Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

Cellule staminali neurali (NSC) generare neuroni e cellule macroglial durante lo sviluppo della corteccia cerebrale. Al primi-corticogenesis, NSC sottoporsi a diversi cicli di divisione cellulare simmetrica ed espandere il pool di cellule progenitrici. Quindi, NSC dividono asimmetricamente per generare neuroni direttamente o indirettamente attraverso mediatori¹. Solo a metà - alla fine-corticogenesis, progenitori passare per generare gli astrociti e oligodendrociti^2,3,4. Tuttavia, i completare i meccanismi che controllano la proliferazione delle cellule e differenziazione, come pure il contributo dei progenitori destino-limitato alla generazione di tipi unici di neuroni o cellule macroglial rimangono una questione di intenso dibattito^4,5,6. Il potenziale delle singole CSN corticale per generare neuroni, astrociti e oligodendrociti è stato estesamente studiato in vitro e in vivo utilizzando una miriade di tecniche come: live imaging in cella singola culture^{7,8,9,10,11,12,13}; live imaging ad alta densità culture culture^3,14,15; live imaging fetta culture^16,17,18; analisi clonale utilizzando virale mediata da vettore genetico etichettatura ad alta densità culture^{14,15,19,20,21}; analisi clonale in vivo utilizzando retrovirus^{22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33}; e analisi clonale in vivo usando animali transgenici³⁴.

Ognuna di queste tecniche presenta vantaggi e svantaggi. Per esempio, in vivo lignaggio traccia è suscettibile al lumping e scissione errori³, che porti a conclusioni contrastanti circa il potenziale dei singoli progenitori corticali. Inoltre, sia gli studi in vitro ed in vivo basano sull'etichettatura delle cellule progenitrici a intervalli di tempo iniziale e posteriore analisi delle stirpi delle cellule possono essere influenzata dall'avvenimento inosservato di morte delle cellule durante il lignaggio-progressione³⁵. Di conseguenza, un sistema adatto per analizzare le potenzialità del singolo NSCs dovrà consentire l'identificazione di tutte le cellule generate, così come la caratterizzazione appropriata dei destini di cella all'interno della stirpe. Combinazione di colture cellulari primarie e live imaging fornisce questa impostazione. Utilizzando cella singola cultura e time-lapse video microscopia, Tempio et al hanno dimostrato l'interruttore del lignaggio della corteccia cerebrale individuale progenitori da neurogenesi al gliogenesis¹¹. Più tardi, hanno usato lo stesso sistema per mostrare che i diversi tipi di neuroni sono generati da un unico progenitore corticale¹². Tuttavia, questo sistema presenta un importante avvertimento: solo 1% dei progenitori corticali isolati alle prime corticogenesis generare cloni di 4 o più progenie⁹. Dopo l'aggiunta di FGF2, la frequenza delle cellule generando 4 o più celle aumenta a 8-10%⁹. Tuttavia, questo numero è troppo piccolo considerando che praticamente tutti i progenitori corticali sono proliferativi in questa fase. Inoltre, i potenziali effetti di FGF2 il destino-specifica non possono essere esclusa³⁶. Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo usato colture ad alta densità cellulari che supportano la proliferazione di entrambi ventricolare (Pax6-esprimendo) e subventricolare (Tbr2-esprimendo) corticale progenitori¹⁵. L'osservazione in tempo reale di queste culture ha inoltre dimostrato che diverse caratteristiche della progressione del lignaggio di NSC sono riprodotte in queste condizioni, come la modalità di divisione cellulare, allungamento del ciclo cellulare, il potenziale delle singole cellule per generare neuroni e cellule gliali, tra gli altri^3,15. Più recentemente, abbiamo utilizzato questo sistema anche a dimostrare che CREB-segnalazione colpisce la sopravvivenza delle cellule dei neuroni immaturi corteccia cerebrale in topi³⁷. Così, crediamo che Time-lapse video-microscopia della corteccia cerebrale murino primario le cellule coltivate in ad alta densità è uno strumento potente e accessibile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della progressione del ciclo cellulare, la modalità di divisione cellulare, la sopravvivenza delle cellule e cellula destino specifica. Quest'ultima può essere eseguita utilizzando animali transgenici, permettendo l'identificazione di destini cellulari specifiche tempo reale^38,39,40 o l'uso di post-imaging immunocytochemistry^3,38,41,42.

