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Biologia

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55698
,
1Department of Physiology and Biomedical Engineering,Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Transport ionique cellulaire peut souvent être évaluée en contrôlant le pH intracellulaire (pHj’ai). Génétiquement Encoded pH-indicateurs (GEpHIs) fournissent une quantification optique du pH intracellulaire dans les cellules intactes. Ce protocole détaille la quantification du pH intracellulaire par cellulaires ex vivo live-imagerie de Malpighi de Drosophila melanogaster avec pHerry, une pseudo-ratiométrique codé génétiquement-indicateur de pH.

Abstract

Transport épithélial ionique est vitale pour l’homéostasie ionique systémique ainsi que la maintenance des gradients électrochimiques cellulaires essentiels. PH intracellulaire (pHi) est influencée par de nombreux transporteurs ioniques et donc suivi pHj’ai est un outil utile pour évaluer l’activité de transporteur. PH de codé génétiquement moderne-indicateurs (GEpHIs) fournit des optique quantification de pHj’ai dans les cellules intactes à l’échelle cellulaire et subcellulaire. Ce protocole décrit la quantification en temps réel des cellulairesj’ai régulation du pH dans les tubes de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster par ex vivo live-image de pHerry, un GEpHI pseudo-ratiométrique avec un pKun bien adapté pour suivre les changements de pH dans le cytosol. Mouche adulte extraite MTs sont composés de sections morphologiquement et fonctionnellement distinctes de l’épithélium de la couche de cellules individuelles et peuvent servir comme un modèle d’étude du transport épithélial accessible et génétiquement tractable. GEpHIs offre plusieurs avantages par rapport aux colorants fluorescents conventionnels sensibles au pH et électrodes sélectives. GEpHIs pouvez étiqueter les populations cellulaires distincts autant éléments promoteurs appropriées sont disponibles. Cet étiquetage est particulièrement utile dans les ex vivo, in vivoet in situ préparations, qui sont par nature hétérogènes. GEpHIs permettent aussi de quantification de pHi dans les tissus intactes au fil du temps sans avoir besoin d’externalisation de traitement ou d’un tissu colorant répétées. Le principal inconvénient du GEpHIs actuel est la tendance à agréger dans les inclusions cytosoliques en réponse aux dommages de tissu et de construire la surexpression. Ces lacunes, leurs solutions et les avantages inhérents au GEpHIs sont illustrés dans ce protocole à travers l’évaluation de basolatérale transport de protons (H+) dans les cellules principales et stellaires fonctionnellement distinctes de mouche extraite MTs. Les techniques et les analyses décrites sont facilement adaptables à une grande variété de préparations de vertébrés et d’invertébrés, et la sophistication du dosage peut passer de laboratoires aux complexe détermination du flux ionique par l’intermédiaire de transporteurs spécifiques d’enseignement.

Introduction

Ce protocole vise à décrire la quantification du pH intracellulaire (pHi) à l’aide d’un indicateur pH codé génétiquement (GEpHI) et démontrer comment cette méthode peut être utilisée pour évaluer le transport H+ basolatérale chez un insecte modèle (D. melanogaster) structure rénale, les tubules Malpighian (MT). MTs servent les organes excréteurs de la mouche à fruit et sont fonctionnellement similaires aux mammifères néphron à plusieurs égards essentiels1. MTs sont disposées sous forme de 2 paires de tubules (antérieures et postérieures) dans le thorax et l’abdomen de la mouche. Le tube épithélial unicellulaire de chaque marqueur est composé de cellules métaboliquement actives principales avec distinct apicales (luminal) et polarité basolatérale (hémocoele) ainsi que des cellules étoilées intercalées. MTs antérieures sont composés de 3, morphologiquement, fonctionnellement, et débats développemental distincts, notamment la première dilatés segment segment transitoire et sécrétoire segment principal, qui relie à l’ uretère2. À l’échelle cellulaire transport trans épithélial ionique dans la lumière s’effectue par une V-ATPase de la membrane plasmique apicale3 et un échangeur d’alcali-métal/H+ comme un basolatérale++de Na -K-ATPase4, vers l’intérieur-redresseur K+ canaux5, Na+-driven Cl−/HCO3− échangeur (NDAE1)6et++de Na -K-2 Cl− cotransporteur (NKCC ; Ncc69)7, tandis que les cellules étoilées médient Cl– et8,9de transport de l’eau. Ce système physiologique complex mais accessible offre d’excellentes possibilités pour l’étude des mécanismes de transport des ions endogènes lorsqu’il est combiné avec les divers ensembles d’outils génétiques et comportementaux de la drosophile.

