Meten van In Vivo veranderingen in extracellulaire Neurotransmitters tijdens natuurlijk belonen van gedrag in vrouwelijke Syrische Hamsters

Summary

Deze paper gegevens het gebruik van vaste-potentieel amperometrische opnamen met behulp van koolstofvezel elektroden en de enzymatische biosensor technologie voor het meten van de vrijlating van dopamine en glutamaat met hoge temporele resolutie tijdens natuurlijke lonende gedrag in de vrouwelijke hamster.

Abstract

De mogelijkheid voor het meten van de neurotransmitter release op een snelle tijdschaal kunt patronen van transmissie moet worden gekoppeld aan specifieke gedrag of manipulaties; een krachtig instrument in het ophelderen van de onderliggende mechanismen en circuits. Terwijl de techniek van microdialysis al tientallen jaren gebruikt is voor het meten van vrijwel elke analyt van belang in de hersenen, wordt deze techniek beperkt in temporele resolutie. U kunt ook is snel aftasten cyclische voltammetrie zowel stoffelijk nauwkeurig en uiterst gevoelig; echter, omdat deze technisch moeilijke methode op de electroactivity van de analyt van belang berust, de mogelijkheid om nonelectroactive stoffen (b.v., de neurotransmitter glutamaat) te sporen wordt geëlimineerd. Dit document een overzicht van het gebruik van een turn-key systeem dat vaste-potentieel amperometry en enzymatische biosensing voor het meten van zowel electroactive als nonelectroactive neurotransmitters met temporele precisie combineert. De koppeling van deze twee krachtige technieken zorgt voor het meten van zowel tonic en phasic transmissie met relatief gemak, en vergunningen gelijktijdig opnemen van meerdere neurotransmitters. Het doel van dit manuscript is om aan te tonen het proces voor het meten van dopamine en glutamaat transmissie in vivo een natuurlijk belonen gedrag (dat wil zeggen, seksueel gedrag) gebruiken in vrouwelijke hamsters, met het uiteindelijke doel van het weergeven van de technische haalbaarheid van deze bepaling voor de behandeling van andere gedragingen en experimentele paradigma's.

Introduction

De mogelijkheid voor het meten van de neurotransmitter release in wakker gedragend dieren kunt onderzoekers koppelen van specifieke gedragingen met ruimtelijke en temporele patronen van transmissie-een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken mechanismen en circuits onderliggende beide natuurlijke en operante gedrag in real-time. Historisch gezien is microdialysis werkzaam zijn voor het meten van zowel elektrisch reactieve en nonreactive stoffen in de extracellulaire omgeving van de hersenen-¹. Deze techniek maakt gebruik van een continue stroom van een waterige oplossing van soortgelijke Ionische samenstelling van de extracellulaire vloeistof, door middel van een microdialysis-sonde bestaat uit een kleine schacht met een topje gemaakt van een semipermeable holle vezel membraan². Na het inbrengen van de sonde, neurotransmitters of andere analyten van belang kunnen kruisen de semipermeable membraan door passieve diffusie voordat de tussenpozen voor latere analyse wordt verzameld door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC), een analytische chemie techniek vaak gebruikt om te scheiden, identificeren en kwantificeren van de componenten in een heterogene mengsel³.

Hoewel microdialysis een gevoelige techniek die kan worden gebruikt is voor het meten van vrijwel elke analyt van belang, is de temporele resolutie laag, met maximale samplingfrequenties volgorde van minuten tot tientallen minuten^1,2. De uitvinding van de snelle scan cyclische voltammetrie (FSCV), een techniek die op het redoxpotentiaal van electroactive soorten berust, kan toelichten in de buurt van de momentane concentraties van de analyt van belang in de extracellulaire vloeistof. In het kort (Zie Robinson et al. ⁴ voor een uitgebreide review), een elektrode wordt toegepast om te verhogen en verlagen de spanning in een driehoekige golf mode op een snelle tijd schaal⁴. Wanneer de spanning in het juiste bereik, is de verbinding van belang herhaaldelijk geoxideerd en verminderd. Deze oxidatie en reductie resulteert in een beweging van elektronen waarmee een kleine wisselstroom. Scan tarieven plaatsvinden op de schaal van de sub tweede met oxidatie en reductie van verbindingen die zich voordoen in microseconden. Door af te trekken van de huidige achtergrond gemaakt door de sonde van de resulterende huidige, kan men een spanning vs. huidige perceel uniek is voor elke stof produceren. Aangezien de tijdschaal van de spanning-oscillaties bekend is, kunnen deze gegevens worden gebruikt om een complot van de huidige berekenen als functie van de tijd. De relatieve concentraties van de stof kunnen dus worden vastgesteld zolang het aantal elektronen in elk oxidatie overgebracht en reductie reactie is bekend⁴.