Qui, forniamo un protocollo passo dopo passo per preparare la corteccia cerebrale primaria coltura cellulare supporto proliferazione delle CSN e la successiva generazione dei neuroni e delle cellule macroglial. Inoltre discutiamo l'uso di transfezione mediata retrovirale per manipolare l'espressione genica delle cellule individuali, che possono essere identificati e monitorata a livello di singola cellula usando la microscopia video time-lapse. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare la corteccia cerebrale primario cellule isolate dall'inizio alla fine del corticogenesis nei roditori, ma qualche aggiustamento può essere richiesto secondo la fase¹⁴. NSC isolate da altre fonti può essere studiata anche usando la microscopia video time-lapse di culture 2D, ma il sistema di coltura appropriato dovrebbe essere determinato comparando i comportamenti delle cellule in vitro e in vivo^38,43.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi descritti in questo protocollo sono condotti secondo le leggi nazionali e internazionali e sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università locale (CEUA/UFRN), con la licenza 009/2014. Il seguente protocollo viene eseguito in un ambiente sterile. È prevista familiarità con la coltura cellulare di base.

1. Microdissezione del telencefalo dorsolaterale

1. Preparare il terreno di dissezione (100 mL): 98,5 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL).
2. Filtrare-sterilizzare il mezzo di dissezione.
3. Rimuovere gli embrioni embrionali del giorno 14 (E14) da un topo gravido C57/Bl6 (Mus musculus) in anestesia con isoflurano.
   NOTA: Considerare E0 come il giorno del rilevamento del tappo vaginale. La dissezione deve essere completata entro e non oltre 1 ora dalla rimozione dal topo gravido. Questo protocollo si applica anche agli embrioni E11-E17.
4. Rimuovere gli embrioni mediante isterectomia in condizioni sterili.
5. Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con terreno di dissezione freddo (4 °C).
6. Rimuovere il cervello dal cranio tagliando lungo la fessura longitudinale. Il numero di embrioni di solito varia da cinque a dieci. Ogni cervello E14 produce circa 2 x 10⁶ cellule, inclusi progenitori e neuroni postmitotici (rapporto 1:1)
   NOTA: Utilizzare lo stereomicroscopio per i seguenti passaggi.
7. Rimuovere le meningi utilizzando una pinza per dissezione. Dividi il telencefalo a metà per separare gli emisferi. Per isolare il telencefalo dorsolaterale, tagliare lungo la curva dorsomediale e il confine palliale-subpalliale utilizzando una pinza da dissezione. Trasferire il telencefalo dorsolaterale in una provetta da 2 mL con terreno di dissezione freddo (4 °C) fino a quando tutti i cervelli non sono stati sezionati.

