Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

Il rapporto ^{1 del} Consiglio Nazionale di Ricerca USA ha previsto un nuovo paradigma di test sulla tossicità in cui i test di regolamentazione della tossicità sarebbero stati spostati da un approccio che si basa sui cambiamenti fenotipici osservati negli animali ad un approccio focalizzato sui test meccanici in vitro utilizzando le cellule umane. I derivati ​​pluripotenti di cellule staminali (PSC) possono rappresentare alternative ai modelli delle cellule tumorali, in quanto le cellule ottenute possono similmente assomigliare alle condizioni fisiologiche dei tessuti umani e fornire strumenti più rilevanti per studiare effetti collaterali indotti da sostanze chimiche. I due principali tipi di colture PSC che sono più promettenti per la sperimentazione della tossicità sono le cellule staminali embrionali umane (hESCs) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs), attualmente ampiamente utilizzate nei settori della ricerca di base e della medicina rigenerativa ^{2 , 3} . Questa competenza può ora essere sfruttata per lo sviluppo di una nuova classe di toxicoloGical in vitro per identificare i percorsi fisiologici perturbed coinvolti nello sviluppo di effetti negativi in vivo . Tuttavia, i metodi di prova per le valutazioni di sicurezza regolamentare basati su hESC non sarebbero probabilmente accettati da tutti gli Stati membri dell'UE e da paesi in tutto il mondo a causa di eventuali preoccupazioni etiche e di diverse politiche legislative nazionali che regolano l'uso di cellule embrioni.

HiPSCs condividono caratteristiche simili a quelle dei hESCs ^{4 , 5} e hanno un grande potenziale per metodi in vitro , sia per identificare obiettivi terapeutici, sia per valutazioni di sicurezza. Inoltre, la tecnologia hiPSC mitiga i vincoli di un pool limitato di donatori e le preoccupazioni etiche associate a cellule embrione. Una grande sfida per i hiPSC è la dimostrazione che queste cellule possono generare riproducibilmente una gamma significativa di derivati ​​cellulari tossicologicamente rilevanti,Con caratteristiche e risposte tipiche dei tessuti umani. Livelli predefiniti dei marcatori selezionati vengono generalmente utilizzati per caratterizzare le popolazioni cellulari dopo il processo di differenziazione e per fornire approfondimenti sulla stabilità del processo di differenziazione.

I precedenti lavori hanno valutato l'idoneità dei hiPSC per generare colture miste di cellule neuronali e gliali e per valutare gli effetti di rotenone, inibitore del complesso respiratorio mitocondriale I, sull'attivazione del percorso Nrf2, un regolatore chiave dei meccanismi di difesa antiossidanti in Molti tipi di cellule ^{6 , 7} .

Questo lavoro descrive un protocollo utilizzato per la differenziazione di hiPSCs in colture neuronali e gliali miste, fornendo dettagli sui percorsi di segnalazione (livello di gene e proteine) che vengono attivati ​​sulla differenziazione neuronale / gliale. Inoltre, il lavoro mostra i risultati rappresentativi dimostrando come questoIl modello hi-CSC derivato da neuroni e gliali può essere utilizzato per valutare l'attivazione di segnalazione Nrf2 indotta da un trattamento acuto (24h) con rotenone, consentendo la valutazione dell'induzione dello stress ossidativo.

I fibroblasti IMR90 sono stati riprogrammati in hiPSC a I-Stem (Francia) mediante la trasduzione virale di 2 fattori di trascrizione (Oct4 e Sox2) usando i vettori pMIG ⁶ . Possono essere applicati modelli analoghi hiPSC. I protocolli descritti qui di seguito riassumono tutte le fasi della differenziazione dei hiPSC in cellule staminali neurali (NSCs) e successivamente in colture miste di neuroni post-mitotici e cellule gliali (passaggi 1 e 2), vedere anche il sito web EURL ECVAM DBALM per una descrizione dettagliata Il protocollo) ⁸ .

Un protocollo aggiuntivo per l'isolamento, l'espansione, la crioconservazione e l'ulteriore differenziazione dei NSCs in neuroni misti e cellule gliali sono dettagliate nei passaggi 3 e 4 (si fa anche riferimento al EURL ECVAM DBALMBsite per una descrizione dettagliata di questo protocollo) ⁹ . Il passo 5 descrive le analisi che possono essere effettuate per valutare l'identità fenotipica delle cellule durante le diverse fasi di impegno e differenziazione.

1. Espansione della cellula staminale pluripotente indotta a livello umano (hiPSC)

NOTA: i hiPSCs possono essere coltivati ​​su un substrato di miscela proteina appropriata in presenza di mTeSR1 contenente mTeSR1 supplementi 5x (preparati seguendo le istruzioni del produttore; piastra ~ 100 frammenti di colonia / piatto di Petri da 60 mm). Quando le colonie hiPSC raggiungono una dimensione appropriata (vedi un esempio di una colonia nella Figura 2A ), passare le cellule come descritto di seguito (una volta alla settimana).

