Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl
Summary
El desarrollo de la glándula mamaria en el roedor se ha evaluado típicamente mediante evaluaciones descriptivas o mediante la medición de atributos físicos básicos. La densidad de ramificación es un indicador del desarrollo mamario que es difícil de cuantificar objetivamente. Este protocolo describe un método fiable para la evaluación cuantitativa de las características de ramificación de las glándulas mamarias.
Abstract
Un número creciente de estudios están utilizando la glándula mamaria de roedor como punto final para evaluar la toxicidad de desarrollo de una exposición química. Los efectos que estas exposiciones tienen en el desarrollo de la glándula mamaria se evalúan típicamente usando mediciones dimensionales básicas o marcando características morfológicas. Sin embargo, la amplia gama de métodos para interpretar los cambios en el desarrollo podría llevar a traducciones inconsistentes entre los laboratorios. Se necesita un método común de evaluación para que las interpretaciones adecuadas puedan formarse a partir de los datos que se comparan entre los estudios. El presente estudio describe la aplicación del método de análisis Sholl para cuantificar las características de ramificación de las glándulas mamarias. El método de Sholl se desarrolló originalmente para su uso en la cuantificación de patrones dendríticos neuronales. Mediante el uso de ImageJ, un paquete de software de análisis de imágenes de código abierto, y un complemento desarrollado para este análisis, la densidad de ramificación de la glándula mamaria y la complejidad de la amSe determinó la glándula mamaria de una rata hembra peripubertal. Los métodos descritos aquí permitirán el uso del análisis de Sholl como una herramienta eficaz para cuantificar una característica importante del desarrollo de la glándula mamaria.
Introduction
La ramificación de las glándulas mamarias es una característica que comúnmente se evalúa como un indicador del desarrollo de las glándulas, pero es difícil de cuantificar objetivamente. En 1953, Sholl 1 describe un método para medir arborización dendrítica neuronal en las cortezas visuales y motoras del gato, y un plugin para esta técnica fue desarrollada por Ferriera et al 2. Debido a que las neuronas y las glándulas mamarias exhiben una estructura parecida a un árbol similar, el plugin se empleó para cuantificar las densidades de ramificación epitelial mamaria en imágenes 2D de la glándula mamaria peripubertal de rata. La etapa peripuberal fue elegida para el análisis porque el destete es una etapa de la vida que se evalúa a menudo en los laboratorios académicos y los estudios de la guía de la prueba. El análisis de Sholl es un plugin distribuido con FIJI, que es el paquete de procesamiento de imágenes de código abierto ImageJ, con complementos adicionales incluidos. El complemento crea una serie de anillos concéntricos que rodean un prefijo(Típicamente el soma de una neurona o el origen del conducto primario de una glándula mamaria) y extendiéndose hacia fuera hasta la porción más distal del objeto (el radio envolvente). A continuación, cuenta el número de intersecciones (N) que se producen en cada uno de los anillos. El complemento también devuelve un coeficiente de regresión de Sholl ( k ), que es una medida de la tasa de decaimiento de la ramificación epitelial.
Utilizando ImageJ, se crea una imagen esqueletizada de una glándula mamaria de montaje completo y se mide el área epitelial mamaria (MEA). La imagen se analiza utilizando el plugin de análisis de Sholl, y se devuelven valores para N yk , entre otros valores no utilizados aquí. La densidad de ramificación epitelial mamaria se determina mediante el cálculo de N / MEA. La extensión a la cual la ramificación continúa en las regiones externas del epitelio glandular es la complejidad de la ramificación y es un indicador del crecimiento epitelial distal uniforme. Como k es una medida de la disminución distal en epítetoEs una medida eficaz de la complejidad ramificada y un indicador fiable del desarrollo mamario.
Este protocolo describe un método asistido por ordenador para crear imágenes esqueletizadas de glándulas mamarias globales y evaluar cuantitativamente las características de ramificación mamaria en ratas peripuberales macho y hembra. Este método es relativamente rápido y no requiere el uso de equipos de microscopía especializados. El desarrollo y la validación de este método se describen en Stanko et al. (2015) 3 . Este informe también describe la preparación de glándulas mamarias de rata enteras = monturas. Se han descrito procedimientos mamarios de montaje completo similares en de Assis et al. (2010) 4 y Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde el nacimiento hasta la pubertad, el crecimiento de la glándula mamaria es alométrico. Después de la pubertad, la glándula mamaria se desarrolla a través de ramificaciones ductales extensas y elongación, que continúan hasta que el epitelio mamario ocupa la almohadilla de grasa entera. Las características de ramificación son un aspecto importante del desarrollo de la glándula mamaria y la capacidad de cuantificar objetivamente estas características puede ser muy útil para evaluar el desarrollo mamario no…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Michael Easterling (Sistemas Social y Científico, Inc., Durham, NC) por su ayuda con la validación de este método y el Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canadá) Asistencia con la aplicación Sholl.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
Riferimenti
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