2. Dissociazione e placcatura cellulare

1. Preparare il terreno di proliferazione (50 ml di DMEM+10% FCS): 44 ml di terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle's (DMEM), 5 ml di siero fetale di vitello (FCS), 0,5 ml di glucosio al 40%, 0,5 ml di penicillina/streptomicina (10.000 unità/ml e 10.000 μg/ml). Sterilizzare con filtro il mezzo di proliferazione.
2. Preparare il terreno di differenziazione (50 mL di DMEM+2% B27): 48 mL di DMEM, 1 mL di B27, 0,5 mL di glucosio al 40%, 0,5 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL). Filtrare-sterilizzare il mezzo di differenziazione.
3. Dopo la microdissezione del telencefalo dorsolaterale da topi E14, centrifugare la provetta con il tessuto raccolto e il mezzo di dissezione a freddo (per 5 minuti a 4 °C, 340 x g) per far precipitare il tessuto.
4. Rimuovere il surnatante con una pipetta e aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA (0,05%) preriscaldata (37 °C) per la digestione chimica. Incubare per 15 minuti a 37 °C. Aggiungere 2 mL di terreno di proliferazione per arrestare l'attività della tripsina.
5. Lucidare la punta di una pipetta di vetro Pasteur su un bruciatore a gas o un bruciatore Bunsen per alcuni secondi per restringere leggermente l'apertura. Lavare la pipetta aspirando FCS per rivestire il puntale. Evitando bolle, dissociare meccanicamente le celle con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco e rivestita in FCS.
6. Centrifugare le celle (per 5 minuti a 4 °C, 340 x g). Rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di terreno di proliferazione e risospendere le cellule utilizzando una pipetta. Ripetere questo passaggio una volta.
7. Preparare una diluizione 1:1 della sospensione cellulare utilizzando una soluzione di Trypan Blue allo 0,4%. Le celle non vitali saranno blu. Contare il numero di cellule vitali (non colorate) utilizzando una camera di Neubauer.
8. Diluire le cellule nel mezzo di proliferazione per ottenere^10-6 cellule/mL. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti (circa 2,5 × 10⁵ cellule/cm²). Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂,
   NOTA: Non utilizzare vetrini coprioggetti, poiché possono muoversi durante l'esperimento e modificare il campo di osservazione. In alternativa, utilizzare piastre di coltura tissutale con fondo in vetro.
   NOTA: Se non si utilizza un multipiatto trattato con colture cellulari, è importante pretrattare le piastre con poli-D-lisina (50 μg/ml) 2 ore a 37 °C. Le piastre trattate con PDL possono essere conservate a 4 °C dopo il lavaggio con acqua distillata.

3. Trasfezione retrovirale-mediata

NOTA: Questo è un metodo semplice per trasfettare solo le cellule progenitrici. Tuttavia, altri vettori virali o trasfezione chimica/elettrica possono essere utilizzati per inserire geni di interesse nelle cellule in coltura.

1. Per manipolare l'espressione genica e marcare le cellule con proteine reporter fluorescenti, aggiungere retrovirus che trasportano plasmidi con geni di interesse 2 ore dopo la placcatura cellulare.
   NOTA: I vettori retrovirali si integrano solo nel genoma delle cellule in divisione. Pertanto, è importante infettare le cellule quando la proliferazione è elevata.
   NOTA: Abbiamo utilizzato un plasmide contenente la sequenza di fusione Beta-actina/CMV (CAG) e un sito di ingresso ribosomiale interno (IRES) seguito dalla sequenza codificante per la proteina fluorescente verde (GFP), designata pCAG-IRES-GFP⁴⁴. I geni di interesse potrebbero essere clonati tra il promotore CAG e la sequenza IRES³⁷.
2. Diluire il retrovirus in terreno di differenziazione per ottenere il numero desiderato di particelle per mL. Aggiungere 500 μl di terreno di differenziazione con retrovirus a ciascun pozzetto.
   NOTA: La quantità di retrovirus utilizzata dipende dal suo titolo e deve essere calcolata per ottenere da 50 a 100 cellule infette per pozzetto. Questo titolo consente l'identificazione di cloni isolati che esprimono GFP, la cui relazione può essere ulteriormente confermata tracciando immagini a contrasto di fase (vedere paragrafo 6). La titolazione del retrovirus deve essere eseguita utilizzando la stessa popolazione cellulare⁴⁵.

4. Video-microscopia time-lapse

NOTA: Questo passaggio richiede un microscopio a fluorescenza invertita con camera di incubazione (vedi Tabella dei materiali).