Deze chemische specificiteit en hoge temporele resolutie maken FSCV een krachtige techniek voor het opsporen van veranderende chemische concentraties in vivo. Echter, ondanks deze vele voordelen, deze techniek vereist uitgebreide technische expertise en dure apparatuur en installatie. Verder kunnen niet nonelectroactive neurotransmitters (bijvoorbeeld, glutamaat) worden gemeten met behulp van deze techniek. Gelukkig, technologische ontwikkelingen op het gebied van de elektrochemie⁵, evenals de commercialisering van deze uitvindingen, heeft een relatief eenvoudige benadering voor het meten van niet-electroactive neurotransmitters in wakker gedragend dieren zonder afbreuk te doen aan temporele precisie-een techniek die bekend staat als de enzymatische biosensor technologie. Deze techniek maakt gebruik van enzymatische omzetting van de neurotransmitter van het nonelectroactive van belang in twee substraten, waarvan er één is electroactive waterstofperoxide die wordt herkend als een amperometrische oxidatie huidige gegenereerd door een toegepaste potentieel⁵ . Verkrijgbare biosensor sondes meten (Zie Figuur 1) selectief analyten van belang door het concurrerend het verminderen van de bijdrage van endogene interferents. In het geval van glutamaat, is de bijdrage van de gemeenschappelijke interferent ascorbinezuur (AA) concurrerend teruggebracht tot de gemeten huidige door mede lokaliseren AA oxidase actieve enzymatische oppervlak van de sensor, AA omzetten in niet-electroactive dihydroascorbate en water. Daarnaast sluit een negatief geladen Nafion polymeer laag aanwezig onder de laag van het enzym endogene anionogene stoffen.

Deze dezelfde biosensor experimentele opstelling kan meten electroactive neurotransmitters zoals in FSCV, maar in plaats daarvan het maakt gebruik van een vaste-potentieel opname-⁶. In tegenstelling tot de oscillerende spanning toegepast in FSCV, in een vaste-potentieel opname wordt de spanning gehouden op de redox potentiële voor de analyt van belang. Hoewel er minder chemisch selectieve dan FSCV zoals meerdere neurotransmitters wellicht de potentiële, dezelfde redox in hersengebieden die overweldigend scheef naar een neurotransmitter, de turn-key aard van deze aanpak opweegt tegen het gebrek aan chemische specificiteit.

De mogelijkheid voor het meten van zowel electroactive als nonelectroactive neurotransmitter release in in de buurt van real-time en koppelen aan specifieke gedrags gebeurtenissen biedt de mogelijkheid te onderzoeken van convergerende neurotransmitter release. Dit manuscript gegevens het gebruik van dit systeem om te ondervragen van zowel glutamaat als dopamine transmissie in reactie op natuurlijke beloning in wakker gedragend hamsters. Het doel van deze paper is voor detail van het proces voor het meten van deze release neurotransmitter tijdens seksueel gedrag in vrouwelijke hamsters, met het doel van het aantonen van de haalbaarheid ervan voor de behandeling van andere gedragingen en experimentele paradigma's.

Hamsters zijn een ideaal model voor gebruik in elektrochemische opnames
Historisch, zijn rat en muizen modellen tewerkgesteld in de studie van seksueel gedrag. Deze knaagdiersoort deelnemen aan een dynamische copulatory reeks, waarbij talrijke vrouwelijke solicitation gedragingen die zijn hoppen, onstuimig en oor wiggling om te verleiden de man om te jagen en uiteindelijk het monteren van de vrouwelijke⁷. De montage door het mannetje (met of zonder vaginale penetratie) duurt slechts een paar seconden, waarin het vrouwtje houdt zich bezig met haar seksueel gedrag houding (zogenaamde lordose) ook alleen voor een paar seconden voordat het hervatten van actieve solicitation gedrag. Dit patroon van gedrag, samengesteld van hoge niveaus van activiteit afgewisseld met korte periodes van immobiliteit, is problematisch voor het meten van de transmissie in het gedrag van dieren. Ten eerste kan er bewegingsartefacten in de amperometrische opnames die geen verband met neurale activiteit houden. Ten tweede, de motoriek wordt geassocieerd met de release van bepaalde neurotransmitters in bepaalde hersengebieden. Bijvoorbeeld, heeft dopamine release zijn gekoppeld aan de motorische activiteit in de dorsale en ventrale striatum^8,9, een bevinding dat vormde de basis voor microdialysis metingen van dopamine na psychostimulantia administratie¹⁰. Omdat het gedrag van de vrouw-typische verzoek in Mndt knaagdieren betrekken van hoge niveaus van motorische activiteit, en worden vertegenwoordigd door het grootste deel van een 10 minuten seksueel gedrag test, dit maakt het moeilijk om veranderingen in transmissie toeschrijven aan de expliciete componenten van seksueel gedrag dat collectief slechts duren minuten.

