Name: Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara a osservare il comportamento cellulare durante la progressione del lignaggio da cellule staminali neurali a neuroni o cellule gliali utilizzando la video-microscopia time-lapse. Questo metodo consente di studiare la neurogenesi e la gliogenesi in tempo reale.

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Questo lavoro è stato supportato da CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento e Científico Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo un Pesquisa do Rio Grande do Norte).

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi descritti in questo protocollo sono condotti secondo le leggi nazionali e internazionali e sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università locale (CEUA/UFRN), con la licenza 009/2014. Il seguente protocollo viene eseguito in un ambiente sterile. È prevista familiarità con la coltura cellulare di base.
1. Microdissezione del telencefalo dorsolaterale
<ol>
	<li>Preparare il terreno di dissezione (100 mL): 98,5 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL).</li>
	<li>Filtrare-sterilizzare il mezzo di dissezione.</li>
	<li>Rimuovere gli embrioni embrionali del giorno 14 (E14) da un topo gravido C57/Bl6 (Mus musculus) in anestesia con isoflurano. 
	NOTA: Considerare E0 come il giorno del rilevamento del tappo vaginale. La dissezione deve essere completata entro e non oltre 1 ora dalla rimozione dal topo gravido. Questo protocollo si applica anche agli embrioni E11-E17.</li>
	<li>Rimuovere gli embrioni mediante isterectomia in condizioni sterili.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con terreno di dissezione freddo (4 °C).</li>
	<li>Rimuovere il cervello dal cranio tagliando lungo la fessura longitudinale. Il numero di embrioni di solito varia da cinque a dieci. Ogni cervello E14 produce circa 2 x 106 cellule, inclusi progenitori e neuroni postmitotici (rapporto 1:1) 
	NOTA: Utilizzare lo stereomicroscopio per i seguenti passaggi.</li>
	<li>Rimuovere le meningi utilizzando una pinza per dissezione. Dividi il telencefalo a metà per separare gli emisferi. Per isolare il telencefalo dorsolaterale, tagliare lungo la curva dorsomediale e il confine palliale-subpalliale utilizzando una pinza da dissezione. Trasferire il telencefalo dorsolaterale in una provetta da 2 mL con terreno di dissezione freddo (4 °C) fino a quando tutti i cervelli non sono stati sezionati.</li>
</ol>
2. Dissociazione e placcatura cellulare
<ol>
	<li>Preparare il terreno di proliferazione (50 ml di DMEM+10% FCS): 44 ml di terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle's (DMEM), 5 ml di siero fetale di vitello (FCS), 0,5 ml di glucosio al 40%, 0,5 ml di penicillina/streptomicina (10.000 unità/ml e 10.000 μg/ml). Sterilizzare con filtro il mezzo di proliferazione.</li>
	<li>Preparare il terreno di differenziazione (50 mL di DMEM+2% B27): 48 mL di DMEM, 1 mL di B27, 0,5 mL di glucosio al 40%, 0,5 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL). Filtrare-sterilizzare il mezzo di differenziazione.</li>
	<li>Dopo la microdissezione del telencefalo dorsolaterale da topi E14, centrifugare la provetta con il tessuto raccolto e il mezzo di dissezione a freddo (per 5 minuti a 4 °C, 340 x g) per far precipitare il tessuto.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta e aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA (0,05%) preriscaldata (37 °C) per la digestione chimica. Incubare per 15 minuti a 37 °C. Aggiungere 2 mL di terreno di proliferazione per arrestare l'attività della tripsina.</li>
	<li>Lucidare la punta di una pipetta di vetro Pasteur su un bruciatore a gas o un bruciatore Bunsen per alcuni secondi per restringere leggermente l'apertura. Lavare la pipetta aspirando FCS per rivestire il puntale. Evitando bolle, dissociare meccanicamente le celle con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco e rivestita in FCS.</li>
	<li>Centrifugare le celle (per 5 minuti a 4 °C, 340 x g). Rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di terreno di proliferazione e risospendere le cellule utilizzando una pipetta. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
	<li>Preparare una diluizione 1:1 della sospensione cellulare utilizzando una soluzione di Trypan Blue allo 0,4%. Le celle non vitali saranno blu. Contare il numero di cellule vitali (non colorate) utilizzando una camera di Neubauer.</li>
	<li>Diluire le cellule nel mezzo di proliferazione per ottenere10-6 cellule/mL. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti (circa 2,5 × 105 cellule/cm2). Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2, 
	NOTA: Non utilizzare vetrini coprioggetti, poiché possono muoversi durante l'esperimento e modificare il campo di osservazione. In alternativa, utilizzare piastre di coltura tissutale con fondo in vetro. 
	NOTA: Se non si utilizza un multipiatto trattato con colture cellulari, è importante pretrattare le piastre con poli-D-lisina (50 μg/ml) 2 ore a 37 °C. Le piastre trattate con PDL possono essere conservate a 4 °C dopo il lavaggio con acqua distillata.</li>
</ol>
3. Trasfezione retrovirale-mediata
