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Articolo metodologico

Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap

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DOI:

10.3791/56077

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3 novembre 2017

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive una tecnica per inserire un cavo condotto tra i ceppi del midollo spinale dopo il transection completo e riempimento con cellule di Schwann (SCs) e matrice di iniettabili della membrana basale al fine di colmare e promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap.

Abstract

Tra i vari modelli per la ferita del midollo spinale nei ratti, il modello di contusione viene utilizzato più spesso perché è il tipo più comune di ferita del midollo spinale umano. Il modello di transection completo, anche se non come clinicamente rilevanti come il modello di contusione, è il metodo più rigoroso per valutare la rigenerazione assonale. Nel modello di contusione, è difficile distinguere rigenerata da assoni germogliati o risparmiati a causa della presenza di rimanere ferita post del tessuto. Nel modello transection completo, un metodo di transizione è necessario colmare la lacuna e creare continuità dalla rostrale ai monconi caudali al fine di valutare l'efficacia dei trattamenti. Una chirurgia ponte affidabile è essenziale per verificare le misure di risultato riducendo la variabilità a causa del metodo chirurgico. I protocolli descritti qui sono utilizzati per preparare Schwann cellule (SCs) e condotti prima del trapianto, transection completo del midollo spinale al livello toracico 8 (T8), inserire il condotto e trapiantare SCs in conduit. Questo approccio viene utilizzato anche in situ gelificante di matrice della membrana dello scantinato iniettabili con trapianto di SC che consente la crescita assonale migliorata attraverso le interfacce rostrale e caudale con il tessuto ospite.

Introduzione

Riparazione di lesioni del midollo spinale è un problema complesso e impegnativo che richiederà una strategia di trattamento combinatorio che coinvolgono, ad esempio, l'uso delle cellule e un biomateriale per fornire un microambiente favorevole per la funzione delle cellule trapiantate e axon rigenerazione al luogo della ferita. Emisezione1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transection....

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Protocollo

femmina ratti Fischer adulti (peso corporeo di 180-200 g) sono alloggiati secondo linee guida NIH e USDA. L'Animal Care istituzionali ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Miami ha approvato tutte le procedure di animali.

1. preparazione pre-trapianto

  1. preparazione Conduit.
    1. Poi tagliato a 5 mm di lunghezza con una lama #10 sotto un microscopio per dissezione.
      Nota: Il diametro interno del condotto è tra 2.4-2.7 mm; il diametro esterno è fra 2.5-2.8 mm.
    2. Piegare il tubo dolcemente lungo il lato longitudinale ( Figura 1A). Tagliare quattro piccole incis....

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Risultati

L'obiettivo dell'utilizzo di questa tecnica chirurgica è quello di valutare l'uso di un tubo strutturato e matrice iniettabili che massimizza la funzione SC dopo trapianto in midolli spinali transected completati. Tre settimane dopo il trapianto, gli animali sono perfusi con paraformaldeide al 4% e le colonne vertebrali sono grossolanamente dissecate e risolto nel fissativo stesso per altre 24 ore. Il midollo spinale viene poi sezionato e i campioni per sezioni sagittali criostato vengono.......

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Discussione

La fase più critica nella creazione di un modello efficace transection è recidere il midollo spinale in uno o due tagli. Un 2-2.5 mm di distanza tra i ceppi rostrale e caudale del midollo spinale dovrebbe essere presente nel sito di transection. (1) le radici dorsali/ventrali non sono stati rimossi correttamente, (2) il dura ventrale non è stato rimosso adeguatamente, e/o (3) l'animale non è stato posizionato correttamente sul rullo posizionato sotto di lei sono i tre motivi più probabili per un tale divario non appare.<.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il vettore virale e animale core nel progetto di Miami alla cura paralisi per produrre la cura degli animali lenti-GFP-virus e fornendo, rispettivamente e l'istologia e Imaging Core per l'uso del criostato, microscopio confocale, e microscopio a fluorescenza con Stereo Investigator. Finanziamento è stato fornito da NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge è il Christine E Lynn distinto professore di neuroscienze.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiale criogenicheThermoFisher Scientific5000-0020
Piastra di Petri da 10 cmVWR25382-428
Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" in protocollo.
Penicillina-streptomicinaThermoFisher Scientific15140-122"Pen/Strep" in protcol.
Siero fetale bovinoHycloneSH300-70-03"FBS" in protocollo.
Estratto ipofisarioBiomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
HeregulinR& D Systems396-HB/CF
Poly L-lisinaSigma-AldrichP2636"PLL" in protocollo.
Medium Eagle's modificato di DulbeccoThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" in protocollo.
Soluzione salina bilanciata di HankThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" in protocollo.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
Femmina di ratto Fischer (160-180g)Envigo
Vannas forbice, drittoFST15018-10
KetaminaVedco Inc5098976106100 mg/ml
XilazinaLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamicinaAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02Può essere qualsiasi marca di scelta.
Micro SpatolaFST10089-11Può essere di qualsiasi marca di scelta.
Forbici curve con estremità smussataFST14017-18Può essere di qualsiasi marca di scelta.
Pinze smussateFST11006-12Può essere di qualsiasi marca a scelta.
rongeurFST16121-14Può essere qualsiasi marca di scelta.
Forbici a molla angolateFST15006-09Può essere di qualsiasi marca a scelta.
Triangoli di assorbimentoFST18105-03Può essere di qualsiasi marca di scelta.
GelfoamHenry Schein9083300"Schiuma compressa" in protocollo.
#10 lameSklar06-3010Può essere qualsiasi marca di scelta.
MatrigelCorning354234"Matrice iniettabile" nel protocollo.
Anticorpo della proteina fluorescente anti-verde di polloMilliporeAB16901
Anticorpo dell'ibridoma RT97 di topoDSHBRT97
Anticorpo anti-neurofilamento di coniglioEncor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
Anticorpo policlonale della proteina acida fibrillare gliale di coniglioDakoZ033401
Alexa Fluor 488 capra anti-pollo IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 capra anti-coniglio IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 capra anti-topo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
Microscopia confocaleNikonclsi

Riferimenti

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y.

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Ristampe e permessi

Tag

Transezione del midollo spinaletrapianto di cellule di Schwannimpianto di condottomodello di transezione completaprocedura di laminectomiagel a matrice iniettabilecellule di Schwann GFPcondotto in PVDF-TrFEimaging a fluorescenza confocale