1. Dopo l'infezione da retrovirus, posizionare la piastra di coltura tissutale in un incubatore collegato ai controller di temperatura e CO₂.
   NOTA: Il preriscaldamento della camera per 3 ore prima di iniziare l'imaging potrebbe aiutare a ridurre al minimo la deriva e la sfocatura durante l'acquisizione.
   NOTA: La camera deve mantenere le celle a condizioni costanti di 37 °C e 5% di CO₂.
2. Selezionare una posizione sull'asse XY che funga da punto zero (XY = 0). Ciò consentirà a un riferimento di ritrovare le posizioni in futuro, ad esempio dopo l'immunocitochimica post-imaging (vedere paragrafo 5).
   NOTA: Si consiglia di tracciare un segno sulla targhetta che possa essere utilizzato come riferimento per determinare il punto zero.
3. Selezionare le posizioni da riprendere con un ingrandimento 10X.
   NOTA: Selezionare 10-15 posizioni per pozzetto per aumentare la probabilità di osservare cellule trasfettate retroviralmente.
   NOTA: Gli obiettivi ad alto ingrandimento a lunga distanza (20X o 40X) possono essere utilizzati per ottenere immagini a risoluzione più elevata. A seconda della distanza di lavoro degli obiettivi, potrebbero essere necessarie piastre con fondo in vetro.
4. Acquisisci immagini a contrasto di fase ogni 5 minuti e immagini a fluorescenza ogni 3 ore per ridurre la fototossicità. Controllare e regolare la messa a fuoco nelle prime 3 ore di esperimento, poiché potrebbe cambiare mentre la temperatura si equilibra. Controllare e regolare la messa a fuoco quotidianamente.
   NOTA: Osserviamo che la messa a fuoco diventa stabile dopo le prime 24 ore. Tuttavia, è consigliabile monitorare la messa a fuoco. In alternativa, utilizzare un sistema di messa a fuoco automatica basato su software.
5. Dopo 7 giorni, interrompere l'acquisizione e procedere con l'immunocitochimica post-imaging (vedere paragrafo 5).
6. Dopo l'immunocitochimica, riposizionare la piastra nell'incubatore del microscopio, trovare il punto zero, reimpostare XYZ = 0 e ricaricare l'esperimento con le posizioni salvate. Acquisisci le immagini a fluorescenza di ogni posizione utilizzando filtri a fluorescenza appropriati.

5. Immunocitochimica post-imaging

1. Dopo 7 giorni di coltura, fissare la coltura cellulare con fissativo Paraformaldeide (PFA) al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Il PFA è tossico e deve essere maneggiato in una cappa chimica.
2. Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.
3. Incubare in anticorpi primari per una notte a 4 °C in tritoni allo 0,5% e al 10% del siero di capra normale in PBS 0,1 M.
   NOTA: Utilizzare l'anticorpo anti-proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2) per confermare il fenotipo neuronale (IgG1 di topo, 1:1.000) e l'anti-GFP per marcare le cellule trasdotte (anticorpo di pollo, 1:500). Altri anticorpi possono essere utilizzati per rilevare le cellule progenitrici o gliali.
4. Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.
5. Diluire gli anticorpi secondari in tritoni allo 0,5% e il 10% di siero di capra normale in PBS 0,1 M e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Diluizione consigliata: 1:1.000.
6. Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.
7. Per la colorazione dei nuclei, incubare le cellule per 5 minuti con 0,1 μg/mL di 4′6′-diammino-2-fenilindone (DAPI) in PBS 0,1 M.
8. Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.
9. Conservare le celle in PBS 0,1 M e proteggerle dalla luce (ad es. avvolgere la piastra con un foglio).

6. Tracciamento delle celle

NOTA: Qui, descriviamo brevemente i passaggi principali per analizzare i dati di video-microscopia time-lapse utilizzando il software The Tracking Tool (tTt), disponibile al link fornito nella Tabella dei materiali.

NOTA: Se l'acquisizione dell'immagine viene eseguita con un altro software, importare i dati dell'immagine con tTt Converter disponibile nell'installer di tTt (link fornito nella Tabella dei Materiali). Sono accettati solo i formati di immagine png, tif o jpg. Segui i passaggi mostrati in Figura 1 A - B dopo aver avviato il convertitore tTt.