NOTA: Questo è un metodo semplice per trasfettare solo le cellule progenitrici. Tuttavia, altri vettori virali o trasfezione chimica/elettrica possono essere utilizzati per inserire geni di interesse nelle cellule in coltura.
<ol>
	<li>Per manipolare l'espressione genica e marcare le cellule con proteine reporter fluorescenti, aggiungere retrovirus che trasportano plasmidi con geni di interesse 2 ore dopo la placcatura cellulare. 
	NOTA: I vettori retrovirali si integrano solo nel genoma delle cellule in divisione. Pertanto, è importante infettare le cellule quando la proliferazione è elevata. 
	NOTA: Abbiamo utilizzato un plasmide contenente la sequenza di fusione Beta-actina/CMV (CAG) e un sito di ingresso ribosomiale interno (IRES) seguito dalla sequenza codificante per la proteina fluorescente verde (GFP), designata pCAG-IRES-GFP44. I geni di interesse potrebbero essere clonati tra il promotore CAG e la sequenza IRES37.</li>
	<li>Diluire il retrovirus in terreno di differenziazione per ottenere il numero desiderato di particelle per mL. Aggiungere 500 μl di terreno di differenziazione con retrovirus a ciascun pozzetto. 
	NOTA: La quantità di retrovirus utilizzata dipende dal suo titolo e deve essere calcolata per ottenere da 50 a 100 cellule infette per pozzetto. Questo titolo consente l'identificazione di cloni isolati che esprimono GFP, la cui relazione può essere ulteriormente confermata tracciando immagini a contrasto di fase (vedere paragrafo 6). La titolazione del retrovirus deve essere eseguita utilizzando la stessa popolazione cellulare45.</li>
</ol>
4. Video-microscopia time-lapse
NOTA: Questo passaggio richiede un microscopio a fluorescenza invertita con camera di incubazione (vedi Tabella dei materiali).
<ol>
	<li>Dopo l'infezione da retrovirus, posizionare la piastra di coltura tissutale in un incubatore collegato ai controller di temperatura e CO2. 
	NOTA: Il preriscaldamento della camera per 3 ore prima di iniziare l'imaging potrebbe aiutare a ridurre al minimo la deriva e la sfocatura durante l'acquisizione. 
	NOTA: La camera deve mantenere le celle a condizioni costanti di 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Selezionare una posizione sull'asse XY che funga da punto zero (XY = 0). Ciò consentirà a un riferimento di ritrovare le posizioni in futuro, ad esempio dopo l'immunocitochimica post-imaging (vedere paragrafo 5). 
	NOTA: Si consiglia di tracciare un segno sulla targhetta che possa essere utilizzato come riferimento per determinare il punto zero.</li>
	<li>Selezionare le posizioni da riprendere con un ingrandimento 10X. 
	NOTA: Selezionare 10-15 posizioni per pozzetto per aumentare la probabilità di osservare cellule trasfettate retroviralmente. 
	NOTA: Gli obiettivi ad alto ingrandimento a lunga distanza (20X o 40X) possono essere utilizzati per ottenere immagini a risoluzione più elevata. A seconda della distanza di lavoro degli obiettivi, potrebbero essere necessarie piastre con fondo in vetro.</li>
	<li>Acquisisci immagini a contrasto di fase ogni 5 minuti e immagini a fluorescenza ogni 3 ore per ridurre la fototossicità. Controllare e regolare la messa a fuoco nelle prime 3 ore di esperimento, poiché potrebbe cambiare mentre la temperatura si equilibra. Controllare e regolare la messa a fuoco quotidianamente. 
	NOTA: Osserviamo che la messa a fuoco diventa stabile dopo le prime 24 ore. Tuttavia, è consigliabile monitorare la messa a fuoco. In alternativa, utilizzare un sistema di messa a fuoco automatica basato su software.</li>
	<li>Dopo 7 giorni, interrompere l'acquisizione e procedere con l'immunocitochimica post-imaging (vedere paragrafo 5).</li>
	<li>Dopo l'immunocitochimica, riposizionare la piastra nell'incubatore del microscopio, trovare il punto zero, reimpostare XYZ = 0 e ricaricare l'esperimento con le posizioni salvate. Acquisisci le immagini a fluorescenza di ogni posizione utilizzando filtri a fluorescenza appropriati.</li>
</ol>
5. Immunocitochimica post-imaging
<ol>
	<li>Dopo 7 giorni di coltura, fissare la coltura cellulare con fissativo Paraformaldeide (PFA) al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. 
	ATTENZIONE: Il PFA è tossico e deve essere maneggiato in una cappa chimica.</li>
	<li>Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.</li>
	<li>Incubare in anticorpi primari per una notte a 4 °C in tritoni allo 0,5% e al 10% del siero di capra normale in PBS 0,1 M. 
	NOTA: Utilizzare l'anticorpo anti-proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2) per confermare il fenotipo neuronale (IgG1 di topo, 1:1.000) e l'anti-GFP per marcare le cellule trasdotte (anticorpo di pollo, 1:500). Altri anticorpi possono essere utilizzati per rilevare le cellule progenitrici o gliali.</li>
	<li>Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi secondari in tritoni allo 0,5% e il 10% di siero di capra normale in PBS 0,1 M e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Diluizione consigliata: 1:1.000.</li>
	<li>Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.</li>
	<li>Per la colorazione dei nuclei, incubare le cellule per 5 minuti con 0,1 μg/mL di 4′6′-diammino-2-fenilindone (DAPI) in PBS 0,1 M.</li>
	<li>Risciacquare con 0,5 mL di PBS 0,1 M per 5 min. Ripetere 3 volte.</li>
	<li>Conservare le celle in PBS 0,1 M e proteggerle dalla luce (ad es. avvolgere la piastra con un foglio).</li>
