Summary
血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。
Abstract
内皮層は、多くの異なる機能を制御することによって体内の恒常性を維持するために不可欠です。内皮層による炎症反応の調節は、効率的に有害な入力との戦いや、被災地の回復の援助に不可欠です。Ccl5、Cxcl1、Cxcl10 など水溶性の炎症性サイトカインを表現してトリガー内皮細胞がリポ多糖 (LPS)、グラム陰性の細菌膜の外側のコンポーネントなど、炎症性の環境にさらされる、循環白血球の活性化。さらに、内皮細胞表面に接着分子 E セレクチン、VCAM 1 と icam-1 の発現は相互作用および内皮層と最終的に炎症を起こしている組織へ漏出する活性化白血球接着できます。このシナリオで、過剰なまたは欠陥のある活性化白血球動員は炎症関連疾患につながる可能性がため血管内皮機能はしっかりと調整されなければなりません。これらの疾患の多くは効果的な治療法はありません、ので血管の層を中心に新しい戦略を調べる必要があります。白血球機能を変更新規の内皮レギュレータの検索に有用な包括的な試金を提案します。含むいくつかのテクニック (など、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子) 白血球動員に関与する特定の表現ターゲットを用いた内皮活性化分析: リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT-qPCR)、西部のしみ方、フローサイトメトリーおよび接着アッセイの流れ。これらのアプローチは、炎症における血管内皮機能を決定して新しい治療戦略の設計の潜在的価値のある小説の内皮炎症性の規制当局を特徴付けるためのスクリーニングアッセイを実行する非常に便利です。
Introduction
炎症が感染性病原体、病原体を排除し、損傷した組織を修復する主要な目的に対して有益な生物学的反応です。炎症は慢性感染症や自己免疫疾患など、特定の条件下では解決しません。代わりに、連続浸潤白血球、組織の損傷、線維化、損失関数、および全体的な障害者と患者のいくつかの例の死につながる長期免疫応答の結果の異常な反応があります。これらの人間の疾患、炎症性疾患としてカタログ化すべては白血球の血管外漏出1,2の制御のための血管を含みます。
血管内皮細胞は、白血球が人身売買を制御することによって炎症反応の調節に基本的な役割を果たします。安静時の内皮をアクティブにし、炎症性サイトカイン(Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1 等)と接着分子 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 表現内皮層が LPS など炎症性メディエーターにさらされて、その好意感染部位に白血球の循環の募集。リリースされたサイトカインによってプライミング白血球ローリングと特派員の接着対応による内皮層との相互作用を仲介する: セレクチン VCAM 1 α4β1 インテグリン、icam-1 へ αLβ2 インテグリン PSGL 1。最後に、白血球は炎症3の焦点に向かって血管間で移行します。
炎症性応答の調節における血管内皮細胞の重要な役割は、LPS 受容体、toll 様受容体 4 (TLR4) 内皮細胞でのみ表現する遺伝的に変更されたマウスで実証されています。これら内皮 TLR4 の動物が lps の炎症と菌接種後に生成される感染症を検出する対応し、その結果感染解像度と野生型マウス4と同等のレベルで生存を達成することができます。,5。
炎症性応答の内皮規制経路のためと仮定されている白血球の血管内皮細胞の相互作用のいくつかの段階で抑制が内皮の移行とのより良い予後の削減になること炎症関連疾患。実際には、炎症性疾患6、7のための治療として免疫細胞の血管外漏出を妨げるため内皮細胞活性化と白血球の血管内皮細胞の相互作用を対象とするいくつかの戦略を設計されています。
本報告では、炎症性刺激の lps 応答の内皮の活動と白血球の活性化と血管の層への接着におけるその役割を完全に特徴づける培養技術の徹底したグループを表します。Hortelano et al.による記述で、この原稿で使用される内皮細胞モデルはマウス肺血管内皮細胞ライン (MLEC-04)8.、MLEC 04 セルラインは内皮活性化9,10を勉強する適切なシステムであるため文献で検証されています。研究に基づいて、これらのアプローチが容易に推定する、血管内皮に白血球のシステムや炎症性プロファイル。選択した条件で血管内皮のパラメーターを定義した後、システムは血管の活性化を評価する提案の実験に新薬をテストできます。炎症性の中で、セルの条件を制御する目的の化合物をテストする内皮細胞を比較できます、任意の結果の違いは薬の開発と炎症の進行に予後の結果を通知可能性があります。最後に、血管内皮細胞炎症関連疾患に対する新規血管特定薬剤の設計に影響を与える新しい創薬ターゲットの特性に関連するシステムを提案する.