Om de neurochemical Profiel van vrouwelijke seksuele gedrag te analyseren, deze lab zocht een soort waarin er is minimale motorische activiteit begeleidende seksueel gedrag. De volgorde van de copulatory in Syrische hamsters (Mesocricetus auratus) is ideaal voor neurochemical opnames als gevolg van het gebrek aan solicitation gedrag meestal gezien bij ratten en muizen¹¹. Dientengevolge, zal vrouwelijke hamsters invoeren en handhaven van de houding van de lordose voor meer dan 9 minuten uit een 10 minuten test sessie¹². Met het ontbreken van vreemde motorische bewegingen door de vrouwelijke, in vivo kunnen elektrochemische opnamen dat geassocieerd met componenten van seksuele interacties met de man worden kunnen worden verkregen.

Copulatory bouts in hamsters
Na de invoering van een mannelijke stimulans dier in de test kamer, zal het mannetje aanvankelijk deelnemen aan anogenital onderzoek (AI) van het vrouwtje vóór montage vanhaar (Figuur 2). Om de man te monteren, moet het vrouwtje een receptieve seksuele houding bekend als lordose, waarin ze bogen op haar rug en haar staart afbuigt, zodat de montage man penile toegang tot haar vagina krijgen kan nemen. Het mannetje zal het vrouwtje, omklemde haar achtervoeten met beide poten (Figuur 2,B), mount en beginnen stak in een poging om penile intromission (Figuur 2C). Het mannetje zal het vrouwtje (zonder invoegpositie) mount evenals intromit een aantal keren alvorens uiteindelijk te bereiken ejaculatie. Deze opeenvolging van monturen en intromissions leidt tot ejaculatie is een "copulatory bout" genoemd. Mannetjes zullen hebben verschillende copulatory bouts binnen een enkele sessie.

Protocol

alle procedures die hier beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Minnesota en zijn in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren ¹³ .

1. dieren en chirurgie van de Cannulation

1. verkrijgen Syrische hamsters van een gemeenschappelijke dierlijke leverancier op de leeftijd van ongeveer 55 dagen.
   Opmerking: Hoewel de leeftijd van de dieren, wegens de beperkingen qua verschillende experimentele paradigma variëren zal, voor seksueel gedrag is het belangrijk om seksueel volwassen dieren die allemaal ongeveer dezelfde leeftijd.
2. Huisdieren in een gecontroleerde temperatuur (22 ° C) en verlichting (14u lichte gevolgd door 10 h donker met lights out op 13:00 uur) omgeving, met voedsel en water beschikbaar ad libitum behalve tijdens perioden van experimentele testen.
   Opmerking: Aangezien hamsters seizoeninvloeden reproduceren, deze 14:10 licht/donker cyclus bootst de voorwaarden van hun natuurlijke fok.
3. Na een 1-weekse acclimatisering naar het laboratorium, aseptische bilaterale ovariectomies en intracraniële stereotaxic cannulations onder narcose (b.v., pentobarbital) uitvoeren en beheren passend institutioneel-goedgekeurd post-operatieve analgetische en antibiotische behandeling zoals eerder beschreven ^{14 , 15}.
   Opmerking: Voor de studie van seksueel gedrag, ovariectomies zijn noodzakelijk voor het verwijderen van de endogene hoofdbron van seksuele hormonen, zodat de dieren gelijkmatig aan seksuele ontvankelijkheid met exogene hormoon overeenkomstig de experimentele tijdlijn kunnen worden opgewekt.
   1. Voor zowel de Dopaminerge en de glutamaterge sonde implantatie, implant stereotaxically gids canules (0.7 mm doorsnede; Figuur 3) op het gebied van belang (b.v. dit lab gericht de juiste nucleus accumbens (NAc)) zoals beschreven in de stapsgewijze detail elders ¹⁵.
      Opmerking: Hoewel de gepresenteerde gegevens uit interne sensor-opnamen van een glutamaat of dopamine sonde per dier, dit systeem zorgt voor de gelijktijdige opname van maximaal 4 sensoren in een enkel dier; dus kon 1-4 canules worden geïmplanteerd afhankelijk van gewenste proefopzet en resultaten.
      1. Bepalen de implantaat coördinaten van de regio van belang met behulp van een stereotaxic atlas (b.v., The Golden Hamster Brain door Morin & hout), houden in het achterhoofd dat de sensor 1 mm onder de canule in hersenweefsel breidt.
   2. Na een canule is stereotaxically verlaagd naar de gewenste locatie van de dorsale-ventrale, brengt het op de schedel met behulp van een GLB opgebouwd uit tandheelkundige acryl, beveiligd met roestvrij stalen botschroeven en een plastic kop monteren ( Figuur 3 ; Zie ¹⁵ voor meer details).
   3. Voor koolstofvezel testen, invoegen een referentie-elektrode (350 μm diameter, totale lengte 7,5 mm) het contralaterale halfrond.
      Opmerking: Een specifieke locatie of de afstand van de canule is niet vereist; referentie-elektroden kunnen overal worden geplaatst in het contralaterale halfrond dat uitkomt.

