橱内和室外。
注意：构建香烟照明装置需要知道金属制造和电气工程。虽然这里不再提供一步一步的施工指南，但请参阅计划的补充材料。 - 使用新的硅胶管，将一端连接到另一个空气泵（ 图2中的泵B）。该泵将室内引入室内空气，因此管的端部必须放置在通风橱的外部。 >
- 在腔室的前壁中切割几个5 mm宽的垂直狭缝，并将计算机风扇安装在腔室的外部，使其覆盖该开口。确保风扇的前部面向室，使风扇通过该开口将空气吹入室内。
图2.香烟烟雾室示意图。
室内空气泵（B泵）将通风柜外部的室内空气以2L / min连续引入室内。泵A以2升/分钟的速度吸入点燃的香烟40秒，20秒后，电脑风扇在3分钟内排空。抽烟和室内空气混合，然后泵入室内。气体监测器连续测量一氧化碳（CO）和氧（O 2 ）室浓度。烟雾通过通风橱排空。ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
3.微控制器装配和软件
- 通过单独的微控制器控制电子烟雾室和香烟烟雾室的泵送系统。下载微控制器软件并上传S 辅助材料中提供的操作代码。电子香烟蒸汽代码将连续运行室内空气泵，并每30秒激活电子烟泵持续4秒。香烟烟雾代码将连续运行室内空气泵，启动香烟泵40秒，并在香烟泵停止后启动计算机风扇20s。运行3分钟后，风扇将关闭。
注意：泵和风扇的时间可以根据需要进行调整。参考制造商有关如何将相关代码上传到微控制器的说明。 - 装配如图3所示，将拉线，二极管，电阻和电容器连接到面包板，并将鳄鱼夹线连接到相应的空气泵（以及用于香烟烟雾室的计算机风扇）。如果可能的话，将微控制器放在通风橱外面。
图3.微控制器示意图。
单片机和面包板的原理图，用于操作空气泵和风扇的时序。 请点击此处查看此图的较大版本。
动物
- 使用体重450-520克的成年老鼠。
- 根据暴露类型（ 例如 ，电子烟，香烟烟雾，室内空气泵入室）组大鼠。
- 在这个时候若要暴露，请使用注射器从尾静脉采集EDTA涂层管中的500μL血液，以测量基线血清可替宁浓度。
- 在4℃下以20,000xg的速度旋转30分钟，收集血清。确保样品在整个过程中在冰上冷藏。
- 按照制造商方案，收集血清样品中可替宁的检测。样品也可以储存在-80℃以供以后使用。
5.操作电子烟雾室
- 用70％乙醇清洗室内，然后用去离子水清洗室内空气，直到室完全干燥（或约30分钟）。
- 校准气体监测器并将整个显示器安装在腔室内的墙壁上。
- 将大鼠放在室内。请注意，最多可以同时暴露三只动物。
- 确保电子烟充满充足的电子液体并插入电子烟进入输入管。在90分钟暴露的持续时间内，确保电子烟电池和电子液体含量是足够的。
- 打开空气泵，然后启动定时器。
- 在曝光期间观察气体监测器以确保室含有> 20％O 2和0ppm CO。
注意：如果氧气含量下降，腔室通风不良或氧气监测仪可能无法适当校准。 - 曝光时间达到90分钟后，取出电子烟，继续运行气泵，排出剩余的蒸气。此外，可以提升室的顶部以加速通风。
- 蒸汽清除后，取出大鼠并清洗腔。
- 在实验方案结束后约1小时，从每只大鼠尾静脉采集500μL血液。
- 按照步骤4.4 - 4.5分离血清和检测可替宁。
- 按照步骤5.1 - 5.3。
- 将香烟插入香烟照明装置，香烟的末端与加热元件相连。
- 打开香烟照明设备，直到烟头开始闷热（约5秒钟）。
- 一旦香烟点亮，打开泵送系统，启动计时器，并观察香烟燃烧完成（约40秒）。
- 一旦香烟燃烧，请用镊子小心地从香烟照明设备中取出废香烟。
- 确保CO含量不超过1000ppm，O 2水平不低于20％。计算机风扇的时序和持续时间对于防止一氧化碳的积聚至关重要。
- 4分钟后，关闭泵送系统并返回步骤6.2，直到大鼠暴露于烟草烟雾90分钟（或约23支香烟）。
注意：一氧化碳含量在香烟头4分钟后ning应低于400 ppm，否则一氧化碳可能开始积聚在室内。 - 当曝光完成时，继续离开泵送系统以使残余烟雾通风。当一氧化碳低于100ppm时，从室中除去大鼠。这应该需要5 - 10分钟。
- 取出老鼠并清理腔室。
- 在实验方案结束后，大约1小时后从尾静脉收集500μL血液，与电子香烟一样。
- 按照步骤4.4 - 4.5分离血清和检测可替宁。
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Representative Results
一氧化碳和氧气监测