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Protocol
1 です血管内皮細胞培養
37 ° C で 30 分間- 2.5 mL ゼラチンでコート 100 mm 組織培養プレートを 培養処理板 のソリューション (蒸留水のオートクレーブ、ゼラチン 0.1%); これ。必要な井戸のフォーマットに推測することができます。ゼラチン溶液を吸引し、ティッシュ文化フードで風乾するプレートのままにします 。
- 組織培養条件
- (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 生物インキュベータ内 MLEC 04 細胞を養います。ダルベッコの完全なメディアのセルを育てる ' s 修正イーグル培地: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12) 10% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 100 単位/ml ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL (P/S) と補完 。
- 標準ノイバウアー チャンバー法によるセルをカウントし、MLEC 04 セルを 10 mL の完全なメディア、2-11 × 10 4 セル/cm 2 の低密度で 100 mm のゼラチン処理版に追加します。合流点に達すると 1:3 のセルを分割します
。 注: 通常これは文化で 2 〜 3 日後に発生します 。
- サブカルチャー 10 ml 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (0.25% トリプシン、5 ミリメートルの EDTA) を追加することによって続いて、37 で 3 分間インキュベート プレートを洗浄することによりセル ° C
- は、トリプシン-EDTA 反応を停止し、10 mL の完全なメディアを追加することによって浮遊細胞を回復します。スピン ・ ダウン (300 × g、5 分) 細胞、上澄みを廃棄、適切に完全なメディアとサブカルチャーの細胞のペレットを再懸濁します 。
2。LPS 処理とメディエーター
- プレートの次の井戸のフォーマットにサブの合流点での完全なメディアの MLEC 04 細胞: 細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 2.5 10 5 細胞/ウェルの 96 ウェル プレート x 7 x 10 5 。
- では、6 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) セルのインキュベーターでの培養を孵化させなさい。不完全なメディア (DMEM f12 キー、P/S) にセルを切り替え、同期して細胞の活動を抑える (上) 一晩を残しています 。
- メディアを取り出し、培養内皮細胞 (またはしない) 新規の薬理学的化合物をテスト薬物問題の (例えば DT 10) 不完全なメディア (30 分、37 ° C) で希釈した; 1.4 mL を追加/6 ウェル プレートまたは 0.14 のよくmL/ウェルの 96 ウェル プレート).
- 分析では各指定期間インキュベーション メディア (100 ng/mL、最終濃度) に組合を追加してセルに挑戦します。コントロールとして PBS を使用します 。
3。RT qPCR による活性化血管内皮細胞の転写プロファイルの評価
- 6 も培養でサブの合流でシード MLEC 04 セル板 (7 x 10 5 細胞/ウェル)。(37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 6 時間インキュベートし、その後血清飢餓に進みます (の孵化).
- メディアを取り出し、興味の薬剤と文化 (37 ° C、30 分インキュベート) 不完全なメディアで希釈した; 1.4 mL を追加/6 ウェル プレート (30 分、37 ° C) にも血管内皮細胞を治療 (または治療しない).
- (2.3 の手順で説明) の培養メディアを 100 ng/mL LPS を追加することによって、細胞に挑戦し、孵化 6 h 冷 PBS で 2 回洗浄することにより反応を停止するため、サンプル処理まで-80 ° C でプレートを維持します 。
- RNA の抽出
- プレートを解凍し、1 mL/ウェル RNA 抽出バッファー (38% フェノールと 0.8 M ためイソチオ シアン酸; 材料の表を参照) を追加します。1.5 mL チューブ内の攪拌と収集ホモジネートの下で室温 (RT) で 30 分残す 。
- 200 μ L のクロロホルムを追加し、RT と遠心分離機 (11,600 × g、15 分間、4 ° C) で 3 分間 15 s. 加温のため軽く揺り動かす 。
- は、別 1.5 mL チューブに液相を転送します。RT し遠心分離 (11,600 x g、4 ° C) で、10 分で 500 μ L のイソプロパノールを追加することによって RNA を沈殿します 。
- 上澄みを廃棄し、渦攪拌と (7,500 × g, 4 ° C)、遠心分離による 75% のエタノールの餌を洗浄します 。
- ペレットを風乾、サンプル処理まで-80 ° c 55 ° C 続ける RNA で 10 分間インキュベートし、25 μ L 純粋な H 2 O の RNA を可溶化します 。
- 量と RNA の純度
- 260 でサンプルの吸光度を測定することにより RNA 濃度を定量化する nm の分光光度計 (材料の表 を参照してください).