2. Biosensor en Carbon Fiber testen

1. na 1-week van het herstel van de operatie, beheren het hormoon priming regime te induceren seksuele ontvankelijkheid.
   1. 10 µg estradiol benzoaat in 0,1 mL van katoenzaad olie subcutaan injecteren (SC), ongeveer 48 uur en 24 uur vóór het seksuele gedrag testen, om seksuele ontvankelijkheid naar de mannelijke ¹¹.
   2. Injecteren 500 µg progesteron in 0,1 mL van katoenzaad olie, s.c., 4 uur vóór de invoering van de man voor het opwekken van seksuele ontvankelijkheid ¹¹.
2. Testen van alle dieren aan het begin van de donkere fase van hun dagelijkse cyclus, zoals sociale gedrag van knaagdieren zijn vrijblijvend onder wit licht en rood licht testen voorwaarden ^{16 , 17 , 18}.
3. voor de enzymatische biosensor glutamaat testen, kalibreren de sensoren in vitro ( Figuur 4) vóór gebruik zoals eerder beschreven ^{15 , 19}.
   1. maken de kalibratie-oplossingen die op de dag van het testen in 20 mL glas verse Centrifugeer buizen. Voor de oplossing van de analyt, los 7,4 mg L-glutaminezuur in 10 mL Ultra zuivere H ₂ O door zachtjes het omkeren van de buis. Maak de interferent oplossing door het oplossen van 176.1 mg AA 10 ml Ultra zuivere H ₂ O.
   2. Instellen voor het kalibreren door het plaatsen van een magneetroerder op basis van een fundamentele lab ring staan. Plaats een 20-mL dubbelwandige bekerglas bovenop de magneetroerder, en klem in plaats met behulp van een middelgrote 2-prong klem.
      1. Toevoegen een magnetische roer bar en 20 mL 100 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in het bekerglas van dubbelwandige. Het dubbelwandige bekerglas verbinden met een circulerende waterbad voor het opwarmen van de bufferoplossing tot 37 ° C.
         Opmerking: De enzymatische biosensor kalibraties moeten worden uitgevoerd op lichaamstemperatuur omdat enzymatische activiteit wordt beïnvloed door de temperatuur.
   3. Plaats van de sensor kalibratie houder op de top van het dubbelwandige bekerglas en stel een kalibratie van de 4-kanaals voorversterker bovenop, beveiligen in plaats met behulp van een rechte hoek-klem. De voorversterker verbinden met een airconditioning en acquisitie apparaat naar record ijkgegevens.
   4. Test de gevoeligheid van elke enzymatische biosensor glutamaat (of andere analyten van belang voor andere verkrijgbare biosensor sondes bijvoorbeeld glucose) voordat de experimentele opname door het plaatsen van de sonde in de kalibratie-houder bovenop een dubbelwandige bekerglas, inlaten van de holte sensing en een gedeelte van de verwijzing van zilverchloride (AgCl) draad in de bufferoplossing.
      1. Starten voordat u verbinding maakt elke sensor (maximaal 4) wordt getest op een poort van een kalibratie van de 4-kanaals voorversterker, een nieuwe opname op de computerinterface met behulp van gratis downloadbare acquisitie software. Kunnen de sensoren te bereiken van een stabiele basislijn.
   5. Beginnen de analyt injecties toe te voegen wanneer de sensoren een stabiele basislijn hebt bereikt. Gebruik het gat in de kalibratie houder om een pipet tip kennismaken met de bufferoplossing. Annoteren wanneer een injectie wordt gemaakt op met behulp van het gereedschap snel belangrijke aantekening in de opname-software.
      1. Maken 10 µM toevoegingen van glutamaat door pipetting 40 μL van de oplossing van de analyt in de bufferoplossing. Wachten op de sensor te stabiliseren tussen toevoegingen. 3 injecties van de oplossing van de analyt toevoegen voordat het toevoegen van een enkele injectie van interferent AA oplossing (50 μl geïnjecteerde volume voor 250 μM verandering in concentratie).