1. Piatti a cappotto con matrice a membrana basale qualificata hESC (qui di seguito denominata "matrice qualificata") o qualsiasi altro substrato proteico adatto.
   1. Conservare la matrice qualificata (vedere tabella dei materiali ) a -80 ° C in aliquote da 200 μl in tubi freddi da 1,5 ml e pipette a freddo da 5 o 10 ml.
   2. Prima di passare, sciogliere 200 μL di matrice qualificata sul ghiaccio.
   3. Diluire 200 μL di matrice qualificata in 20 mL del mezzo DMEM / F12 (diluizione 1: 100).
   4. Cappare piatti di Petri da 60 mm con questa soluzione (5 mL / piatto).
   5. Incubare i piatti ricoperti a 37 ° C per almeno 1 h.
2. Crioconservazione e scongelamento di frammento di colonie HiPSC
   1. Dopo aver tagliato le colonie hiPSC (vedere la fase 1.3 per la procedura di taglio della colonia hiPSC), riposizionare delicatamente e lentamente i frammenti della colonia hiPSC nel mezzo di congelamento delle cellule staminali, ~ 100 frammenti / 250 μL (vedi tabella dei materiali).
   2. Aliquota i frammenti della colonia in flaconi idonei per crioconservazione (250 μL / flaconcino).
   3. Posizionare le fiale in un contenitore riempito di 2-propanolo e collocare il contenitore a -80 ° C per un minimo di 2 ore fino a 2 settimane.
   4. Trasferire i flaconi nella fase di vapore di un serbatoio di azoto liquido.
   5. Per riavviare la coltura, scongelare 1 flacone congelato in bagno d'acqua a 37 ° C.
   6. Collezionare delicatamente i frammenti della colonia hiPSC in 7 ml di hiPSC completo pre-riscaldatoMedio (vedere tabella dei materiali ) in un tubo da 15 ml utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
   7. Centrifugare i frammenti della colonia hiPSC a 130 xg per 3 min.
   8. Rimuovere il surnatante e riposare delicatamente i frammenti della colonia hiPSC in 1 ml di mezzo hiPSC completo utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
   9. Diluire ulteriormente la sospensione cellulare in 3 o 4 ml di mezzo hiPSC completo.
   10. Piattare i frammenti della colonia hiPSC in un piatto di Petri da 60 mm con rivestimento a matrice (~ 100 frammenti / piatto, ricoprire i piatti come descritto al passaggio 1.1).
   11. Incubare i hiPSC a 37 ° C e 5% CO ₂ .
   12. Esegui un cambiamento medio totale ogni giorno.
3. Passaggio delle colonie hiPSC
   NOTA: i hiPSC indifferenziati devono essere rotondi, con grandi nucleoli e senza citoplasma abbondante. Le colonie indifferenziate dovrebbero essere caratterizzate da una morfologia piatta e strettamente confezionata. Solo colonie indifferenziate (circa 1 mm iN) deve essere tagliato per ulteriori passaggi.
   1. Tagliare le colonie di cellule staminali in piazze di circa 200 μm x 200 μm usando una siringa da 1 ml con un ago da 30G o qualsiasi altro strumento commercialmente disponibile (vedi tabella dei materiali). Usare un microscopio stereoscopico a 4x ingrandimento in un cabinet a flusso laminare a temperatura ambiente.
   2. Staccare i frammenti della colonia dalla superficie del piatto utilizzando una pipetta da 200 μl pipettando delicatamente il mezzo sottostante per sollevare i pezzi.
   3. Trasferire i frammenti della colonia (~ 100 pezzi) in una matrice qualificata - Piastra rivestita con DMEM / F12 riempita di 4 mL di mezzo hiPSC completo (vedere la tabella dei materiali, ricoprire i piatti come descritto nel passaggio 1.1).
   4. Incubare la nuova piastra a 37 ° C e 5% CO ₂ .
   5. Eseguire un cambiamento medio totale ogni giorno e ispezionare la morfologia delle colonie utilizzando un microscopio a contrasto di fase a ingrandimenti 4X e 10X.

2. HiPSC DiffereNazione in Neuroni Mixed e Glia

NOTA: la procedura richiede circa 28 giorni per completare, con i passaggi principali descritti in figura 1 (parte superiore).