- メジャー 230 nm と 280 nm の RNA の純度を決定する
。 注: 260/280 の比率はタンパク質またはフェノールの汚染を示します。2 に近い比率は許容されます。260/230 では、EDTA、炭水化物またはフェノールの汚染物質を示します。2.0 2.2 までの値が許容します 。
- RNA のチェックの整合性
- 総 RNA、RNA の実行 2 μ g agarose のゲルを変性剤濃度 1.5% のはしご; ゲルのドキュメンテーション システムの可視化 (材料の表 を参照してください).
注: 鮮明 28 s、18 s rRNA バンドの 2:1 の比率はそのまま RNA を示します。部分的にまみれて外観として RNA 解決を低下します 。
- 総 RNA、RNA の実行 2 μ g agarose のゲルを変性剤濃度 1.5% のはしご; ゲルのドキュメンテーション システムの可視化 (材料の表 を参照してください).
- RT qPCR
- 標準に従って一本鎖 RNA から相補的 DNA (cDNA) を合成プロトコル (参照 材料表) 11.
- RT qPCR による評価遺伝子発現
- 各サンプルの反応混合物の準備: ミックス 2 μ L cDNA、7 μ L 蛍光化合物、300 nM 前方プライマー、300 nM 逆プライマー (表 1) で、13 μ L の最終巻、96 ウェル リアクション プレートに追加 (材料の表 を参照してください).
- 光学接着カバー、遠心分離機 (300 × g, 1 分) でプレートをシールし、リアルタイム PCR システムの反応を実行 (ホット スタート 95 ° C、20 s に続いて 40 サイクル: 95 ° C 3 s の 60 ° C、30 s) (材料の表 を参照してください).
- は、比較メソッド 2 を使用して相対定量による結果を分析 -ΔΔCt ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH) または酸性リボソーム リン蛋白質 P0 (36B4) 12.
4。フローサイトメトリーによる内皮細胞の活性化を評価する
- 以下のセクション 2 で説明されている条件 MLEC 04 細胞を治療し、フローサイトメトリーによる内皮細胞表面タンパク質の変化を評価します 。
- デタッチ 6 h に記載されているトリプシン-EDTA による LPS 刺激後の細胞ステップ 1.2.3, と 4 で不完全なメディアで洗って ° C
- は、ノイバウアー チャンバー法を用いたセルをカウントし、u 下 96-ウェル プレートに 10 x 10 の 4 セルを配置します。遠心分離機 (300 × g、5 分) と 180 ° によって上澄み破棄下の元の位置を素早く回復に上から手首のスナップします 。
- セルに不完全なメディア (10 μ G/ml、最終濃度) で希釈した選択した抗体の 50 μ L を追加し、(30 分、4 ° C) をインキュベートします 。
- 洗浄 2 回 w不完全なメディアに記載されている手順に従うステップ 4.3, と対応する二次抗体の 10 μ G/ml で 50 μ L で孵化させなさい ith FITC または類似した共役 (30 分、暗い空間で 4 ° C) に結合します 。
- は、PBS 洗浄続いて不完全メディアで一度セルを洗ってください。1 mL ピペット チップを使用して 300 μ L の PBS のセルを回復し、フローサイトメトリー管を配置します 。
- 流れの cytometry 中のサンプルの評価 (材料の表 を参照してください)。前方および側散乱パラメーターによってセル人口を調整します。ゲート興味の人口。アイソタイプ コントロールと培養細胞から負の制御に基づくゲートを調整します。陽性細胞の割合として結果を分析または蛍光強度 8 を意味します 。
5。西部のしみのによる内皮細胞の活性化を評価
- 6 ウェル培養皿 (7 x 10 5 細胞/ウェル) サブ合流で内皮細胞を播く、セクション 2 の説明に従って、LPS と扱います。次の西部のしみのプロトコルによって炎症性蛋白質の表現を分析します 。
- 内皮細胞応答のさまざまな側面を明らかにする異なる時点で lps を停止:
- LPS 刺激の 6 h 後炎症性蛋白質のプロファイルを確認します 。
- セルシグナ リング 60 分の期間で 15 分毎を決定します 。
- 両方のケースで冷 PBS で 2 回洗浄することにより、反応を停止し、サンプル処理まで-80 ° c のサンプルを保存します 。 各ウェル (1% 非イオン性界面活性剤、トリス-HCl、10 mM 1 mM EDTA、塩化ナトリウム 150 mM、30 mM ピロりん酸ナトリウム、フッ化ナトリウム 50 mM、2.1 mM ナトリウム バナジンで
- Lyse 細胞や蛋白質の抽出
- 追加 200 μ L の換散バッファーpH 7.6, プロテアーゼ抑制剤のカクテルを補充) (資料の表を参照).