1. Avviare il software tTt e scegliere un nome utente. Fare clic sul pulsante "aggiungi utente" e "continua" (Figura 2A). Sfoglia e seleziona "TTTWorkFolder" (Figura 2B). Gli alberi delle derivazioni, le statistiche e le immagini esportate verranno salvati in questa cartella. Quindi, seleziona l'esperimento da analizzare e caricalo (Figura 2B).
2. Se le immagini sono state precedentemente convertite da tTt Converter, fare clic su "LogFileConverter" (Figura 3A) e specificare il numero di secondi tra due punti temporali consecutivi nella finestra di LogFileConverter. Fare clic su "Converti i file di log per l'intero esperimento" (Figura 1C).
3. In un elenco di immagini, che appaiono nella finestra tTt, selezionare le immagini desiderate che caricando manualmente o utilizzando l'opzione visualizzata nel programma. Carica le immagini (Figura 3).
4. Seleziona File > Apri > nuova colonia. Fare clic su "Tracciamento", seguito da "Avvia tracciamento" per avviare il tracciamento in una posizione prescelta.
5. Apparirà una finestra del filmato (Figura 4). Selezionare la cella utilizzando il cerchio di tracciamento e premere il tasto 0. Il software passerà al fotogramma successivo. Continuate a posizionare il cerchio di tracciamento attorno alla cella tracciata utilizzando il mouse e fate clic su 0 in ogni fotogramma per aggiungere un segno di traccia sulla cella.
6. Utilizzare i tasti 1 e 3 per passare rispettivamente al fotogramma precedente o successivo. Per eliminare un contrassegno di traccia, è sufficiente fare clic sulla posizione corretta per contrassegnare e premere 0.
7. Se la cella è divisa, selezionare il pulsante "divisione" (rettangolo rosso a Figura 4). Continuare a tenere traccia di una cella figlia premendo MAIUSC+D. Per tenere traccia della seconda cella figlia, selezionarla nell'editor di celle e premere F2.
8. Se la cellula è morta durante la microscopia video, selezionare "apoptosi" (rettangolo blu a Figura 4).
   NOTA: Sebbene il software etichetti l'evento come "apoptosi", altri meccanismi possono essere responsabili della morte cellulare.
9. Se la cella lascia il campo di osservazione o si mescola con le celle vicine precludendo il tracciamento, selezionare "lost" (rettangolo verde a Figura 4).
10. Per interrompere il tracciamento e continuare in seguito, fare clic su "interrompi" (rettangolo viola a Figura 4).
    NOTA: Nella finestra dell'editor di celle verrà generato un albero durante il tracciamento. Per salvare l'albero di derivazione, selezionare File > Salva > albero corrente (nella finestra Editor celle).
11. Per iniziare a tracciare un'altra cella, fare clic sulla cella con il tasto destro del mouse o selezionare la cella con il tasto sinistro del mouse e fare clic su Tracciamento > Avvia tracciamento.
12. Per esportare il filmato con i dati di tracciamento, il software non deve essere in "modalità di tracciamento". Per disattivare la modalità di tracciamento, eseguire il passaggio 6.10. Nella finestra Filmato selezionare Esporta > filmato. Imposta il formato, l'intervallo di fotogrammi, il numero di fotogrammi al secondo e il bitrate. Fare clic su "Avvia esportazione".

7. Quantificazioni

NOTA: Diverse misurazioni possono essere eseguite utilizzando dati di microscopia video⁴⁶. Qui, descriviamo tre possibilità che sono esemplificate più avanti nella sezione "risultati rappresentativi".

1. Quantifica la sopravvivenza cellulare per ogni linea cellulare dividendo il numero di cellule vive in diversi punti temporali per il numero totale di cellule generate prima che questi punti temporali fossero raggiunti all'interno dei singoli cloni³⁷.
2. Quantificare la proporzione di progenitore simmetrico (SP, entrambe le cellule figlie continuano a proliferare), asimmetrico (A, una cellula figlia continua a proliferare e l'altra diventa postmitotica) o terminale simmetrico (ST, entrambe le cellule figlie diventano postmitotiche)^15,38.
3. Misura la lunghezza del ciclo cellulare calcolando l'intervallo di tempo delle cellule proliferanti tra la loro generazione e la divisione¹⁵.