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo di differenziazione neuronale. (Parte superiore) Le colonie IMR90-hiPSC possono essere tagliate in frammenti per formare corpi embriodici (EB). Dopo 2 giorni in vitro (DIV), EB può essere placcato su piastrine lamina o standard matrici rivestite e coltivate in presenza di un mezzo di induzione neuroepiteliale (NRI) per generare derivati ​​neuroectodermici (rosette, qui colorate per nestin (verde) e β -III-tubulina (rosso)). Le rosette possono essere dissociate, raccolte, ricostruite su piatti lamininici o con matrici standard e poi differenziate in neuroni maturi (NF200, rosso) e gliali(GFAP, verde) in presenza di un mezzo di differenziazione neuronale (ND). (NIN) possono essere espansi in presenza di un mezzo di induzione neurale (NI), criopreservati, o ulteriormente differenziati in presenza di mezzo ND per formare neuroni misti (NF200, verde) e gliali ( GFAP, rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Generazione di corpi embrioni (EBs) (giorni 0 → 1)
   NOTA: Questa procedura richiede buone abilità manuali e precisione. I frammenti della colonia HiPSC dovrebbero essere di uguale dimensione per ottenere corpi embrioni omogenei (EB) nei prossimi passi. Le colonie morfologicamente differenziate (con grandi frazioni citoplasmatiche e piccoli nucleoli) devono essere scartati.
   1. Aggiorna il mezzo hiPSC (piatto di Petri da 3 ml / 60 mm) prima di tagliare le colonie hiPSC indifferenziate (circa 1 mm in diamEtere, vedere la Figura 2A ) in condizioni sterili (come descritto nel passaggio 1).
   2. Tagliare le colonie indifferenziate (come mostrato in Figura 2A e Figura 2B ) in frammenti di circa 200 μm x 200 μm utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 30 G. Usare un microscopio stereoscopico a 4x ingrandimento in un armadio a flusso laminare a temperatura ambiente.
   3. Staccare i frammenti della colonia dalla superficie del piatto utilizzando una pipetta da 200 μl mescolando delicatamente il mezzo sottostante per sollevare i pezzi.
   4. Trasferire tutti i frammenti distaccati e il mezzo a un tubo da 15 ml utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
   5. Sciacquare il piatto con 2 ml di mezzo hiPSC completo per recuperare tutti i frammenti.
   6. Centrifugare a 112 xg per 1 min.
   7. Aspirare il surnatante e riposizionare delicatamente i frammenti in 5 ml di mezzo completo hiPSC EB (vedi tabella dei materiali ).
   8. Piastra il coFrammenti di lony in un piatto di Petri di attacco ultra-basso da 60 mm (piatto di Petri da 5 millimetri / 60 millimetri).
   9. Incubare il piatto di Petri durante la notte a 37 ° C e 5% di CO ₂ .
   10. Il giorno successivo (giorno 1), raccogliere l'EB e il loro mezzo in un tubo da 15 ml utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
   11. Centrifugare gli EB a 112 xg per 1 min.
   12. Aspirare con cautela il surnatante e riposizionare delicatamente i EB in 5 ml di mezzo completo di hiPSC EB usando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
   13. Sostituire la EB su un nuovo piatto di Petri da 5,5 mm (piatto da 5 ml / 60 mm Petri) ad un attacco ultra-basso da 60 mm.
   14. Incubare il piatto di Petri durante la notte a 37 ° C e 5% di CO ₂ .
2. Il giorno 1, rivestire i piatti con matrice a membrana basale ( ad esempio, matrigel, di seguito definita come "matrice standard") o qualsiasi altro substrato proteico adatto ( ad esempio , laminina).
   1. Conservare la matrice standard (vedi tabella dei materiali ) a -80 ° C in200 μl di aliquote usando tubi freddi da 1,5 ml e pipette fredde da 5 o 10 ml.
   2. Sciogliere 200 μL di matrice standard sul ghiaccio.
   3. Diluire 200 μL di matrice standard in 20 ml di mezzo DMEM / F12 (diluizione 1: 100).
   4. Cappare piatti di Petri da 60 mm con questa soluzione (5 mL / piatto).
   5. Incubare i piatti ricoperti a 37 ° C per una notte.
      NOTA: Questi piatti saranno utilizzati per piastrare le EB (circa 50 EB / piatto) e generare aggregati neuroepiteliali (rosette); Vedere il passo 2.3.
3. Generazione di aggregati neuroepiteliali (rosette) (giorni 2 → 7)
   1. Il giorno 2, rimuovere la soluzione di rivestimento a matrice standard dai piatti di Petri da 60 mm (non necessita di risciacquare le piastre) e riempirli con 5 mL / piatto di mezzo di induzione neuroepiteliale completo (NRI); Vedere la tabella dei materiali .
   2. Trasferire gli EB fluttuanti (dal punto 2.1.14) a piatti rivestiti (~ 50 EB / piatto) usando una pipetta da 200 μL sotto un mi stereoscopicoCroscopio a ingrandimento 4x e collocato in un armadio a flusso laminare.
      NOTA: E 'fondamentale selezionare EB omogenei di medie dimensioni (~ 200-300 μm di diametro). I EB troppo piccoli possono non sopravvivere bene durante la differenziazione neuroectodermica, mentre i EB troppo grandi tendono a subire la necrosi nucleare.
   3. Incubare i piatti a 37 ° C e 5% CO ₂ .
   4. Il giorno dopo (giorno 3), controllare i piatti sotto il microscopio a 10x ingrandimento per assicurare che tutti gli EBs siano tutti collegati.
   5. Effettuare delicatamente un cambiamento medio totale con il mezzo NRI completo.
   6. Cambiare il medium NRI ogni altro giorno fino al giorno 7, quando gli aggregati neuroepiteliali (rosette) dovrebbero essere visibili.
   7. Il 7 ° giorno, la matrice standard (o laminina) del cappotto, come descritto al punto 2.2, su qualsiasi piastra o piatto richiesta: piastre a 96 pozzetti (100 μL / pozzetto), piastre a 24 pozzetti (250 μL / pozzetto), 12- (500 μl / pozzetto), chip MEA (per attività elettrica, 1 mL / chip singolo) o 60 mm Petri disheS (4 mL / piatto).
   8. Incubare le piastre / piatti rivestiti per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% CO ₂ .
4. Distillazione di Rosette e differenziazione neuronale (giorni 8 → 28)
   NOTA: Questa procedura richiede buone abilità manuali e precisione. Per evitare la raccolta di cellule mesodermiche e endodermiche, devono essere dissociate e raccolte solo strutture ectoderm rosette.
   1. Il giorno 8, tagliare le strutture rosette come frammenti sotto un microscopio stereoscopico a 10x ingrandimento in condizioni sterili. Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago da 30G. Si noti che i rosoni tendono a staccarsi facilmente dal piatto quando si toccano con l'ago.
   2. Completare il distacco dei frammenti di rosetta utilizzando una pipetta da 200 μl.
   3. Trasferire il piatto sotto il cappuccio flusso laminare e raccogliere i frammenti di rosetta e il loro mezzo in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml. Sciacquare il piatto con 2 ml di mezzo NRI per recuperareTutti i frammenti.
   4. Spin giù i frammenti della rosetta a 112 xg per 2 minuti.
   5. Aspirare il surnatante.
   6. Riposare delicatamente il pellet in 1 mL di 1x DPBS (senza calcio e magnesio) e pipettare delicatamente i frammenti di rosetta su e giù usando una pipetta da 1000 μl per dissociarli parzialmente.
   7. Aggiungere 4 ml di mezzo completo NRI e contare le cellule utilizzando il blu trypanico e un contatore delle cellule automatiche (vedere la tabella dei materiali )
      NOTA: Diluire 20 μL di sospensione cellulare in 20 μl di Trypan blu. Questo passaggio può essere omesso se le cellule non possono essere portate in una sospensione a singola cellula. Se i frammenti di rosetta non sembrano completamente dissociati, i frammenti di rosette derivanti da circa 50 piastre EB / 60 mm possono essere risospesi in 50 ml di mezzo NRI completo e placcati, come indicato nella tabella 1 .
   8. Aspirare la soluzione di rivestimento a matrice standard (o laminina) dai piatti, piatti e / o MEA di Petri (dal punto 2.3.7). Non lasciarli asciugare.
   9. Piattare le cellule nel mezzo NRI completo secondo il piano di studio (circa 15.000 cellule / cm ² ; vedere la Tabella 1 per indicare i volumi di placcatura).
   10. Incubare le piastre per una notte a 37 ° C e 5% CO ₂ .
   11. Il giorno 10, eseguire un cambiamento medio totale usando un mezzo di differenziazione neuronale completa (ND); Vedere la tabella dei materiali.
   12. Aggiornare il mezzo completo ND due volte alla settimana fino al 28 ° giorno.
   13. Caratterizzare i derivati ​​dei neuroni / gliali, come descritto nel passaggio 5 (vedere la tabella 2 per i criteri generali di accettazione).