- 動揺、4 ° C で 15 分ピペット チップと井戸をこすり、1.5 mL チューブの磨砕液を収集をインキュベートします 。
- 4 の 11,600 x g でチューブを遠心分離機 ° C
- 処理まで-80 ° C できれいな 1.5 mL チューブに上清を保存します 。
- 標準に従ってビシンコニン酸法による蛋白質の集中のプロトコル (材料の表参照) のメジャー 13.
- は、10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 14 ドデシル硫酸ナトリウム 0.1% の標準法による総蛋白ライセート サンプルごとに 30 μ g を解決します。10 mM β-メルカプトエタノール (還元条件) 付きまたはなしサンプルを実行 (非還元条件) 興味の蛋白質を検出するために使用する抗体によって異なります 。
- 標準的な手順を使用して 0.45 μ m 孔径 (PVDF) 転送ブロッティングにポリアクリルアミドゲルから分けられた蛋白質を転送します 。
- 移転後、0.1% ポリソルベート 20 (PBS-T)、PBS で 2 回膜を洗浄し、PBS-T 検出されたリン蛋白質または撹拌 (90 分、下の総蛋白質のため PBS t 5% 脱脂乾燥したミルクの希釈 20 mL 2 %bsa を追加することで非特異的結合部位をブロックRT).
- 10 mL の推奨濃度で適切なブロック バッファーで選択した抗体を希釈し、撹拌 (ON, 4 ° C) の下で膜を孵化させなさい。また、密封されたポリ袋の膜を配置し、5 mL の希釈を使用します 。
- 次の日、(余分な PBS ユニット-T、15 分、RT) 回 3 つの膜を洗浄する.
- 1: 10,000 適切なブロック バッファー内で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 行きの特派員の二次抗体の 10 ml (30 min, RT) 攪拌下膜加温します 。
- 3 回攪拌 (余分な PBS ユニット-T、15 分、RT) の下で膜の洗浄です 。
- ペルオキシダーゼ基質強化化学発光 (ECL) の 0.1 mL/cm 2 で 1 分の膜を孵化させなさい。2 つの透明なプラスチック シートの間に排水膜を置き、Charged-Coupled デバイスのカメラ (CCD) を含む化学発光検出装置にそれを挿入します。
- CCD カメラを使用して、信号と累積プログラムで画像を記録するソフトウェアを検出 (画像は、合計 15 分間、すべての 30 秒露出で蓄積された信号を表示) します 。
- デンシトメトリーによるユーザー ガイド 15 に記載されているプロトコルに従う ImageJ ソフトウェアを使用してバンド強度を定量化します。
- ImageJ ソフトウェアでサンプルを開き、長方形選択ツールで興味のバンドを選択します 。
- 最初のレーンとプレス プロットの輪郭のプロットを取得するレーンを選択します 。
- 直線の選択のピークの領域を区切るです 。
- 各ピークの内側をクリックして各バンドのサイズを測定します 。
- 制御タンパク質 (β-アクチン、チューブリン、等) の読み込みに関する結果を表します 。
6。内皮因子は、付着の試金による白血球活性化からの解放を評価
- 内皮付きメディアを入手します。
- 2 のセクションで示されているように、MLEC 04 細胞を扱うし、後 24 h LPS 刺激培養上清を収集 (100 ng/mL).
- は、扱われた MLEC 04 セルおよび遠心分離機 (600 x g) からエアコンのメディアを収集します。使用するまで-80 ° C で 0.5 ml の上澄みを維持します 。
- 白血球粘着試験
- コート (0.1 M 酢酸の希釈はコラーゲン) を除いて PBS で希釈した選択した細胞外マトリックス蛋白質の 50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート: フィブロネクチン (1 ~ 10 μ g/mL)、ラミニン (1 〜 10 μ g/mL) とコラーゲン タイプ I (10-40 μ g/mL)。4 ° C でのままに
- コーティングされたメディアを破棄し 150 μ L の PBS、1 %bsa 熱不活化 (1 分、100 ° C)、90 分の室温で井戸の非特異的結合サイトをブロック
- PBS で 2 回洗浄し、井戸に 100 μ L の以前に収集された内皮付きメディア (セクション 6.1 を参照) を追加します
。 注: プレート接着アッセイを実行する準備ができている 。
- 文化 (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 生物のインキュベーターでマウスの単球マクロファージ細胞株 J774 とロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI)、10% 1% FBS P/s.