</ol>
6. Tracciamento delle celle
NOTA: Qui, descriviamo brevemente i passaggi principali per analizzare i dati di video-microscopia time-lapse utilizzando il software The Tracking Tool (tTt), disponibile al link fornito nella Tabella dei materiali.
NOTA: Se l'acquisizione dell'immagine viene eseguita con un altro software, importare i dati dell'immagine con tTt Converter disponibile nell'installer di tTt (link fornito nella Tabella dei Materiali). Sono accettati solo i formati di immagine png, tif o jpg. Segui i passaggi mostrati in Figura 1 A - B dopo aver avviato il convertitore tTt.
<ol>
	<li>Avviare il software tTt e scegliere un nome utente. Fare clic sul pulsante "aggiungi utente" e "continua" (Figura 2A). Sfoglia e seleziona "TTTWorkFolder" (Figura 2B). Gli alberi delle derivazioni, le statistiche e le immagini esportate verranno salvati in questa cartella. Quindi, seleziona l'esperimento da analizzare e caricalo (Figura 2B).</li>
	<li>Se le immagini sono state precedentemente convertite da tTt Converter, fare clic su "LogFileConverter" (Figura 3A) e specificare il numero di secondi tra due punti temporali consecutivi nella finestra di LogFileConverter. Fare clic su "Converti i file di log per l'intero esperimento" (Figura 1C).</li>
	<li>In un elenco di immagini, che appaiono nella finestra tTt, selezionare le immagini desiderate che caricando manualmente o utilizzando l'opzione visualizzata nel programma. Carica le immagini (Figura 3).</li>
	<li>Seleziona File > Apri > nuova colonia. Fare clic su "Tracciamento", seguito da "Avvia tracciamento" per avviare il tracciamento in una posizione prescelta.</li>
	<li>Apparirà una finestra del filmato (Figura 4). Selezionare la cella utilizzando il cerchio di tracciamento e premere il tasto 0. Il software passerà al fotogramma successivo. Continuate a posizionare il cerchio di tracciamento attorno alla cella tracciata utilizzando il mouse e fate clic su 0 in ogni fotogramma per aggiungere un segno di traccia sulla cella.</li>
	<li>Utilizzare i tasti 1 e 3 per passare rispettivamente al fotogramma precedente o successivo. Per eliminare un contrassegno di traccia, è sufficiente fare clic sulla posizione corretta per contrassegnare e premere 0.</li>
	<li>Se la cella è divisa, selezionare il pulsante "divisione" (rettangolo rosso a Figura 4). Continuare a tenere traccia di una cella figlia premendo MAIUSC+D. Per tenere traccia della seconda cella figlia, selezionarla nell'editor di celle e premere F2.</li>
	<li>Se la cellula è morta durante la microscopia video, selezionare "apoptosi" (rettangolo blu a Figura 4). 
	NOTA: Sebbene il software etichetti l'evento come "apoptosi", altri meccanismi possono essere responsabili della morte cellulare.</li>
	<li>Se la cella lascia il campo di osservazione o si mescola con le celle vicine precludendo il tracciamento, selezionare "lost" (rettangolo verde a Figura 4).</li>
	<li>Per interrompere il tracciamento e continuare in seguito, fare clic su "interrompi" (rettangolo viola a Figura 4). 
	NOTA: Nella finestra dell'editor di celle verrà generato un albero durante il tracciamento. Per salvare l'albero di derivazione, selezionare File > Salva > albero corrente (nella finestra Editor celle).</li>
	<li>Per iniziare a tracciare un'altra cella, fare clic sulla cella con il tasto destro del mouse o selezionare la cella con il tasto sinistro del mouse e fare clic su Tracciamento > Avvia tracciamento.</li>
	<li>Per esportare il filmato con i dati di tracciamento, il software non deve essere in "modalità di tracciamento". Per disattivare la modalità di tracciamento, eseguire il passaggio 6.10. Nella finestra Filmato selezionare Esporta > filmato. Imposta il formato, l'intervallo di fotogrammi, il numero di fotogrammi al secondo e il bitrate. Fare clic su "Avvia esportazione".</li>
</ol>
7. Quantificazioni
NOTA: Diverse misurazioni possono essere eseguite utilizzando dati di microscopia video46. Qui, descriviamo tre possibilità che sono esemplificate più avanti nella sezione "risultati rappresentativi".
<ol>
	<li>Quantifica la sopravvivenza cellulare per ogni linea cellulare dividendo il numero di cellule vive in diversi punti temporali per il numero totale di cellule generate prima che questi punti temporali fossero raggiunti all'interno dei singoli cloni37.</li>
	<li>Quantificare la proporzione di progenitore simmetrico (SP, entrambe le cellule figlie continuano a proliferare), asimmetrico (A, una cellula figlia continua a proliferare e l'altra diventa postmitotica) o terminale simmetrico (ST, entrambe le cellule figlie diventano postmitotiche)15,38.</li>
	<li>Misura la lunghezza del ciclo cellulare calcolando l'intervallo di tempo delle cellule proliferanti tra la loro generazione e la divisione15.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Osservazione in tempo reale delle cellule della corteccia cerebrale primaria permette l'analisi di proliferazione delle cellule, la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare, differenziazione cellulare e cella sopravvivenza3,14,15,37. Ancora più importante, consente lo studio dei lignaggi unicellulare, consentendo l'identificazione delle fasi intermedie promulgata durante la p...