Le colture primarie di cellule della corteccia cerebrale isolate da embrioni E14 contengono sia cellule progenitrici che neuronali. Durante il periodo di imaging, i progenitori subiscono diversi cicli di divisione cellulare, aumentando il numero di cellule (Figura 5 e Video Figura 1).

La trasfezione retrovirale mediata di alcune cellule progenitrici facilita l'identificazione dei cloni cellulari (Figura 6). Si noti che l'espressione di GFP è rilevabile dopo 24 ore. A questo punto, è possibile identificare le cellule che esprimono GFP in immagini a contrasto di fase e rintracciarle per completare il lignaggio. Le immagini GFP qui incluse non hanno un buon contrasto perché: 1) l'espressione endogena di GFP è stata osservata pochi giorni dopo la trasduzione retrovirale; 2) le immagini sono state scattate utilizzando un obiettivo a lunga distanza 10X attraverso il fondo di plastica di una piastra a 24 pozzetti; e 3) il tempo di esposizione alla fluorescenza è impostato sulla rilevazione minima del segnale GFP senza danneggiare le cellule (fototossicità).

Il tracciamento delle singole cellule progenitrici genera alberi di lignaggio che rivelano informazioni importanti sui loro lignaggi (Figura 7). Sulla base di questi alberi di lignaggio, possiamo valutare la connessione clonale tra cellule differenziate, misurare la lunghezza del ciclo cellulare, valutare la modalità di divisione cellulare in base al comportamento proliferativo delle cellule figlie (Proliferativo simmetrico: entrambe le cellule figlie subiscono un nuovo ciclo di divisione cellulare; Asimmetrico - una cellula figlia subisce un nuovo ciclo di divisione cellulare e l'altra diventa postmitotica; Terminale simmetrico - entrambe le cellule figlie diventano postmitotiche) e quantificano la sopravvivenza cellulare, la velocità cellulare e il tasso di crescita cellulare3,15,37,47.

L'immunocitochimica post-imaging utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale MAP2 e la proteina reporter GFP mostra neuroni differenziati e cellule non neuronali generate da progenitori corticali che sono stati tracciati (Figura 8).

