Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare i comportamenti cellulari durante la progressione del lignaggio dalle cellule staminali neurali ai neuroni o alle cellule gliali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo dello sviluppo neurologico come il ruolo delle divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche, l'allungamento del ciclo cellulare e i tassi di crescita cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione della linea cellulare per lunghi periodi.

Ciò consente l'osservazione del passaggio dalla neurogenesi alla genesi gliale all'interno di un singolo lignaggio e una comporazione diretta di progenitori neurali e gliali sublineari. Inizia rimuovendo i cervelli da 5 a 10 embrioni e14 in una capsula di Petri con mezzo di dissezione freddo. Usa il forcipe per estrarre con cura la pelle e il cranio e isolare il cervello.

Mentre si lavora sotto lo stereomicroscopio, utilizzare una pinza di dissezione per rimuovere le meningi. Quindi, dividi il telencefalo al centro per separare gli emisferi. Per isolare il telencefalo dorsolaterale, tagliare lungo la curva dorsomediale e il confine del pallio e del subpallio.

Trasferire i telencefali dorsolaterali in una provetta da 2 ml con terreno di dissezione su ghiaccio fino a quando tutti i cervelli non sono stati sezionati. Dopo la microdissezione del telencefalo dorsolaterale, posizionare il tessuto in una provetta conica da 15 ml. Quindi centrifugare la provetta contenente il tessuto raccolto in mezzo di dissezione a freddo per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 340 volte G per far precipitare il tessuto.

Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante con una pipetta e aggiungere 1 ml di 37 gradi Celsius 0,05% di tripsina-EDTA per la digestione chimica. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di terreno di proliferazione per inibire l'attività del Tripsim.

Quindi, lucidare la punta di una pipetta di vetro Pasteur su un bruciatore a gas o un bruciatore bunsen per alcuni secondi per restringere leggermente l'apertura. FCS disperato per rivestire la punta della pipetta. Quindi dissociare meccanicamente le cellule con la pipetta Pasteur lucidata a fuoco e rivestita con FCS pipettando su e giù facendo attenzione a non generare bolle.

Centrifugare le cellule dissociate per cinque minuti a quattro gradi Celsius a 340 volte G.Rimuovere il surnatante con una pipetta, quindi aggiungere un millimetro di mezzo di proliferazione e risospendere le cellule con una pipetta. Rimuovere il PBS dalla piastra pretrattata con Poli-D-Lisina. Quindi disegna un segno sul fondo della piastra che può essere utilizzato come riferimento per determinare il punto zero.

Dopo aver risospeso le cellule nel terreno di proliferazione per la seconda volta, preparare una diluizione uno a uno della sospensione cellulare utilizzando una soluzione di blu di tripano allo 0,4%. Caricare i vetrini della camera di conteggio e contare il numero di cellule vitali non colorate. Le celle non vitali saranno blu.

Diluire le cellule nel mezzo di proliferazione per ottenere da 10 a un sesto di cellule per millimetro. Aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per visualizzare le cellule trasdotte da retrovirus, posizionare la piastra di coltura tissutale in una camera di imaging collegata a controller di temperatura e anidride carbonica per mantenere le cellule a condizioni costanti di 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Selezionare una posizione sull'asse xy che funga da punto zero e calibrare il punto zero. Selezionare da 10 a 15 posizioni per pozzetto da visualizzare con un ingrandimento di 10 volte. Impostare il software in modo che richieda immagini a contrasto di fase ogni cinque minuti e immagini a fluorescenza ogni tre ore per ridurre la fototossicità.

Controllare e regolare la messa a fuoco nelle prime tre ore dell'esperimento in quanto potrebbe cambiare mentre la temperatura si equilibra. Dopo sette giorni, interrompere l'acquisizione e procedere all'immunocitochimica post-imaging. Avvia il software di tracciamento delle celle e scegli un nome utente.

Clicca su scegli il tuo nome utente e continua. Sfoglia e seleziona la cartella di lavoro tTt per salvare gli alberi di derivazione, le statistiche e le immagini esportate. Selezionare quindi l'esperimento da analizzare e caricare.

Se le immagini sono state precedentemente convertite dal convertitore tTt, fare clic su convertitore di file di registro e specificare il numero di secondi tra due punti temporali consecutivi nella finestra del convertitore di file di registro. Fare clic su converti file di registro per l'intero esperimento. Selezionare e caricare le immagini desiderate manualmente o utilizzando l'opzione visualizzata nel programma.

Seleziona il file, apri, nuova colonia. Fare clic su tracciamento, seguito da avvia tracciamento per avviare il tracciamento in una posizione scelta. Apparirà una finestra del filmato.

Seleziona la cella utilizzando il cerchio di tracciamento e premi il tasto zero. Il software passerà al fotogramma successivo. Continuate a posizionare il cerchio di tracciamento attorno alla cella della traccia utilizzando il mouse e fate clic su zero in ogni fotogramma per aggiungere un contrassegno di traccia sulla cella.

Utilizzare i tasti uno e tre per passare al fotogramma precedente o successivo. Per eliminare un contrassegno di traccia, è sufficiente fare clic sulla posizione corretta per contrassegnare e premere zero. Se la cella si è divisa, selezionare il tracciamento, interrompere il motivo, la divisione e continuare a tracciare una cella figlia selezionando una delle celle nella finestra dell'editor di celle, quindi selezionare il tracciamento, avviare il tracciamento.

Per tenere traccia della seconda cella figlia, selezionarla nell'editor di celle e premere F2. Se la cellula è morta durante la videomicroscopia, selezionare l'apoptosi. Se la cella lascia il campo di osservazione o si mescola con le celle vicine precludendo il tracciamento, selezionare perso. Per interrompere il tracciamento e continuare in un secondo momento, fare clic su interrompi.

Nella finestra dell'editor di celle, durante il tracciamento verrà generato un albero. Per salvare l'albero di derivazione, selezionare file, salvare, albero corrente nella finestra dell'editor di celle. Per esportare il filmato con i dati di tracciamento, disattivare la modalità di tracciamento e nella finestra del filmato selezionare Esporta filmato.

Imposta l'intervallo di formato dei fotogrammi, il numero di fotogrammi al secondo e la velocità in bit. Fare clic su avvia esportazione. Le seguenti micrografie fotografiche mostrano il contrasto di fase nelle immagini fluorescenti GFP di una coltura cellulare primaria della corteccia cerebrale.

L'espressione della GFP è assente durante le prime ore di imaging. Il numero di cellule che esprimono GFP aumenta nel tempo e l'intensità della fluorescenza GFP aumenta, come indicato dalla freccia gialla in queste immagini. Questa immagine con ingrandimento più elevato nella regione ristretta dell'immagine precedente mostra in dettaglio le cellule che esprimono GFP.

Queste immagini a contrasto di fase mostrano un esempio di divisione cellulare. Qui si vede l'arrotondamento delle cellule progenitrici, seguito dalla costrizione della membrana cellulare e, infine, dal completamento della mitosi. Questo è un esempio di albero di lignaggio a cella singola.

Le frecce colorate indicano diverse modalità di divisione cellulare, la divisione proliferativa simmetrica è mostrata dalla freccia gialla. La divisione asimmetrica è indicata dalla freccia blu. La divisione terminale simmetrica è indicata dalla freccia rossa e la X indica la morte cellulare.

I numeri indicano la lunghezza del ciclo cellulare delle cellule progenitrici. Questa tecnica può essere eseguita in una o due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mostrare i comportamenti cellulari durante la progressione del lignaggio cellulare per le cellule staminali in neuroni o cellule gliali.