3. Espansione e differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC) derivate da HiPSC nei Neuroni Mixed e Glia

NOTA: I NSC derivati ​​da frammenti di rosetta possono essere ampliati e mantenuti seguendo la procedura descritta di seguito ( figura 1 , parte inferiore). Ciò consente di incrementare il thNumero di cellule per la differenziazione e la sperimentazione chimica.

1. Incorporare un piatto di Petri da 60 mm (o una tampone T-25) con 5 ml di soluzione di rivestimento standard di matrice DMEM / F12 e incubare per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% CO ₂ (come descritto nel punto 2.2).
2. Spin giù i frammenti di rosetta derivanti dalle fasi 1-2 (vedi punto 2.4) in un tubo conico da 15 mL a 112 xg per 2 min.
3. Riposare delicatamente il pellet in 5 ml di mezzo di induzione neurale (NI); Vedere la tabella dei materiali.
4. Trasferire le celle su un piatto di Petri da 60 mm (o con tampone T-25) verniciato a matrice standard.
5. Coltivare NSC di derivazione rosoletta in presenza di NI medium, rinfrescando il mezzo ogni altro giorno fino a quando le cellule non raggiungono la confluenza.
6. Quando confluenti, passare i NSC come descritto nei passaggi successivi.
   NOTA: Passare i NSC circa una volta alla settimana; Si consiglia di utilizzare piatti, fiaschi o piatti freschi rivestiti, a seconda del piano di studio.
7. Rimuovere il mezzo completo NI e gentileSciacquare i NSC con DPBS (senza calcio e magnesio).
8. Aggiungere 1,5 mL di 0,05% di trysina-EDTA pre-riscaldati a 37 ° C al piatto di Petri da 60 mm (o nella tampone T-25) contenente le cellule e collocarlo nell'incubatore per 1 minuto.
9. Toccare delicatamente il piatto (o il pallone) per staccare le celle.
10. Aggiungere 1,5 ml di inibitore della tripsina pre-riscaldato a 37 ° C e trasferire le cellule in un tubo da 15 ml.
11. Sciacquare il piatto Petri (o la tampone T-25) con un volume uguale di mezzo NI (1,5 mL) e raccogliere il volume nello stesso tubo da 15 mL.
12. Centrifugare le cellule a 130 xg per 3 min.
13. Rimuovere il surnatante e riposizionare delicatamente le cellule in 1 ml di mezzo NI completo utilizzando una pipetta da 1000 μl.
14. Diluire ulteriormente la sospensione cellulare in 3 o 4 ml di mezzo completo NI e contare le cellule usando tripan blu e un contatore di cellule automatiche.
15. Piattare i NSC sul piatto di Petri da 60 mm (o la tampone T-25) dalla fase 3.1 ad una densità di circa 50.000 cellule / cm ² .
17. Caratterizzare le cellule per la presenza di derivati ​​neuronali / gliali cellule, come descritto nel passaggio 5.
    NOTA: i NSCs possono essere differenziati in colture miste di neuroni e glia nel mezzo ND completato (come descritto nei passaggi 2.4.11-2.4.13), rinfrescando il mezzo completo ND due volte alla settimana per 21 giorni.

4. Cryopreservation e scongelamento NSC derivato da HiPSC

NOTA: Al passaggio, i NSC possono essere congelati e ri-scongelati seguendo questa procedura.

1. Centrifugare NSC passati (dal punto 3.12) a 130 xg per 3 min.
   NOTA: Le celle devono essere contate al punto 3.14.
2. Resistere delicatamente e lentamente le NSC a 3 x 10 ⁶ / mL di mezzo di congelamento (vedi tabella dei materiali ).
3. Aliquota le cellule in flaconi idonei per crioconservazione (circa 0,5 mL = 1,5 x 10 ⁶ / flaconcino).
4. Posizionare le fiale in un contenitore fiImbevuto con 2-propanolo e mettere il contenitore a -80 ° C per un minimo di 2 ore e fino a 2 settimane.
5. Trasferire le fiale alla fase di vapore di un serbatoio di azoto liquido.
6. Per riavviare la coltura cellulare, scongelare una fiala congelata in un bagno d'acqua a 37 ° C.
7. Raccogliete delicatamente le cellule in 7 ml di mezzo NI completo pre-riscaldato in un tubo da 15 ml usando una pipetta da 1000 μl.
8. Centrifugare le cellule a 130 xg per 3 min.
9. Rimuovere il surnatante e riposizionare delicatamente le cellule in 1 ml di mezzo completo NI utilizzando una pipetta da 1000 μl.
10. Diluire ulteriormente la sospensione cellulare in 3 o 4 ml di mezzo completo NI e contare le cellule usando il blu tripanico e un contatore di cellule automatiche (nota: diluire 20 μL di sospensione cellulare in 20 μL di blu trypanico, la resistenza dopo scongelamento dovrebbe essere ≥ 80 %).
11. Piattare i NSCs in un piatto Petri da 60 mm (o tampone T25) ricoperto ad una densità di circa 50.000 cellule / cm ² .