注: J774 細胞懸濁液に成長していく 。
- は、15 mL の管および遠心分離機 (300 × g、5 分) に J774 細胞を収集します。上澄みを廃棄し、10 mL の血清無料メディアで細胞のペレットを再懸濁します。ノイバウアー区域のセルをカウントします。(300 × g、5 分) 細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、50 μ L メディアあたり 15 × 10 4 J774 細胞血清自由な媒体の細胞を再懸濁します 。
- 追加 15 × 10 4 J774 セルそれぞれに 50 μ L の血清無料メディアでよく、CO 2 セル インキュベーターで 37 ° C で 1 時間後 4 ° C で 15 分間インキュベートします 。
- は、暖かい PBS を追加することによって井戸を 2 回、軽く洗う; (300 x g、5 分) を遠心し、下の元の位置を素早く回復にトップから手首のスナップを 180 ° で上澄みを廃棄します。接続されたセルを修正します。PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 100 μ L/ウェルを追加することによって s (10 min, RT) を孵化と 。
- 優しくメディアを破棄、優しくした破棄メディアで 2 分間 PBS で 2% メタノールでセルを permeabilize し、90 の 20% メタノールで 0.5% クリスタル バイオレットの 50 μ L/ウェルを追加することによって、細胞を染色した s
- は豊富な実行している水を洗浄、余分な液体を破棄し、空気乾燥させておきます。デジタル カメラの光学顕微鏡に結合によって接続されたセルを報告します 。
- では、0.1 M クエン酸ナトリウム、50% エタノールの 100 μ L/ウェルを追加することによって染色細胞を薄くしなさい。545 nm で吸光度または細胞接着として 100% を考慮した付着率の任意の単位として結果に井戸に到達を表す吸光度コーティング リガンド濃度の増加とともにメジャー
7。白血球内皮共同接着アッセイによる内皮活性化をテスト
- セクション 2 の説明に従って、96 ウェルプレート上 MLEC 04 セルを扱うし、組合 (6 h、37 ° C) incubate 。
- J774 細胞と Carboxyfluorescein 染色エステル (CSFE) の蛍光ラベルします。
- 洗浄、J774 6.2.5 の手順に従って PBS のセルします。カウント、ノイバウアーによるセルの部屋の方法と 1 × 10 6 セル/mL の pbs は、0.1 %bsa で再懸濁します 。
- 37 ° c. を追加 5 mL 不完全メディアで 20 分 CFSE (5 μ M、最終濃度) で細胞をインキュベートし、(5 分、4 ° C) をインキュベートします 。
- 6.2.5 で説明したように、不完全なメディアで 1 回洗浄. 15 × 10 4 セル/100 μ L で再懸濁します、共同接着アッセイに進みます 。
- 内皮治療後不完全なメディアで 3 回洗浄します。内皮コートもそれぞれに CFSE J774 細胞 (15 × 10 4 セル/100 μ L) を追加します。37 で 60 分間続く 4 ° C で 10 分間プレートをインキュベート ° C
- 6.2.7 で説明するよう、優しく洗浄します、温めた PBS を使用する、次の 2 つの方法によって内皮層に J774 接着のレポート:
- 溶解 0.1 M トリス-HCl pH 8.8, 1% SDS のセル (100 μ l/ウェル) 測定と、。蛍光分析による CFSE J774 信号 (励起/蛍光 = 492 nm/517 nm)。蛍光強度の任意の単位または肯定的な制御に関して付着の割合として結果を表す (追加合計のセルから信号を各ウェル).
- 蛍光顕微鏡下で可視化によって 4 %pfa とレポートのセル CFSE J774 細胞の内皮細胞への愛着を修正 (励起/蛍光 = 492 nm/517 nm).