在电子蒸气暴露过程中，氧浓度不低于20％，CO浓度在整个曝光期间仍然不可检测。香烟烟雾暴露期间的气体监测仪表明，氧气浓度保持在20％以上。一氧化碳浓度不超过1,000ppm（ 图4 ）。
图4：香烟烟雾室中的一氧化碳浓度。在引入来自1R6F香烟的烟雾的过程中，每30秒记录一氧化碳浓度。显示的结果是3连续4分钟循环的平均值。一氧化碳浓度不超过1,000ppm。香烟在40秒内燃烧完成，风扇启动d 20秒后（ 即点烟后1分钟风扇启动）。
前和后暴露血清Cotinine
E-vapor组（n = 3）的暴露前和1小时暴露后血清可替宁分别为4.2±0.4ng / mL和171.6±20.5ng / mL。吸烟前后1小时吸烟组（n = 3）后血清可替宁分别为3.9±0.3 ng / mL和98.8±2.1 ng / mL（ 图5 ）。
图5：香烟烟雾或电子烟雾暴露后的血清Cotinine水平。血清可替宁在方案开始前和在90分钟暴露时间后1小时测量。电子蒸汽组暴露前和暴露后1小时血清可替宁为4.2±0.4 ng / mL and为171.6±20.5ng / mL。吸烟前1小时和吸烟后1小时血清可替宁分别为3.9±0.3 ng / mL和98.8±2.1 ng / mL。前后暴露后血清可替宁浓度差异具有统计学意义。 * P <0.05。
图6：电子烟雾室和香烟烟雾室。通风橱内电子烟蒸气（右）和香烟烟雾室（左）的图像。红色框包含微控制器。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 动物模型 | <强>电子烟 | 烟草卷烟 | 参考 | |||
| 曝光方法 | 模型生物 | 品牌（尼古丁） | 氨苄青霉素/ mL（血清，[尿]） | 牌 | 氨苄青霉素/ mL（血清，[尿]） | |
| 全身暴露 | C57BL / 6J小鼠 | Joytech 510-T（1.8％） | 62.3±3.3，[892.5±234] | N / A | N / A | 麦格拉思 - 莫罗 |
| 机械呼吸机 | BALB / cJ小鼠 | 没有报道 | [400 - 500] | 没有报道 | [500 - 800] | Ponzoni |
| 全身暴露 | CD-1小鼠 | 多重*（0.6 - 24％） | 没有报道 | N /一个 | N / A | 黄禹锡 |
| 全身暴露 | Wistar白化大鼠 | 自由T（0.9％） | 没有报道 | 没有报道 | 没有报道 | Salturk |
| 全身暴露 | C57BL / 6小鼠 | NJOY（1.8％） | 267±17 | N / A | N / A | Sussan |
| 全身暴露 | C57BL / 6J小鼠 | CoolCart，蒸汽泰坦 | 500±10 | 3R4F参考香烟 | 76±7.6 | Husari |
| * Xtreme Vaping，Vapure，Vape Addict Juice，Grimm Creations，Green Smart Living，Free Masons Elixer | ||||||
表1：电子烟雾暴露模型的特征。
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Discussion
在这里，我们描述了一种建立以受控方式将啮齿动物暴露于电子烟和香烟烟雾的室的方法（ 图6 ）。与商业曝光系统14,15,16相比，电子烟雾室的构造相对简单和便宜。建立房间所需的部件和工具可从商业供应商在线获得。类似地，除了必须制造的香烟照明装置之外，构建香烟烟雾室是相对简单的（参见用于计划的补充材料 ）。
一旦房间被构造，暴露系统的关键步骤就是对室进行校准，以将啮齿动物暴露于希望量的尼古丁。在电子烟盒和香烟盒中，调整总曝光量time也许是增加或减少尼古丁暴露量的最简单的方法。增加电子香烟暴露系统中的抽吸时间可能会增加尼古丁的剂量，但是延长电子烟卷烟的蒸气长时间已被证明会增加ROS，醛类和其他有害化合物的含量，或者可能不反映电子烟用户的典型习惯5 。可以通过修改上传到微控制器的代码来调整抽吸持续时间和总曝光时间。此外，应注意的是，电子烟溶液中的尼古丁浓度以及电子烟加热元件的电压可能会发生显着变化，在校准系统时应予以考虑。