5. CharaCterizzazione di cellule neuronali e gliali derivate da hiPSC

NOTA: Al momento della differenziazione, i derivati ​​neuronali e gliali possono essere caratterizzati utilizzando tecniche diverse, come quelle descritte nelle sezioni seguenti.

1. Analisi quantitativa PCR in tempo reale (qPCR) ¹⁰
   1. Spin giù i frammenti di colonia hiPSC, EBs e / o NSC a 130 xg per 3 min.
   2. Resuspendere il pellet cellulare in 100 μl di freddo tampone di lisi RNA fornito in un idoneo kit per l'estrazione di RNA.
   3. In alternativa, raccogliere direttamente i derivati ​​neuronali / gliali dalle piastre aspirando il mezzo e aggiungere il freddo tampone di lisi RNA ai pozzetti per raccogliere le cellule.
   4. Isolare l'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
   5. Reverse-trascrivi 500 ng dell'RNA totale utilizzando un kit idoneo per RNA a retrotranscrizione cDNA.
   6. Eseguire le reazioni qPCR in duplicato utilizzando un appropriato mix master e un primer(Vedi tabella dei materiali ).
   7. Registrare l'emissione fluorescente in tempo reale: 45 cicli con primer che si addensano a 60 ° C.
   8. Normalizzare le quantità RNA relative a GAPDH e β-actina come geni di riferimento e utilizzare hiPSC indifferenziati o cellule non trattate per le condizioni di calibrazione (metodo ΔΔCt). In alternativa, utilizzare un altro metodo adatto.
2. Immunocitochimica e immagini ad alta contenuto (HCI) ^{6 , 11}
   1. Fissare le colonie hiPSC, NSCs e / o derivati ​​neuronali / gliali con paraformaldehide freddo al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
   2. Lavare delicatamente le cellule in 1X PBS e conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di 1 mese.
   3. Quando è pronto per la colorazione, permeabilizzare le cellule in tampone di permeabilizzazione (1x DPBS contenente 0,1% tritone-X-100 e 3% BSA) per 15 minuti a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere la permeabilizzazione buFfer e incubare le cellule nel buffer di blocco (3% BSA / 1X DPBS) per 15 minuti a temperatura ambiente per evitare il legame non specifico degli anticorpi.
   5. Rimuovere il buffer di blocco e incubare le cellule durante la notte a 4 ° C nel tampone di blocco contenente opportuni anticorpi primari (vedere la tabella dei materiali ).
   6. Lavare le celle 3 volte con 1x PBS.
   7. Incubare le cellule per 45 min a temperatura ambiente nel tampone di blocco contenente anticorpi secondari coniugati con fluorochrome (vedere la tabella dei materiali ), contrassegnando i nuclei con il colorante DAPI.
   8. Quantificare l'intensità media di fluorescenza e le percentuali relative dei tipi di cellule utilizzando un'appropriata piattaforma di imaging ad alto contenuto, se disponibile (vedere la tabella dei materiali ).
      NOTE: per determinare il livello di intensità dello sfondo fluorescente, incubare alcune cellule / pozzetti con solo anticorpi secondari. L'analisi citometrica di flusso di vivo (non fisso), undPossono essere eseguiti hiPSC differenziati per valutare l'espressione di marcatori specifici PSC, come SSEA4 (vedi tabella dei materiali ). Le colonie hiPSC indifferenziate possono essere analizzate per l'attività di fosfatasi alcalina utilizzando i kit BCIP / NBT commercialmente disponibili, seguendo le istruzioni del produttore (vedi tabella dei materiali ). Inoltre, possono essere eseguiti assay e analisi di array di proteine ​​di fase inversa (RPPA), come descritto nel riferimento 12 (per un elenco di anticorpi testati, vedere la tabella dei materiali ).
3. Misure elettrofisiologiche ¹³
   1. Piastra i frammenti di rosetta dissociata (dopo 7 DIV) o NSCs derivati ​​da rosette su matrici multielettrodi rivestite (MEAs, vedere la tabella dei materiali ) nel mezzo ND completo (~ 1 x 10 ⁵ cellule / chip MEA singolo pozzetto).
   2. Dividere le cellule per 3 settimane in mezzo completo ND, rinfrescante thE mezzo due volte alla settimana.
   3. Al termine della differenziazione, sigillare i chip MEA con una membrana semi-permeabile sotto un cappuccio di flusso laminare per mantenere le culture sterili per ripetute misurazioni.
   4. Sostituire uno degli elettrodi con un riferimento di terra, consentendo registrazioni dagli elettrodi rimanenti.
   5. Registrare la frequenza di cottura media (MFR; numero di picchi / min) usando un amplificatore MEA con il controllo di processo integrato di temperatura impostato a 37 ° C e 5% CO ₂ .
   6. Rileva i picchi dai dati grezzi MEA usando il limite di soglia di -4.7σ (σ rappresenta la deviazione standard del rumore basale).
   7. Processare i dati di post-registrazione con un software appropriato.

Caratterizzazione di hiPSC indifferenziati

Per valutare il fenotipo degli hiPSCs, occorre eseguire l'analisi della morfologia colonia / cellulare, la determinazione di marcatori specifici PSC e l'esame dell'espressione genica e dell'attività fosfatica alcalina. I hiPSC indifferenziati dovrebbero essere rotondi, con grandi nucleoli e senza citoplasma abbondante. La maggior parte delle colonie dovrebbe essere caratterizzata da una morfologia piatta e strettamente confezionata, indicativa di un fenotipo indifferenziato ( Figura 2A e Figura 2B ). Inoltre, più dell'80% delle colonie dovrebbe essere positivo per la colorazione delle attività di fosfatasi alcalina ( Figura 2C ).

