PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Summary

תחבורה יון הסלולר לעתים קרובות יכול להיות מוערך על ידי ניטור pH תאיים (pH_אני). גנטית Encoded pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק אופטי כימות תאיים pH בתאים ללא פגע. פרוטוקול זה פרטים כימות של החומציות תאיים באמצעות הסלולר שמחוץ לחיות-הדמיה של בקוריאנית Malpighian של דרוזופילה melanogaster עם pHerry, פסאודו-רציומטרי גנטית מקודד ה-pH-מחוון.

Abstract

יון אפיתל תחבורה חיוני יון מערכתית הומאוסטזיס, כמו גם התחזוקה של מעברי צבע אלקטרוכימי הסלולר חיוני. החומציות תאיים (pH_אני) מושפע על ידי מובילי יון רבים, ובכך ניטור pH_אני כלי שימושי עבור הערכת פעילות המשלח. מודרני גנטית מקודד ה-pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק כימות אופטי של pH_אני בתאים שלמים בסולם סלולרית ו- subcellular. פרוטוקול זה מתאר כימות בזמן אמת של pH הסלולר_אני תקנה ב Malpighian בקוריאנית (MTs) של דרוזופילה melanogaster דרך שמחוץ לחיות הדמיה של pHerry, GEpHI פסאודו-רציומטרי עם pK מתאים היטב כדי לעקוב אחר שינויים pH ציטוזול. לעוף למבוגרים שחולצו MTs מורכבים חלקים נפרדים מורפולוגית והן מבחינה תפקודית של שכבה חד-תא epithelia, ו יכול לשמש מודל נגיש, צייתן גנטית לחקירה התחבורה אפיתל. GEpHIs מציעים כמה יתרונות על פני צבעי פלורסנט קונבנציונלי רגיש pH ואלקטרודות יון סלקטיבי. GEpHIs יכול תווית אוכלוסיות תאים נפרדים בתנאי מקדם המתאים רכיבים זמינים. תיוג זה שימושי במיוחד ב- ex-vivo ויוו, בחיי עיר ההכנות, אשר מטבעו הטרוגנית. GEpHIs גם היתר כימות של pH_i ברקמות תקין לאורך זמן ללא צורך לצבוע חוזרות טיפול או רקמות הוצאתו. החיסרון העיקרי של GEpHIs הנוכחי הוא נטייה לצבור ב תכלילים cytosolic בתגובה נזק לרקמות ולבנות ביטוי יתר. חסרונות אלה הפתרונות שלהם, את היתרונות של GEpHIs הם הפגינו את פרוטוקול זה דרך הערכת התחבורה פרוטון (H.⁺) basolateral בתאי stellate ועקרוני נפרדים פונקציונלית של זבוב שחולצו MTs. טכניקות וניתוח תיאר בקלות להתאמה למגוון רחב של חוליות, הגעה ההכנות, ניתן לשנות את התחכום של וזמינותו של מעבדות להגדרה הסבוך של יון השטף דרך שנאים ספציפי.

Introduction

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את כימות של החומציות תאיים (pH_i) שימוש בקידוד גנטית pH-מחוון (GEpHI), להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך basolateral H⁺ תחבורה חרק מודל (נפטר ב– melanogaster) מבנה הכליות, צנורית Malpighian (MT). MTs לשמש הריקון של זבוב הפירות, דומים מבחינה תפקודית נפרון בתרבית של כבוד מפתח מספר¹. MTs מסודרים 2 זוגות של בקוריאנית (anterior ואת אחורי) בית החזה, הבטן של הזבוב. הצינור אפיתל בתא יחיד של כל הר מורכב סמויה הפעיל העיקרי תאים עם ברורים הפסגה (luminal), basolateral (hemocoel) קוטביות, כמו גם תאי stellate intercalated. MTs הקדמי מורכבות 3 מורפולוגית, פונקציונלי, ומורחבים מקטעים נפרדים נכה, ובייחוד הראשונית קטע, קטע המעבר ואת הפרשה קטע הראשי, אשר מצטרף שופכן² את המשקל הסלולר תחבורה טרנס-אפיתל יון לתוך לומן מושגת על ידי של קרום פלזמה הפסגה V-ATPase³ ו מחליף אלקלי-מתכת/H⁺ , כמו גם של basolateral Na⁺-K⁺-ATPase⁴, K פנימה-יישור⁺ ערוצי⁵, Na⁺-מונע Cl⁻/HCO₃⁻ מחליף (NDAE1)⁶ו- Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, ואילו תאי stellate לתווך Cl^– ולהעביר מים^8,9. מערכת הפיזיולוגיות זו מורכבת אך נגיש מספקת הזדמנויות מצוינות עבור חקירת מנגנוני הובלה יון אנדוגני בשילוב עם toolsets גנטיות והתנהגותיות מגוונות של דרוזופילה.