这种曝光系统的最大优点之一是其多功能性。几乎任何品牌的e-cig或e-cig解决方案都可以用于该系统。这是一个特别有用的功能因为电子烟市场现在包括400多个品牌和数以千计的电子烟解决方案13 。此外，暴露系统与多个实验终点兼容，允许电子香烟对各种器官系统和疾病过程的影响进行研究。我们还承认，这种暴露范例有几个限制，例如动物暴露于蒸气的方法。电子烟用户直接吸入电子蒸气，而在这种范式中，啮齿动物被动地吸入电子蒸气。此外，啮齿动物还可能通过其他途径吸收蒸汽或烟雾中的化合物（ 即 ，直接吸收皮肤，并在吸食时）。然而，我们认为曝光系统的好处远远超过了限制。
总的来说，这种曝光范例提供了一致和临床相关的电子烟和香烟烟雾暴露，并可能有所帮助帮助研究工作确定电子烟和香烟烟雾对健康的负面影响。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项研究是通过主动脉研究基金（密歇根大学）给Eliason博士做出的。作者还要感谢密歇根大学工厂运营标志和图形部的Nick Scott，协助设计和组装卷烟照明设备。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blu PLUS Rechargeable Kit | blu eCigs | N/A | |
| 1R6F Reference Cigarettes | Center for Tob Ref Prod UK | N/A | |
| Lexan Anesthesia Chamber 20 L | Jorgensen Laboratories | JOR265 | |
| Arduino UNO | Arduino | 2877 | |
| Diode Rectifier - 1 A; 50 V | Spark Fun | COM-08589 | |
| Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack | Spark Fun | COM-11508 | |
| Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V | Spark Fun | COM-00096 | |
| Solderless Plug-in BreadBoard | BusBoard Prototype Systems | BB400 | |
| Alligator-Clip Wires | BusBoard Prototype Systems | CA-M-20 | |
| ZipWire | BusBoard Prototype Systems | ZW-MM-10 | |
| Standard Fan 80 ST2 | Cooler Master | R4-S8R-20AK-GP | |
| ARIC 4" adjustable vent | Bestlouver | N/A | |
| ToxiPro Carbon Monoxide (CO) Monitor | Honeywell Analytics | 54-00-10316 | |
| ToxiPro Oxygen (O2) Monitor | Honeywell Analytics | 54-45-90-VD | |
| ToxiPro IQ Express Docking Station | Honeywell/Sperian Biosystems | 54-46-9100 | |
| Command Wall Hook Small Wire 6-Pack | 3M | N/A | |
| Micro Water/Air Pump | Xiamen Conjoin Electronics | CJWP40-A12A1 | |
| 1/4" Silicon Tubing | NewAge | 2801470-100 | |
| T Connector | Bel-Art Scienceware | F196060000 | |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | Becton, Dickinson and Company | 367841 | |
| Cotinine ELISA kit | Calbiotech | CO096D |
References
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