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Representative Results
RT qPCR による内皮細胞の LPS 誘導性活性化の評価
飢えた血清 MLEC 04 細胞が 100 ng/mL LPS の 6 時間によって刺激され、内皮細胞の遺伝子発現は、休憩状態に活性化マーカーの発現を比較することによって RT qPCR を使用して査定されました。図 1 aのように、LP 培養 MLEC 04 細胞は炎症性応答 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 中に白血球動員に関与する選択した接着分子の発現を誘導しました。この実験的な治療下式は変更されていないので、PECAM 1 は内部統制として使用されました。図 1 bは、Ccl5、Cxcl10、および Cxcl1 サイトカインの mRNA 発現の増加によって測定される組合による内皮活性化を表します。これらの分子は、白血球、内皮層と炎症のサイトに後で漏出に、人身売買を含む循環の活性化に関与しています。サイトカイン、IL4 は、この実験的な治療下での内部統制として使用されました。
図 1: 評価 LPS 誘導性の血管内皮細胞の RT qPCR による活性化。、100 ng/mL で組合の 6 h (赤い棒) 制御条件 (青い棒) と比較のため MLEC 04 細胞が刺激され、RT qPCR による遺伝子発現解析を行った。グラフ表示の選択した内皮細胞接着分子 (A) の条件を制御に関して mRNA の倍誘導とサイトカイン (B) 白血球活性化および炎症性応答の間に募集に関連します。PECAM 1 と IL4 は、この条件下でのネガティブ コントロールとして使用されました。実行すると、3 つのうちの 1 つの実験から ± SEM を意味する 3 通で実施、結果が表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
LPS 処理血管内皮細胞の接着分子の発現
前のセクションで説明するよう MLEC 04 細胞に炎症性の刺激を行いウエスタンブロット法によるタンパク質の発現を調べた。安静時の内皮細胞は、接着分子 vcam-1, ICAM 1 (としてラベル) のほぼ検出不可能なレベルを示します。Lps (+) では、内皮活性化表現型 (図 2) の説明のマーカーの発現のアップレギュレーションによって明白であります。膜は、デンシトメトリーの分析後バンドの相対的な密度を計算するローディング コントロールとして使用された β-アクチンの検出によって正規化されました。
図 2: LPS 処理血管内皮細胞の接着分子の発現します。代表的な西部のしみ評価 vcam-1, ICAM 1 蛋白質式休憩 (-) では、MLEC 04 細胞 LPS 処理 (+) と比較。Β-アクチンは、ローディング コントロールとして使用されました。各蛋白質の分子量は、角かっこでは。値は、相対帯域密度の半定量化を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Lps 炎症における血管内皮表面マーカー
LPS による 6 時間刺激後フローサイトメトリーによる炎症における血管内皮活性化を行った (100 ng/mL)。この状態では、白血球の相互作用に関与する接着剤関連分子の検出を行った。図 3 aの左側のパネルは、アイソタイプ ネガティブ コントロール (黒ドット ヒストグラム) と比較して休憩 MLEC 04 細胞 (赤ソリッド ヒストグラム) で指定したマーカーの基礎式を表します。図 3 aの右側のパネルは、刺激 MLEC 04 から得られた結果を示しています。LPS 処理大幅 E セレクチン、接着分子の発現を誘導 vcam-1, 静止状態 (黒ドット ヒストグラム) と比較されたとき血しょう膜 (赤ソリッド ヒストグラム) の ICAM 1。示すように、フローサイトメトリー プロファイル、引用する前に、本実験条件下で PECAM 1 の表現は変更されません。図 3 bは、内皮細胞の炎症性反応の可能な仲介人を評価するための参照として使用数量値を示します。%: 肯定的な細胞の割合MFI: 蛍光強度を意味します。
図 3: lps 炎症における血管内皮表面マーカー 。安静時に細胞接着分子のフローサイトメトリー プロファイルの流れおよび LPS 刺激 MLEC 04 細胞。左側のパネルは、一致アイソタイプ コントロール (Ctrl ブラック ヒストグラム) に対する静止期細胞 (抗原というラベルの付いた赤ヒストグラム) の蛋白質の表現を示しています。右側のパネルでは、LPS 処理の内皮細胞 (赤ヒストグラム) をコントロール細胞表面蛋白質の表現 (黒ヒストグラム) を比較します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
血管内皮細胞における LPS 刺激によって引き起こされるシグナル伝達経路
炎症における血管コンパートメント活性化に関与するメカニズムは、キーのシグナリング分子の評価によって調査されます。蛋白質の抽出のためさまざまな期間で LPS 刺激を受けた MLEC 04 細胞が処理され、ウエスタンブロット法による活性化の程度を調べた。図 4は、NF-κ B シグナル伝達の IκB α リプレッサーが 15 分 LP-インキュベーション後リン酸化し、1 時間後基底レベルに戻ることを示します。LPS が ERK 1/2 をアクティブに、他の一方で、炎症の際に内皮細胞活性化に関与する、本質的な経路を確立する 15 分後に伝達します。膜正規化された β-アクチンまたは ERK 1/2 検出デンシトメトリーの分析後バンドの相対的な密度を計算するローディング コントロールとして使用されました。
図 4: 内皮細胞の LPS によって引き起こされるシグナルします。MLEC 04 細胞 100 ng/mL で LP 時代の刺激は、図に示すし、ERK 1/2 (P-ERK 1/2)、(P-κ) を介して Nf-kb のシグナル伝達経路が西部のしみによって評価しました。ERK 1/2 合計と β-アクチンは各条件のコントロールの読み込みとして使用されました。各蛋白質の分子量は、角かっこでは。値は、相対帯域密度の半定量化を表します。拡大版を表示するのにはここをクリックして下さいこの図では。