Circa l'80% delle cellule dovrebbe essere positivo per i marcatori classici relativi a pluripotenza, come Oct4, SSEA3, SSEA4 e Tra1-60 ( Figura 2D-H ), come dimostrato dall'immunocitochimica e dalla citometria di flusso, mentre le percentuali delle cellule di nestin + e β-III-Tubulin + dovrebbero essere significativamente basse (circa l'8% e il 3% Come mostrato in Figura 2H ). Questi risultati dovrebbero essere riproducibili nei passaggi.

Figura 2. Caratterizzazione di IMR90-hiPSC indifferenziati. (A e B) Immagini rappresentative di contrasto di fase (ingrandimenti 10X e 20X) di colonie IMR90-hiPSC indifferenziate. (C) immagini rappresentative di colonie colorate con fosfatasi alcalina (ingrandimento 4 volte). (DF) Immagini immunocitochimiche rappresentative di (D) Oct4 (rosso), (E) SSEA3 (verde) e (F) TrA1-60 (verde). (G) Grafico a punti rappresentativo di colorazione SSEA1 (CD15) e SSEA4, analizzati mediante citometria a flusso. (H) Il grafico a barre mostra le percentuali di Oct4 + (~ 75-80%), Tra1-60 + (~ 75-80%), SSEA3 + (~ 75-80%), nestin + (~ 10-15% ) E le cellule β-III-tubulin + (~ 3 - 7%), contrassegnate con DAPI e quantificate con HCl, con una media di 3 a 5 repliche biologiche ± il SEM (grafico modificato dal riferimento 6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione della pluripotenza tramite formazione di EB

HiPSCs sono pluripotenti, il che significa che esprimono tre geni correlati allo strato germinale in condizioni appropriate. Per valutare la pluripotenza hiPSC, è possibile applicare un comuneApproccio basato sulla formazione spontanea di EB, che induce la formazione dei tre strati germinali 14 . L'analisi dei geni specifici del livello di germe deve indicare un aumento temporale dell'endoderm (α-fetoproteina (AFP) e Cytokeratin 18 (KRT18)), ectoderm (Nestin, SRY-box 1 (Sox1) e scatola 6 accoppiata (Pax6) ) E mesoderm (espressione genica del peptide natriuretico A (NPPA) e Brachyury-T) ( Figura 3A e Figura 3B ); Vedere la tabella dei materiali.

Figura 3. Valutazione della pluripotenza mediante formazione di EB. ( B) Il grafico a barre mostra le analisi qPCR di mesodermica (NPPA e brachyury), ectodermica (Pax6, Sox1 e nestin) e endodermica (AFP e KRT18 ) Geni, normalizzati ai geni di riferimento, β-actina e GAPDH, e calibrati a cellule indifferenziate (Day 0). Questo è il metodo ΔΔCt, con una media di 5 analisi indipendenti ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Grafico modificato dal riferimento 6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Induzione della differenziazione neuronale e gliale

IMR90-iPSCs possono essere differenziate in colture miste di neuroni post-mitotici e cellule gliali seguendo le fasi riepilogate in Figura 1 e nelle sezioni del protocollo. 5-8 giorni dopo la placcatura dei EB su piatti standardizzati a matrice o laminina in presenza di una media completa di NRI, le strutture rosette dovrebbero cominciare a diventare visibili (= "Xfig"> Figura 4A). Le rosette sono caratterizzate dalla presenza di cellule Nestin (precursori neuronali, ~ 90%), con poche cellule β-III-tubulin + (cellule neuronali impegnate, ~ 5-10%), quest'ultimo generalmente localizzato principalmente alla periferia Rosette ( figura 4B , rosette sul giorno 12).

Alla dissociazione rosetta e replating su piatti o lastre laminati standard o matrici in presenza di un mezzo ND completo, le cellule iniziano a differenziarsi in colture miste di neuroni e glia, progressivamente formando cluster di corpi cellulari neuronali collegati da fasci di neuriti ( Figura 4C e Figura 4D ). Risultati simili dovrebbero essere ottenuti quando si analizzano le popolazioni neuronali ottenute espandendo NSC derivate da rosette e li differenziano in neuroni e glia. Le NSC espanse dai rosoni dovrebbero essere nEstin + ( Figura 4E , insetto che mostra nestin + cellule).

Dopo 21 giorni di differenziazione, le cellule dovrebbero essere positive per il β-III-tubulina; NF200; Tau; E MAP2, il marker tardivo dei dendriti ( Figura 4D , 4F e Figura 4H), con almeno il 10-15% delle cellule positive per la proteina acido fibrillare gliale (GFAP), un marker astrogliale ( Figura 4G e Figura 4H) . Inoltre, ~ 20-30% delle cellule dovrebbe mantenere l'espressione del nestin dopo la differenziazione ( Figura 4H ). È importante considerare che la percentuale di ciascun tipo di cellula ( cioè neurone, astrocitico, nestin + cellule) può variare rispetto ai passaggi e può essere osservata variabilità dipendente dall'utente.