Figura 1. Utilizzo di "tTt Converter" per analizzare le immagini time-lapse acquisite da un altro software. (A) Sfogliare i dati dell'immagine per aggiungerli direttamente nella cartella di input (rettangolo rosso). Attivare l'opzione "Analizza meta-informazioni dai nomi dei file immagine" per diverse posizioni, canali di imaging o indici z (freccia rossa). tTt Converter converte automaticamente le immagini a 16 bit in 8 bit, tuttavia per specificare il punto di bianco e nero per ciascun canale di imaging, è necessario abilitare l'opzione "Imposta 16 bit su punto nero/bianco a 8 bit". Maggiori informazioni su questo passaggio sono disponibili in "Come impostare bp/wp per ogni canale" in basso (freccia rossa). Dopo aver modificato la sezione "Meta informazioni dell'esperimento", sfoglia la cartella di destinazione (rettangolo blu) e fai clic su "Converti x immagini" (rettangolo arancione). (B) Finestra di conversione completata. (C) Definizione dei secondi come intervallo fisso nella finestra "tTt Log File Converter" (freccia rossa) prima di caricare le immagini per il tracciamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Selezione dell'esperimento al tTt. (A) Nella finestra di interrogazione dell'utente, fare clic su "Aggiungi utente" e inserire le iniziali dell'utente, quindi selezionare l'opzione "Continua". (B) Sfogliare la cartella per l'analisi nella sezione "TTTWorkFolder" (rettangolo rosso) e selezionare l'esperimento nella sezione "cartella esperimento" (rettangolo blu). Caricare quindi l'esperimento (freccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Selezione di immagini. (A) Selezionare la posizione da analizzare (rettangolo rosso). Se le immagini sono state convertite clicca su "LogFileConverter" e procedi come mostrato in Figura 1C. (B) Selezionare la parte inferiore "tutte" (rettangolo rosso) e caricare le immagini (rettangolo blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Finestra di tracciamento. (A) Regolare la luminosità e il contrasto utilizzando il pulsante "regola gamma" e selezionare l'opzione "Divisione" (rettangolo rosso), "Apoptosi" (rettangolo blu), "Perso" (rettangolo verde) o "Interrompi" (rettangolo viola) rispettivamente per la divisione cellulare, la morte cellulare, la perdita di cellule o per interrompere il tracciamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Immagini a contrasto di fase ottenute mediante video-microscopia time-lapse in diversi punti temporali. (A-H) Micrografie fotografiche che mostrano immagini a contrasto di fase di una coltura cellulare di corteccia cerebrale primaria a (A) Giorno 0, 04 h 15 min 20 s, (B) Giorno 0, 12 h 20 min 29 s, (C) Giorno 0, 20 h 27 min 09 s, (D) Giorno 1, 04 h 41 min 26 s, (E) Giorno 1, 12 h 45 min 57 s, (F) Giorno 1, 20 h 50 min 33 s, (G) Giorno 2, 04 h 54 min 52 s, e (H) Giorno 2, 12 h 59 min 15 s. Si noti il significativo aumento della densità cellulare nel tempo. Barra della scala: 50 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Espressione di GFP in cellule trasdotte retroviralmente. Immagini a contrasto di fase (A-G) e immagini fluorescenti GFP (A'-G') nello stesso punto temporale. Si noti che l'espressione di GFP è assente durante le prime ore di imaging e inizia ad aumentare nel tempo. (A-A') Giorno 0, 16 h 01 min 05 s, (B-B') Giorno 0, 21 h 49 min 26 s, (C-C') Giorno 1, 06 h 29 min 33 s, (D-D') Giorno 1, 15 h 35 min 00 s, (E-E') Giorno 2, 00 h 40 min 10 s, e (F-F') Giorno 2, 09 h 44 min 28 s. (F'') Alto ingrandimento della scatola tratteggiata in F'. Le frecce gialle (B-F) indicano l'immagine a contrasto di fase di una cellula che esprime GFP (B-F'). Barra di scala: 50 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Linea cellulare di singole cellule progenitrici. (A-C) Immagini a contrasto di fase che mostrano un esempio di divisione cellulare. (A) Arrotondamento delle cellule progenitrici. (B) Costrizione della membrana cellulare. (C) Completamento della mitosi. (D) Esempio di un albero di linea a singola cellula generato nel software tTt. Le frecce colorate indicano diverse modalità di divisione cellulare: Proliferativo simmetrico (freccia gialla); Asimmetrico (freccia blu); Terminale simmetrico (freccia rossa). "X" indica la morte cellulare. I numeri indicano la lunghezza del ciclo cellulare delle cellule progenitrici. Barra di scala: 50 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8. L'immunocitochimica post-imaging identifica le cellule neuronali. Cellule della corteccia cerebrale immunocolorate con anticorpi contro GFP (A) e il marcatore neuronale MAP2 (B). Immagini unite in (C) e ingrandimento maggiore delle immagini unite in (C'). Le frecce gialle indicano le cellule GFP+ che esprimono MAP2. Il tracciamento di queste cellule fino all'inizio dell'esperimento consente l'identificazione dei neuroni fratelli nella coltura. Barre di scala: 100 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato 1. Microscopia video time-lapse di colture cellulari di corteccia cerebrale primaria. Immagini a contrasto di fase acquisite ogni 20 minuti che mostrano il comportamento dettagliato delle cellule in vitro. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Gli autori non hanno nulla a rivelare.