Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare le cellule staminali neurali derivate da colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane in colture miste di cellule neuronali e gliali. Questo modello è adatto per lo screening della tossicità chimica e farmacologica. Questo modello in vitro può essere applicato per valutare le perturbazioni indotte da sostanze chimiche delle vie di segnalazione che vengono attivate durante il processo di differenziazione neuronale e gliale.

Il vantaggio principale di questo sistema è quello di utilizzare un modello umano derivato da cellule staminali pluripotenti indotte che rappresenta un'alternativa alle cellule tumorali tradizionalmente utilizzate e alle colture primarie animali e consente di studiare la neurotossicità in popolazioni miste di cellule neuronali e gliali. La procedura sarà illustrata da Francesca Pistollato, la nostra post-doc, e Carolina Nunes, una studentessa post-laurea del nostro laboratorio. Inizia passando le colonie di hiPSC.

Lavorando al microscopio stereoscopico con un ingrandimento di quattro X in una cappa a flusso laminare, utilizzare una siringa da un millilitro con un ago da 30 gauge. Tagliare le colonie di cellule staminali in quadrati di circa 200 micron per 200 micron. Il taglio delle colonie richiede una buona manualità per ottenere frammenti di uguali dimensioni.

L'uso di utensili da taglio disponibili in commercio può aiutare. Quindi utilizzare una pipetta da 200 microlitri per staccare i frammenti di colonia dalla superficie della piastra pipettando delicatamente il terreno sottostante per sollevare i pezzi. Trasferire circa 100 frammenti di colonia in una piastra da 60 millimetri rivestita con DMEM F12 a matrice qualificata, riempita con quattro millilitri di terreno hiPSC completo.

Quindi incubare il nuovo piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Esegui un cambio totale del terreno ogni giorno e ispeziona la morfologia delle colonie utilizzando un microscopio a contrasto di fase a quattro ingrandimenti X e 10X. Il giorno zero della procedura di differenziazione, rinfrescare il terreno hiPSC aggiungendo tre millilitri di terreno per capsula di Petri da 60 millimetri.

Quindi tagliare e staccare i frammenti da 200 micron come prima. Pipettare i frammenti staccati e il terreno in una provetta da 15 millilitri. Sciacquare la pirofila con due millilitri di terreno hiPSC completo e recuperare tutti i frammenti.

Quindi centrifugare a 112 volte G per un minuto. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere delicatamente i frammenti in cinque millilitri di terreno hiPSC EB completo. Piastra l'intero volume in una piastra per coltura tissutale a bassissimo attacco da 60 millimetri.

Incubare la capsula per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo controllare le cellule con il microscopio invertito. Il giorno in cui i corpi embrioidi dovrebbero apparire arrotondati e distinti l'uno dall'altro, come si vede qui.

Quindi pipettare i corpi embrioidi e il terreno dal piatto e trasferirli in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare i corpi embrioidi a 112 volte G per un minuto. Il secondo giorno aspirare la soluzione di rivestimento della matrice standard da un piatto da 60 millimetri precedentemente preparato e aggiungere cinque millilitri di mezzo di induzione neuroepiteliale completo, o NRI, al piatto.

Lavorando al microscopio stereoscopico con un ingrandimento di quattro X e utilizzando una pipetta da 200 microlitri, raccogliere circa 50 corpi embrioidi galleggianti e trasferirli in un piatto rivestito. Quindi incubare la capsula a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, terzo giorno della procedura di differenziazione, controllare la capsula al microscopio con un ingrandimento di 10X per assicurarsi che i corpi embrioidi siano tutti attaccati.

Quindi eseguire delicatamente un cambio totale del terreno con un mezzo NRI completo. Cambiare il mezzo NRI a giorni alterni fino al settimo giorno, quando dovrebbero essere visibili aggregati neuroepiteliali simili a rosette. Il settimo giorno, rivestire una piastra da 96 pozzetti pipettando 100 microlitri di matrice standard diluita in terreno di coltura in ciascun pozzetto.

L'ottavo giorno, tagliare gli aggregati a rosetta in frammenti al microscopio stereoscopico con ingrandimento 10X in condizioni sterili. Si noti che le rosette tendono a staccarsi facilmente dal piatto quando vengono toccate con l'ago. In questo caso, disaggregare parzialmente la rosetta staccata con la punta dell'ago.

Se le rosette rimarranno parzialmente attaccate, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per completare il distacco dei frammenti di rosetta. Le talee a rosetta richiedono una buona manualità e precisione per evitare di tagliare derivati neurosessidermici. Successivamente, raccogli i frammenti di rosetta e il loro terreno in un tubo conico da 15 millilitri.

Sciacquare la pirofila con due millilitri di terreno NRI per recuperare tutti i frammenti. Quindi centrifugare i frammenti di rosetta a 112 volte G per uno o due minuti. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di un X DPBS preriscaldato senza calcio e magnesio.

Pipettare delicatamente i frammenti di rosetta su e giù per dissociarli parzialmente. Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno NRI completo e contare le cellule utilizzando il blu di tripano e un contatore di cellule automatizzato. Successivamente, aspirare la soluzione di rivestimento della matrice standard dalla piastra a 96 pozzetti e depositare le cellule nei pozzetti a una densità di circa 15.000 cellule per centimetro quadrato in terreno NRI.

Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno 10, eseguire un cambio totale del mezzo utilizzando un mezzo di differenziazione neuronale completo. Questa immagine rappresentativa mostra rosette dopo 12 giorni in vitro colorate per nestina in verde e beta tre tubulina in rosso.

Qui le cellule che sono state coltivate per 28 giorni in vitro sono state colorate per la tubulina beta tre in rosso e NF200 in verde. Questa immagine rappresentativa mostra le cellule neuronali differenziate dalle NSC dopo 21 giorni in vitro colorate per NF200 in rosso e tow in verde. Qui le cellule gliali della stessa coltura sono colorate per GFAP in rosso.

Questo istogramma confronta la quantificazione di nestina, MAP due, GFAP, acido gamma-amminobutirrico, trasportatore vescicolare del glutammato uno e tirosina idrossilasi nelle cellule positive ai derivati di IMR90 hiPSC e nelle cellule differenziate dai NSC derivati da IMR90 hiPSC. Queste immagini a contrasto di fase scattate utilizzando un obiettivo 10X mostrano cellule staminali neuronali in fase di differenziazione per 21 giorni. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altre letture come la PCR quantitativa in tempo reale e la rianalisi multilaterale al fine di valutare la fisiologia e il fenotipo delle cellule neuronali e gliali e valutare l'effetto delle sostanze chimiche.

Non dimenticare che lavorare con composti chimici può essere estremamente pericoloso. Ecco perché le precauzioni pertinenti devono essere sempre prese utilizzando occhiali, guanti o maschera sotto il cappuccio di flusso, soprattutto quando si eseguono trattamenti chimici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere una popolazione mista differenziata di neuroni e cellule gliali a partire da cellule staminali pluripotenti indotte umane che rappresentano un modello adatto, un modello in vitro, per lo sviluppo di test di neurotossicità.