Analizzando specifiche subpopulazioni neuronali, i neuroni GABAergic rappresentanoHa inviato ~ 15 - 20% delle cellule totali, i neuroni dopaminergici ~ 13 - 20% e i neuroni glutamatergici ~ 35 - 42%, come dimostrato dalla immunostaining per acido gamma-aminobutirrico (GABA), tirosina idrossilasi (TH) e glutammato vescicolare Trasportatore 1 (VGlut1) rispettivamente (vedere la quantificazione rappresentativa in Figura 4H ). L'induzione della differenziazione può anche essere valutata mediante l'analisi di marcatori correlati alla pluripotenza ( es., Oct4, Tra1-60 e SSEA3), che dovrebbero essere significativamente ridimensionati in cellule differenziate contro i hiPSC indifferenziati (non mostrati, vedi Riferimento 6). Ciò può anche essere confermato attraverso l'analisi dell'espressione genica da qPCR, che dovrebbe indicare una diminuzione di Oct4 e Nanog e l'upregulation dei geni neuronali, come la molecola adesione delle cellule neurali 1 (NCAM1) e la proteina 2 associata al microtubulo (MAP2); Il gene presinaptico, sinaptofisina (SYP); E il gene post-sinaptico, la proteina associata a microtubuli tau (MAPT), come mostrato in < Strong class = "xfig"> Figura 4I. Inoltre, i geni correlati dopaminergici (TH e NR4A1), noradrenergici (PHOX2A e PHOX2B), glutamatergici (NARG2, GRIA1 e GAP43), GABAergici (GABRA1 e GABRA3), i neuroni motori (ISL1 e LHX3) e colinergici (SLC5A7 e SLC18A13) Provocano cellule neuronali regolate rispetto alle cellule indifferenziate ( Figura 4J ).

L'analisi dell'attività elettrica spontanea, tramite MEA, è un utile lettura per valutare la funzionalità della rete neuronale in hiPSC differenziati. Al termine del periodo di differenziazione, i derivati ​​neuronali sono generalmente caratterizzati da un tasso medio di tiro (MFR) di almeno 60 picchi / min (si veda il diagramma raster rappresentativo di Figura 4K ). Tuttavia, non vengono osservate esplosioni.

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Figura 4. Differenziazione di IMR90-hiPSC in Culture Miette dei Neuroni e Glia. (A e B) Immagini rappresentative delle rosette dopo 7 DIV (A) e dopo 12 DIV (B) , colorate per nestin (verde) e β-III-tubulina (rosso)). (C e D) Immagini rappresentative di cellule differenziate dopo 22 DIV (C) e 28 DIV (D) , colorate per β-III-tubulina (rosso) e NF200 (verde)). (E) Immagine rappresentativa di NSC derivata dalla dissociazione e dall'espansione dei rosoni (insetto mostra nestin + cellule, rosso). (F e G) Le immagini rappresentative delle cellule neuronali ( F , colorate per NF200 (rosso) e Tau (verde)) e le cellule gliali ( G , macchiate per GFAP (rosso)) differiscono da NSC (dopo 21 DIV). (H) Quantificazione di nestin, MAP2, GFAP, acido gamma-aminobutirrico (GABA), trasportatore vescicolare glutammato 1 (VGlut1) e le cellule positose di tirosina idrossilasi (TH) mediante HCI, confrontando i derivati ​​IMR90-hiPSC e le cellule differenziate da NSCs derivate da IMR90-hiPSC (grafico modificato dal riferimento 7). (I e J) I grafici a barre che mostrano qPCR analisi dei geni pluripotenziali (Oct4 e Nanog) e dei geni neuronali (NCAM1, MAP2, SYP e MAPT) (I) e dopaminergici (TH e NR4A1), noradrenergici (PHOX2A e PHOX2B) Glutamatergico (NARG2, GRIA1 e GAP43), GABAergico (GABRA1 e GABRA3), neurone motorico (ISL1 e LHX3) e geni correlati colinergici (SLC5A7 e SLC18A13 ) . Tutte le analisi sono state normalizzate ai geni di riferimento, β-actina e GAPDH, e calibrati a cellule indifferenziate (barre verdi). Questo è il metodo ΔΔCt, con una media di 5 analisi indipendenti ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. I grafici in I e J sono stati modificati dal riferimento 6. (K) Rappresentativa trama raster di IMR90-NSC derivato neur(La registrazione è stata effettuata per un minimo di 600 s; le barre verticali rappresentano singole punte). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una firma specifica di marcatori neuronali è regolata in IMR90-hiPSC differenziati

Nel nuovo paradigma di test di tossicità, è essenziale definire gli eventi molecolari e cellulari che si verificano all'interno di una cellula dopo l'esposizione ad un dato tossicodipendente. Pertanto, è importante caratterizzare quali percorsi di segnalazione sono attivati ​​e / o sovraordinati all'interno del modello cellulare in esame.

Le matrici commercialmente disponibili per l'analisi dell'espressione genica di proteine ​​chinasi possono essere utilizzate per confrontare i hiPSC indifferenziati rispetto alle cellule differenziate. differen(IMF) / TGF-beta pathways e la presenza di piastrine trombocitoproteine ​​(BMP) e di TGF-beta, Recettori dei fattori di crescita derivata (PDGF) ( Figura 5A e Figura 5B ).

L'analisi di RPPA mostra l'upregulation di una specifica firma neuronale in hiRCs differenziati IMR90. In particolare, i diversi percorsi di segnalazione Erk / CREB, Akt / PDK1 / mTOR e Notch1 vengono attivati ​​dopo la differenziazione ( Figura 5C ).

Figura 5. Le cellule differenziate neuronali e gliali mostrano l'attivazione di percorsi correlati al neurone. (UNE B) i grafici a barre riportano le analisi qPCR delle chinasi correlate al neurone (A) e altri geni correlati alla chinasi (B) . I dati di espressione genica sono stati normalizzati ai geni di riferimento 18S e GAPDH (forniti nell'array) e calibrati a cellule indifferenziate. Per queste analisi, un gene è stato considerato significativamente regolato quando la sua espressione è stata almeno 2x più alta di quella delle cellule indifferenziate (2 -ΔΔCt ≥ 2); Media di 3 analisi indipendenti ± il SEM). (C) Il grafico a barre mostra le quantificazioni proteiche assolute mediante analisi RPPA, confrontando differenti (barre rosse) e cellule indifferenziate (barre verdi). Le proteine ​​appartenenti alle stesse cascate del percorso di segnalazione sono raggruppate come segue: CREB / Erk / Akt, PDK1 / mTOR / Erk / Akt, Notch1, Shh e Wnt, SAPK / JNK e BMP / SMAD. Mean ± il SEM di 4 analisi indipendenti. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Grafico modificato fRom Riferimento 6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le colture neuronali / gliali derivate da IMR90-hiPSC possono essere utilizzate per valutare gli effetti del rotenone

Rotenone, inibitore del complesso I della catena respiratoria mitocondriale, è noto per provocare stress ossidativo attivando l'attivazione del percorso Nrf2. Nelle condizioni di quiescenza, Nrf2 è ancorata nel citoplasma da Keap1 (Kelch-like ECH-associated proteina 1), un repressore Nrf2, che facilita l'ubiquitina Nrf2 e la proteolisi 15 . Al momento dell'induzione dello stress ossidativo, Nrf2 trasloca nel nucleo e attiva l'espressione dei geni bersaglio Nrf2-ARE 16 .