Cellule staminali neurali (NSC) generare neuroni e cellule macroglial durante lo sviluppo della corteccia cerebrale. Al primi-corticogenesis, NSC sottoporsi a diversi cicli di divisione cellulare simmetrica ed espandere il pool di cellule progenitrici. Quindi, NSC dividono asimmetricamente per generare neuroni direttamente o indirettamente attraverso mediatori1. Solo a metà - alla fine-corticogenesis, progenitori passare per generare gli astrociti e oligodendrociti2,3,4. Tuttavia, i completare i meccanismi che controllano la proliferazione delle cellule e differenziazione, come pure il contributo dei progenitori destino-limitato alla generazione di tipi unici di neuroni o cellule macroglial rimangono una questione di intenso dibattito4,5,6. Il potenziale delle singole CSN corticale per generare neuroni, astrociti e oligodendrociti è stato estesamente studiato in vitro e in vivo utilizzando una miriade di tecniche come: live imaging in cella singola culture7,8,9,10,11,12,13; live imaging ad alta densità culture culture3,14,15; live imaging fetta culture16,17,18; analisi clonale utilizzando virale mediata da vettore genetico etichettatura ad alta densità culture14,15,19,20,21; analisi clonale in vivo utilizzando retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; e analisi clonale in vivo usando animali transgenici34.
Ognuna di queste tecniche presenta vantaggi e svantaggi. Per esempio, in vivo lignaggio traccia è suscettibile al lumping e scissione errori3, che porti a conclusioni contrastanti circa il potenziale dei singoli progenitori corticali. Inoltre, sia gli studi in vitro ed in vivo basano sull'etichettatura delle cellule progenitrici a intervalli di tempo iniziale e posteriore analisi delle stirpi delle cellule possono essere influenzata dall'avvenimento inosservato di morte delle cellule durante il lignaggio-progressione35. Di conseguenza, un sistema adatto per analizzare le potenzialità del singolo NSCs dovrà consentire l'identificazione di tutte le cellule generate, così come la caratterizzazione appropriata dei destini di cella all'interno della stirpe. Combinazione di colture cellulari primarie e live imaging fornisce questa impostazione. Utilizzando cella singola cultura e time-lapse video microscopia, Tempio et al hanno dimostrato l'interruttore del lignaggio della corteccia cerebrale individuale progenitori da neurogenesi al gliogenesis11. Più tardi, hanno usato lo stesso sistema per mostrare che i diversi tipi di neuroni sono generati da un unico progenitore corticale12. Tuttavia, questo sistema presenta un importante avvertimento: solo 1% dei progenitori corticali isolati alle prime corticogenesis generare cloni di 4 o più progenie9. Dopo l'aggiunta di FGF2, la frequenza delle cellule generando 4 o più celle aumenta a 8-10%9. Tuttavia, questo numero è troppo piccolo considerando che praticamente tutti i progenitori corticali sono proliferativi in questa fase. Inoltre, i potenziali effetti di FGF2 il destino-specifica non possono essere esclusa36. Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo usato colture ad alta densità cellulari che supportano la proliferazione di entrambi ventricolare (Pax6-esprimendo) e subventricolare (Tbr2-esprimendo) corticale progenitori15. L'osservazione in tempo reale di queste culture ha inoltre dimostrato che diverse caratteristiche della progressione del lignaggio di NSC sono riprodotte in queste condizioni, come la modalità di divisione cellulare, allungamento del ciclo cellulare, il potenziale delle singole cellule per generare neuroni e cellule gliali, tra gli altri3,15. Più recentemente, abbiamo utilizzato questo sistema anche a dimostrare che CREB-segnalazione colpisce la sopravvivenza delle cellule dei neuroni immaturi corteccia cerebrale in topi37. Così, crediamo che Time-lapse video-microscopia della corteccia cerebrale murino primario le cellule coltivate in ad alta densità è uno strumento potente e accessibile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della progressione del ciclo cellulare, la modalità di divisione cellulare, la sopravvivenza delle cellule e cellula destino specifica. Quest'ultima può essere eseguita utilizzando animali transgenici, permettendo l'identificazione di destini cellulari specifiche tempo reale38,39,40 o l'uso di post-imaging immunocytochemistry3,38,41,42.
Qui, forniamo un protocollo passo dopo passo per preparare la corteccia cerebrale primaria coltura cellulare supporto proliferazione delle CSN e la successiva generazione dei neuroni e delle cellule macroglial. Inoltre discutiamo l'uso di transfezione mediata retrovirale per manipolare l'espressione genica delle cellule individuali, che possono essere identificati e monitorata a livello di singola cellula usando la microscopia video time-lapse. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare la corteccia cerebrale primario cellule isolate dall'inizio alla fine del corticogenesis nei roditori, ma qualche aggiustamento può essere richiesto secondo la fase14. NSC isolate da altre fonti può essere studiata anche usando la microscopia video time-lapse di culture 2D, ma il sistema di coltura appropriato dovrebbe essere determinato comparando i comportamenti delle cellule in vitro e in vivo38,43.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale per vitelli (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2, topo</td><td>Sigma</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP pollo</td><td>Aves</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-pollo alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>ETH Zurigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per osservatori cellulari</td> Pipetta <td></td> Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td> PBS The Tracking Tool (tTt) https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html link per il download <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2d cultura dal vivo