הרציונל עבור פרוטוקול זה היה לתאר מערכת גנטית חמרן ללמוד יון אפיתל תחבורה עם פוטנציאל לשילוב מתא כדי התנהגות וייצוא של כלים למערכות אחרות מודל. הביטוי של pHerry¹⁰GEpHI נגזר מן שילוב של ירוק מישור המילקה סופר רגיש pH pHluorin^11,12 (ע) ו אדום mCherry pH-רגישות¹³, ב- MTs מאפשרת כימות של תחבורה H⁺ תאים בודדים MT דרך גבוהה K⁺/nigericin כיול טכניקה¹⁴. מובילי יון רבים עובר H⁺ מקבילות, כימות של החומציות תאיים_אני משמש ייצוג פונקציונלי של יון תנועה באמצעות מגוון רחב של שנאים. מערכת מודל דרוזופילה MT מציע גם כלים רבי-עוצמה גנטי רקמות ספציפיות transgene¹⁵ ו RNA הפרעה (RNAi)¹⁶ הביטוי, אשר יכול להיות משולב עם הדמיה הסלולר ואת מבחני כולו אורגן^{17 , 18 , 19} של פונקציה צנורית כדי ליצור ערכת כלים חזקים עם אינטגרציה אנכית ממולקולות להתנהגות. זה סתירותיה מציבה ניגוד לחיים פרוטוקולים רבים אחרים עבור הערכת ביולוגיה אפיתל, כמו מדידות היסטורית כאלה צריכים לסמוך על מורכבות, מרתיעה אלקטרודות יון סלקטיבי ניתוח מיקרו, מתוחכם^20,21, רגיש pH יקר צבענים²² עם דרישות הטעינה מגבילות וספציפיות הסלולר המסכן ברקמות הטרוגנית. GEpHIs היו בשימוש נרחב למדידת pH_אני במגוון סוגי תאים²³. בתחילת העבודה מנוצלת הגלום pH-הרגישות של ירוק ניאון חלבון (GFP) כדי לפקח על pH_אני בתרבית תאים אפיתל²⁴ , אבל בשני העשורים לראות GEpHIs משמש נוירונים²⁵, עכשיו, דונלד²⁶, פטריות²⁷ , צמח תאי²⁸. השילוב של הפוטנציאל של פילוח הסלולר של מבנים גנטיים באמצעות המערכת את הביטוי GAL4/UAS¹⁵ הנגישות הפיזיולוגיות של דרוזופילה MT שזה הכנה אידיאלית של חקירות של pH_אני תקנה ותעבורה יון אפיתל.

pH_אני תקנה נחקר במשך עשרות שנים, והוא חיוני לחיים. הכנת MT מציע מודל חזקים כדי ללמד את הפיזיולוגיה של pH_אני רגולציה, אבל גם לבצע מתוחכם חקירות של pH_i לתקנה ex-vivo ו vivo בתוך. פרוטוקול זה מתאר כימות של H⁺ תנועה על פני קרום basolateral של תאי אפיתל של דרוזופילה MT באמצעות ה NH₄Cl הדופק חומצה טעינה טכניקה²¹, אבל כמו מחוון ה-pH היא גנטית מקודד, שיטות אלה ומסגרת תיאורטית שלהם ניתן ליישם כל הכנה נוטה transgenesis, הדמיה לחיות.

Protocol

כל השלבים פרוטוקול זה לעמוד בהנחיות שימוש בבעלי חיים מאיו קליניק (רוצ’סטר, MN). 1. גידול לעוף העלאה זבובים, ערכת צלבים על פי בעלי תקן29.הערה: הביטוי פלורסנט כתב על ידי מערכת GAL4/UAS פרופורציונליים לטמפרטורה, ובכך לגידול טמפרטורה יכול להיות מותאם כדי לשנות את רמ?…

Representative Results

רקמות בריאים וזיהוי נאותה של MTs הקדמי הכרחיים להצלחה של פרוטוקול זה. במהלך ניתוח, כדאי לשים לב למגע לא ישיר של MTs, לטפל רק אותם על ידי השופכן כמו מרתק של MTs ישירות יוביל שבירה (איור 4A– B). כאשר MTs נסחפים השטוח אותן לשקופית, בקוריאנית חייב להי?…

Discussion

ההצלחה של כימות של pH_אני ב- MTs דרוזופילה תלויה לגמרי הבריאות של MTs שחולצו ואיכות הרכבה, דיסקציה (איור A – C). לכן, טיפול זהיר של רקמות כמו שמתואר הכרחי. שקופיות טרי מצופה PLL באופן משמעותי סיוע MT הרכבה כפי שהם נוטים להיות דבק הרבה יותר מאשר שקופיות אשר נחשפו…

Materials

Poly-L-Lysine Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.