Neuroni derivati ​​da IMR90-hiPSCLe cellule gliali possono essere utilizzate per valutare gli effetti del rotenone sull'attivazione Nrf2 esponendo le cellule a diverse concentrazioni di rotenone ( ad esempio, 1, 10 e 100 nM) per 24 ore. Queste concentrazioni sono state stabilite secondo gli studi precedenti 17 , 18 .

A queste concentrazioni e tempi di esposizione, il rotenone non ha determinato la citotossicità, come dimostra la quantificazione dei nuclei cellulari DAPI + in vivo ( Figura 6A ). Rotenone ha indotto la traslocazione nucleare Nrf2, soprattutto dopo aver esposto le cellule a 100 nM di rotenone ( Figura 6B e Figura 6E ). Alla stessa concentrazione è stata osservata una significativa diminuzione del Keap1 citoplasmatico ( Figura 6C ), unitamente ad un aumento sia dell'ididoreductasi 1 (NQO1) di NAD (P) H, sia del Sulfiredoxin 1 (SRXN1), due Nrf2 target enZymes 19 , 20 ( Figura 6D ).

Figura 6. Effetti di Rotenone sulla trasfusione nucleica Nrf2, livelli di proteina Keap1, SRXN1 e NQO1. (A) Quantificazione di cellule DAPI + in vivo ( cioè nuclei non-pirnapotici) su 24 h di trattamento con 1, 10, 100 nM rotenone e normalizzati a cellule non trattate (Control, Ctr). (B) La traslocazione nucleare della proteina Nrf2 ( cioè i rapporti nucleari / citoplasmatici) dopo 24 ore di esposizione a rotenone, valutata mediante misurazioni dell'intensità di fluorescenza usando analisi HCI. (C) Quantificazione dei livelli proteici citoplasmatici di Keap1 sul trattamento con rotenone, valutato mediante analisi HCI. (D) Quantificazione di NAD (P) H quinone ossidoreductasi 1 (NQO1) e SulfiRedoxina 1 (SRXN1) mediante immunofluorescenza e HCI dopo 24 ore di trattamento con rotenone. (E) Immagini rappresentative della localizzazione della proteina Nrf2 (verde). Tutti i valori sono indicati come la media ± SEM di 3 repliche biologiche. * P <0,05, ** p <0,01; Figura modificata dal riferimento 7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A queste concentrazioni e tempi di trattamento, il rotenone ha anche suscitato un aumento della concentrazione dipendente dalla concentrazione della percentuale di cellule astrogliche (GFAP + ) ( Figura 7A e Figura 7B ), senza influenzare le proporzioni di NSC (nestin + ) ei neuroni (MAP2 + ) 7B ). Guardando le proporzioni di sottotipi neuronali specifici, il trattamento rotenone (10 nM e 100 nM)Ha significativamente diminuito il numero dei neuroni dopaminergici (TH + ) ( Figura 7C e D ), mentre le percentuali dei neuroni GABAergiche (GABA + ) e glutamatergiche (VGlut1 + ) non sono cambiate ( Figura 7D ). Analogamente, precedenti studi in vivo e in vitro hanno descritto una morte cellulare cellulare neuronale dopaminergica dipendente da rotenone e selettiva 21 , 22 , 23 .

Figura 7. Effetti del Rotenone sulle cellule gliali e sui neuroni dopaminergici. (A) Rappresentative di immagini di cellule GFAP + (rosso), con ingrandimento 40X nelle insetti, non trattati o trattati con 100 nM rotenone per 24 h. (B) Quantificazione Di cellule Nestin + , MAP2 + e GFAP + , normalizzate a cellule non trattate (controllo, Ctr). (C) Rappresentative di immagini dei neuroni dopaminergici TH + (verde), con ingrandimento 40X negli insetti, non trattati o trattati con 100 nM rotenone per 24 h. (D) Quantificazione delle cellule neuronali GABA + , VGlut1 + e TH + , normalizzate a cellule non trattate (Ctr). Tutti i valori sono indicati come la media ± SEM di 3 repliche biologiche. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Figura modificata dal riferimento 7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il significato statistico è stato valutato con un ANOVA a senso unico con il test di confronto multiplo di Dunnett come un post-test (confrontando tutte le colonne rispetto alla colonna di controllo)Xref "> 24 o da due teste t-test non accoppiati o accoppiati secondo il tipo di analisi Tutti i dati rappresentano la media di almeno tre repliche biologiche ± l'errore standard della media (SEM) Un asterisco su una barra indica Una differenza significativa con il gruppo di controllo. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

Tabella 1.
Nota sulla densità di placcatura del rosone dissociato: se i frammenti di rosetta non sembrano completamente dissociati, per raggiungere una densità di placcatura cellulare di circa 15.000 cellule / cm2, i frammenti di rosette dissociati derivanti da circa 50 EB / 1 x 60mm possono essere risospesi in 50 ml di NRI completo e placcato come segue (a seconda del formato della lastra):

Tabella 2: Criteri di accettazione

Gli autori non hanno niente da rivelare.