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, cellule progenitrici sottoporsi a diversi cicli di divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche per generare nuovi progenitori o neuroni postmitotic. Più tardi, alcuni progenitori passare ad un destino di gliogenic, aggiungendo alle popolazioni astrociti e oligodendrociti. Utilizzo di time-lapse video-microscopia di colture di cellule della corteccia cerebrale primario, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la modalità di divisione cellulare e i parametri del ciclo cellulare delle cellule progenitrici. Allo stesso modo, il destino delle cellule postmitotic può essere esaminato utilizzando proteine reporter fluorescenti cellula-specifico o post-imaging immunocitochimica. Ancora più importante, tutte queste caratteristiche possono essere analizzate a livello di singola cellula, permettendo l'identificazione di progenitori impegnati per la generazione di tipi cellulari specifici. Manipolazione dell'espressione genica può essere eseguita anche mediante transfezione mediata virale, permettendo lo studio dei fenomeni di cella-autonomi e non autonomi delle cellule. Infine, l'utilizzo di proteine fluorescenti di fusione permette lo studio della distribuzione simmetrica e asimmetrica delle proteine selezionate durante la divisione e la correlazione con il destino di cellule figlie. Qui, descriviamo il metodo time-lapse video-microscopia per immagine cellule murine di corteccia cerebrale primaria per diversi giorni e analizzare la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare e destino delle cellule appena generate. Inoltre descriviamo un metodo semplice per transfect cellule progenitrici, che possono essere applicate a manipolare i geni di interesse o semplicemente marcare le cellule con proteine reporter.