La justification de ce protocole était de décrire un système génétiquement malléable pour étudier le transport épithélial ionique avec un potentiel pour l’intégration de la cellule au comportement et à l’exportation d’outils à d’autres systèmes de modèle. Expression de pHerry10, un GEpHI dérivé d’une fusion de vert écliptique super sensibles au pH pHluorin11,12 (EERH) et rouge mCherry insensible à pH13, dans MTs permet quantification des transports H+ cellules MT uniques à travers la haute K+/nigericin calibration technique14. Alors que de nombreux transporteurs ioniques équivalents H+ , quantification du pH intracellulaireje sert une représentation fonctionnelle du mouvement ionique via une variété de transporteurs. Le système de modèle drosophile MT aussi offre de puissants outils génétiques en tissu-spécifique transgène15 et RNA interférence (ARNi)16 expression qui peut être combinée avec l’imagerie cellulaire et dosages de l’ensemble-orgue17 , 18 , 19 de fonction tubule pour créer un ensemble d’outils robuste grâce à l’intégration verticale des molécules au comportement. Cela contraste avec les nombreux autres protocoles pour évaluer biologie épithéliale, comme historiquement ces mesures sont sont appuyés sur complexe et intimidant des électrodes sélectives micro-dissection et sophistiqué20,21, et sensibles au pH cher colorants22 avec exigences restrictives chargement et mauvaise spécificité cellulaire en tissus hétérogènes. GEpHIs ont été utilisés intensivement mesurer pHj’ai dans une variété de types de cellule23. Les premiers travaux exploités la pH-sensibilité inhérente de Green Fluorescent Protein (GFP) pour surveiller pHj’ai dans les cellules épithéliales en culture24 , mais les deux dernières décennies ont vu GEpHIs utilisé dans les neurones25, glia26, champignons27 , et28des cellules végétales. La combinaison de la possibilité d’un ciblage cellulaire des constructions génétiques par le biais de l’expression des GAL4/UAS système15 et l’accessibilité physiologique de la drosophile MT cela fait une préparation idéale pour les enquêtes de pHj’ai règlement et transport épithélial ionique.

régulation du pHj’ai a été étudiée pendant des décennies et est essentielle à la vie. La préparation de MT vous propose un modèle robuste pour enseigner la physiologie de la régulation du pHj’ai mais aussi effectuer un sophistiqué enquêtes de pHi règlement ex vivo et in vivo. Ce protocole décrit la quantification du mouvement H+ à travers la membrane basolatérale des cellules épithéliales de la drosophile MT à l’aide de la NH4Cl l’acide impulsion technique21de chargement, mais comme l’indicateur de pH est génétiquement codé, ces méthodes et leur cadre théorique peuvent être appliqués toute préparation se prêtent à la transgénèse et création d’images en direct.

Protocol

Toutes les étapes dans ce protocole conforme aux lignes directrices Mayo Clinic (Rochester, MN) l’utilisation des animaux. 1. voler élevage Augmenter les mouches et ensemble traverse selon élevage standard29.Remarque : L’expression du Rapporteur Fluorescent par le système de GAL4/UAS est proportionnelle à la température et donc élever la température peut être ajustée pour modifier le niveau d’expression. Tandis que les niveaux d’expressi…

Representative Results

Tissus sains et une pièce d’identité de MTs antérieurs sont essentiels à la réussite du présent protocole. Au cours de la dissection, il faut pas directement toucher le système commercial multilatéral et à poignée unique par l’uretère en saisissant le système commercial multilatéral directement conduiront à la rupture (Figure 4 a– B). Lorsque MTs sont balayés à plat sur le toboggan, les tubules doivent …

Discussion

Le succès de dosage de pHj’ai di Drosophila MTs dépend entièrement de la santé des extraits MTs et la qualité de montage et de dissection (Figure A – C). Ainsi, la manipulation soigneuse de tissu comme décrit est impérative. Diapositives fraîchement enduits dans PLL substantiellement aide MT montage car ils ont tendance à être beaucoup plus adhésif que glisse qui ont déjà été exposés à la solution. Un montage soigneux aideront ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les NIH DK092408 et DK100227 à MFR. AJR a été pris en charge par T32-DK007013. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Julian A.T. Dow pour le PACCR-GAL4 et c724-GAL4 stocks de drosophile . Nous remercions également Jacob B. Anderson pour assistance, maintien des croisements expérimentaux de mouche.

Materials

Poly-L-Lysine Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.
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Riferimenti

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Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).
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