内皮細胞の LPS 刺激による白血球行動の制御
炎症反応の進行に内皮活性化の調節の生物的関連性は、白血球パフォーマンスの機能アッセイによって決定されます。前述の [プロトコル] セクションに、2 つの異なるアプローチが内皮細胞によって規制されて白血球機能をテストするため含まれます。法は、炎症反応 (白血球の活性化、白血球の相互作用における内皮細胞の接着分子の西部のしみが発表した内皮細胞のサイトカイン Rt-qpcr) のさまざまな側面を問い合わせたり、得られたデータは、します。両方は白血球の付着の微細なディテールを評価します。内皮の液性因子による白血球の活性化は、いくつかの基材への細胞接着を優先として、効率的な炎症性応答を開発するため不可欠です。図 5 aは、μ g/mL フィブロネクチン コート コントロールからの応答を以前に収集された調節されたメディアの井戸または LPS 処理血管内皮細胞を 0.5 J774 細胞接着を示しています。明視野画像や吸光光度測定は、付着の誘導によって示すように、内皮細胞の LPS 処理からエアコンのメディアにリリース要因が J774 活性化を効率的に誘導するための十分なことを示すフィブロネクチン。図 5Bは、内皮細胞の接着分子発現の小説によって白血球接着をサポートする血管層の能力を評価する共同接着アッセイを表します。簡単に言えば、6 h の lps 刺激 MLEC 04 細胞血清飢餓 10mj/cm ^2 文化は数回洗浄されされ J774 以前付いた蛍光プローブ、CFSE 白血球ラインと共培養します。カルバゾール測定、顕微鏡写真のように、LPS 血管刺激支持 CFSE J774 細胞の内皮細胞膜への作用します。
図 5: LPS インキュベート共同接着アッセイ内皮単分子膜に白血球の相互作用します。(A) 光学顕微鏡画像クリスタル バイオレット染色 0.5 μ g/mL コーティング フィブロネクチン井戸コントロールまたは LPS 処理血管内皮細胞からの応答を調節されたメディアに接続されている J774 細胞を示します。スケール バー、50 μ m。以下に示す吸光光度分析は、3 通を代表的な実験のための任意の単位 (a.u.) ± SEM として表現される吸光度測定を示します。(B) の蛍光顕微鏡写真を示す CFSE J774 細胞をコントロールまたは共同接着アッセイを用いて LPS 投与 MLEC 04 細胞に接続されています。スケールバー = 50 μ m。以下に示すけい光分析は、3 通を代表的な実験のための任意の単位 (a.u.) ± SEM として表現される蛍光強度を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲット | NCBI RefSeq ID | 転送シーケンス (5´-3´) | 逆の順序 (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | 法 GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC 猫 CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT ギャグ GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG 猫 CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM 1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E セレクチン | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM 1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM 1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
表 1: 本研究で使用されるプライマーのリスト。
| 休憩 | LP | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| Ctrl キー | 1.79 | 3.5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM 1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| E セレクチン | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM 1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM 1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
表 2: lps 炎症における血管内皮表面マーカー 。フローサイトメトリー分析による安静時および LPS 刺激 MLEC 04 細胞の細胞接着分子発現の定量化。各マーカー陽性細胞 (%) と平均蛍光強度 (MFI) 安静時および LPS 刺激血管内皮細胞の割合に対応する代表的な値です。PECAM 1 は、これらの実験条件下でのネガティブ コントロールとして使用されました。
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Discussion
この内皮細胞のプロトコルでは、炎症反応の調節に関与する探索機構のための基礎を確立する段階的な技術について説明します。これらのアプローチ LPS 刺激血管内皮の活動の研究に基づいており、具体的には炎症性応答の間に白血球動員に関与する重要なステップの評価: 内皮細胞のサイトカインのリリースでは、内皮細胞の接着血管層に分子式と白血球接着。内皮のパラメーターを確立すると、システムの内皮機能の調節に関与する新規な化合物が検索でき、その結果、炎症の進行。それらの規制薬物は医薬品市場に関心の可能性のあるできます。このシーケンシャル プロトコルの主要な投影は、相対血管活動パラメーターを調整することにより内皮細胞の種類と刺激条件にこれらの研究を拡張するための基盤を確立することです。