Le colture primarie di cellule della corteccia cerebrale isolate da embrioni al giorno E14 contengono sia cellule progenitrici che cellule neuronali. Durante il periodo di acquisizione delle immagini, le cellule progenitrici subiscono diversi cicli di divisione cellulare, aumentando il numero di cellule (Figura 5 e Video Figura 1).
La trasfezione mediata da retrovirus di poche cellu...

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari in tempo reale. Qui, descriviamo un protocollo per time-lapse video-microscopia delle cellule della corteccia cerebrale primario che consente un esame dettagliato delle fasi promulgata durante la progressione di lignaggio da cellule staminali neurali primarie a differenziato neuroni e cellule gliali.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare i comportamenti cellulari durante il progresso della linea cellulare da cellule staminali neurali a neuroni o cellule gliali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo dello sviluppo neurologico, come il ruolo delle divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche, l'allungamento del ciclo cellulare e i tassi di crescita cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'osservazione della linea cellulare per lunghi periodi.Questo permette l'osservazione del passaggio da neurogenesi a genesi gliale all'interno di una singola linea cellulare e un confronto diretto tra progenitori neurali e gliali sublineari. Iniziare rimuovendo i cervelli da 5 a 10 embrioni e14 in una piastra di Petri contenente mezzo di dissezione freddo. Utilizzare pinzette per estrarre con attenzione la pelle e il cranio e isolare i cervelli.Quando si lavora sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette da dissezione per rimuovere le meningi. Successivamente, dividere il telencefalo in senso mediano per separare gli emisferi. Per isolare il telencefalo dorsolaterale, effettuare un taglio lungo la curva dorsomedi

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Neuroscienze

L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Questo video dimostra un protocollo per isolare e coltivare cellule primarie della corteccia cerebrale dal telencefalo dorsolaterale di embrioni di topo.

Isolamento e coltura di cellule da telencefali dorsolaterali embrionali di topo

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Imaging in tempo reale seguito da tracciamento di singole cellule per monitorare la biologia cellulare e la progressione del lignaggio di più popolazioni neurali. J. Vis. Exp. (2017) Il Il video mostra il processo di preparazione, imaging e monitoraggio delle cellule staminali neurali adulte in tempo reale per studiare i comportamenti cellulari, tra cui la divisione e la differenziazione.

 Imaging in tempo reale e tracciamento di singole cellule per monitorare il lignaggio neurale nelle cellule staminali neurali adulte

Fonte: Landeira, B. S.,et al., Imaging dal vivo di cellule primarie della corteccia cerebrale utilizzando un sistema di coltura 2D. J. Vis. Exp. (2017)Il video dimostra l'uso dell'imaging time-lapse per tracciare i progenitori corticali marcati in fluorescenza, monitorare la loro divisione e differenziazione e studiare lo sviluppo del lignaggio nelle cellule primarie della corteccia...

Imaging time-lapse di cellule primarie della corteccia cerebrale di topo trasfettate

Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

È descritto un protocollo robusto per monitorare le popolazioni neurali di time-lapse video-microscopia seguita da basati su software di post-elaborazione. Questo metodo rappresenta un potente strumento per identificare gli eventi biologici in una popolazione selezionata durante esperimenti dal vivo di formazione immagine.

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione simultanea delle thalamocortical assone ramificazione e sinapsi formazione in organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale. Thalamocortical singoli assoni e loro terminali presinaptici sono visualizzati mediante una tecnica di elettroporazione di singola cellula con DsRed e lo synaptophysin GFP-etichettato.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Mostriamo l'automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l'imaging e l'analisi automatizzati.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Impara a osservare il comportamento cellulare durante la progressione del lignaggio da cellule staminali neurali a neuroni o cellule gliali utilizzando la video-microscopia time-lapse. Questo metodo consente di studiare la neurogenesi e la gliogenesi in tempo reale.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

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