このスクリーニングによって選択された薬は炎症性疾患に対する新規治療戦略の設計の興味深い候補を構成します。一方、内皮細胞の応答を支持し白血球動員に貢献化合物は免疫不全の条件16,17のために有望になります。その一方で、内皮の阻害剤は慢性炎症性疾患10の優れた治療法を構成します。
刺激血管内皮細胞によって表現されるサイトカインの特徴は、炎症の進化を予測します。サイトカインは炎症性のコンテキストで内皮層によって発表された小さい蛋白質であり、白血球の行動を強く規制します。Ccl5、Cxcl10 Cxcl1 など、炎症性のメンバー白血球表面に彼らの特定の受容体に結合し、血管層 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) で新しく表現した接着分子と白血球の相互作用を誘発する信号と病理学的領域 (図 1, , 図 2図 3)8,10,18に白血球の遊走。蛋白質の同じ家族の他のメンバーは、炎症とその結果組織修復の解像度に関与しています。白血球動員を妨げる免疫クリアランス10,19,20を好むのでこれらの抗炎症性サイトカインの発現は慢性炎症性疾患に関するものです。可能な内皮炎症レギュレータを選択すると、このサイトカイン発現アッセイを行い、興味の化合物の存在下で内皮細胞の接着分子発現を評価することをお勧めします。実際には、病気の進行の予測値として使用することができますプロ炎症性サイトカインと抗炎症のレベルを分析し、治療関心21の薬を明らかにします。
MAP キナーゼ ERK 1/2 率いる複雑な細胞内シグナル伝達カスケードその細胞表面受容体のトリガーにバインド LPS、JNK と p38 と Nf-kb シグナロソームは、炎症性の転写プログラムを誘発するが。これらの経路の多くは、TNF-α や IL-110,22などその他の炎症性刺激に共通です。内皮細胞の活性化は、リン酸化 ERK 1/2図4 に示すように、マップのキナーゼ メンバーを検出することにより決定されます。また、LPS による内皮細胞の活性化は Nf-kb 阻害物質が低下し、複雑な IKKβ の酵素活性を誘導する Nf-kb エフェクター メンバー核移行の特派員を実行をできるように、複雑な IκB転写活性 (図 4)。薬を記述する、しかしまた互換性の従来の治療法との組み合わせで新規炎症治療を設計だけではなく、非常に有用、内皮細胞の炎症反応に影響する薬剤の混合物のメカニズムを特徴付ける23。
化合物内皮炎症性スクリーニングの試金から選択すると、最終的には、細胞が炎症性疾患の責任として白血球行動アッセイの重要なステップの機能の関連性を確認するためさらに検討が必要があります。これらのアッセイは、2 つの異なる実験的設定の白血球活動を分析します。最初は、インテグリンを介する接着アッセイによって白血球活性化サイトカインが血管内皮リリースの役割を評価するのにです。白血球インテグリンは、血管内皮にリリースされたサイトカインによってアクティブ化されます。したがって、白血球インテグリンのリガンドに接着能力は白血球機能8,10,18の代表的な測定であります。2 番目は、共同接着アッセイによって血管層に白血球の相互作用で新しく表現した内皮細胞接着分子の役割を研究中です。炎症性のコンテキストで表される内皮細胞接着分子は、周囲の組織への白血球動員に不可欠です。したがって、炎症の進行 (図 5)8,10,18の予後的価値を構成する白血球細胞の内皮治療単分子膜との相互作用を分析します。これらのアプローチから得られた結果は、選択した物質が炎症性疾患の治療の将来戦略の設計の深刻な候補者であることをお勧めしたいです。
ここで定義された実験の提案は、異なる細胞または促進システムに外挿法で推定する能力のため将来のアプリケーション汎用性の高いツールです。プロシージャは、異なる起源または種、およびLPS、TNF α、細菌、ウイルスなど異なる炎症性代理店と同様、いくつかの免疫細胞は、その機能をテストする内皮を変更できます。テキストに従って、研究する必要があります最初後炎症反応の選択した化合物の役割を特徴づけるための独自のシステムで内皮活性化を特徴付けます。プロトコルの制限は、適切なネガティブ コントロールと刺激の状態から休憩を見分ける内皮アクティビティ パラメーター正確に定義の選択です。本稿で説明する条件が異なるシステムの動作しない場合は、研究者は、追加の時間依存の試金の実行して炎症性の刺激の濃度勾配を利用した実験的パラメーターをトラブルシューティングする必要があります。炎症性応答の規則のための新しい薬をテストするための刺激ウィンドウを定義します。
最後に、この内皮炎症性プロトコルは、n の検索をオススメです。東西内皮レギュレータは炎症性応答をターゲットします。この手順を実行する小説、将来応用を勉強し、炎症性疾患に対する革新的な血管特異療法を設計に適用することができ、潜在的のことができる興味深い化合物を提供します。医薬品市場に興味。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事に支えられた Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO)、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III (ISCIII) (許可番号 IERPY 1149/16 アダムローリー; にMPY 1410/09 s. Hortelano に);で、フォンド ・ デ ・危惧サラッド (FIS) (S. Hortelano に番号 PI11.0036 および PI14.0055 を付与) を介して MINECO。S. エランス ・ ISCIII から IERPY 1149/16 に対応しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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