         Opmerking: De kalibratie zorgt voor de omzetting van de veranderingen in het signaal van de amperometrische (gezien tijdens de enzymatische experimentele opname in stap 2.12) aan veranderingen in de concentratie van glutamaat, indien gewenst. Zie referentie ¹⁵ voor stapsgewijze instructies. De Dopaminerge sondes gebruikt door dit lab zijn gekalibreerd tijdens het productieproces door de commerciële aanbieder. Glutamaat sondes moeten worden gekalibreerd op het ogenblik van gebruik, zoals hun gevoeligheid na verloop van tijd afnemen kan als de enzymatische bestanddelen ^{19 degraderen}. Omdat koolstofvezel elektroden geen afbraak ondergaan, is de kalibratie uitgevoerd door de onderneming vóór de verzending voldoende langs als tHier is een verhoogde kans op beschadiging van de dunne koolstofvezel (350 μm diameter) door extra behandeling.
4. De testkamer line bij instrooien genomen uit het dier ' s kooi.
   Opmerking: Dit verhoogt het vrouwtje ' s vertrouwdheid met het testen kamer, evenals de man naar seksueel stimuleren olfactorische paring signalen die werden verspreid door het vrouwtje in reactie op de behandeling van estradiol blootstelt.
5. Licht anesthetize de dieren vóór het inbrengen van de sonde door Isofluraan of een andere vluchtige verdoving in de zaal van een inductie.
6. De occlusieve obdurator uit de gids canule verwijderen en plaats de koolstofvezel elektrode of enzymatische sonde via de gids schacht.
7. Na het inbrengen van de sonde, plaats het dier in de test kamer.
   Opmerking: Deze afwerkcentrale gebruikt een 10-gal glas aquarium (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), maar ronde kamers van gelijk oppervlak mag ook tewerkgesteld.
8. Begin het signaal voor video- en tijd-locked amperometrische opnemen in een programma van de commercieel beschikbare software, beschreven in detail elders ¹⁵.
9. De sensor aansluiten op het opnamesysteem: de potentiostaat via een elektrisch afgeschermde kabel en een elektrische swivel. Het stabiliseren van de sensor-verbinding door de schroeven van de bijlage van een pin op de hoofd mount. Versterken van de verbinding met behulp van lab film zonodig.
   Opmerking: Een aangepaste verbindingslijn is nodig om zowel de koolstofvezel elektrode en de referentie-elektrode koppelen aan de potentiostaat, terwijl de enzymatische glutamaat sensoren kunnen rechtstreeks worden aangesloten op de potentiostaat.
10. Toestaan de sensor equilibreer in de hersenen voor experimentele testen.
    Opmerking: Evenwichtsinstelling keer verschillen afhankelijk van de opname-sensor (bijvoorbeeld enzymatische sensoren vereist 2-4 h evenwichtsinstelling, terwijl carbon fiber elektroden alleen ongeveer 30 min vereisen). Als beide soorten sensoren zijn ingeplant, equilibreer gedurende de enzymatische sensor langer.
11. Na evenwichtsinstelling van de sensor, een stimulans mannetje te introduceren in de test kamer.
12. Na de eerste zware montering met penile plaatsingskosten (genoemd intromission) door de stimulus mannetje, doorgaan met opnemen voor een extra 10-30 min, afhankelijk van de experimentele doelen.
13. Grond van het testen van de gedragsmatige, verbreken het vrouwtje ' s sensor.
14. Verwijder beide hamsters uit de testen kamer. Verwijder van het beddengoed en reinig de zaal met 70% ethanol.
    Opmerking: Als gevolg van de korte evenwichtsinstelling vereist voor koolstofvezel opnamen, stappen 2.3-2.14 kunnen herhaald worden voor het testen van verschillende dieren in dezelfde dag. In tegenstelling, omdat de enzymatische sensoren ongeveer 4 uur van evenwichtsinstelling vereist, test slechts één dier per dag te beperken mogelijke Inter onderworpen variatie als gevolg van verschillen in de dieren ' circadiane tijdstip testen.

3. Offer en perfusie

1. diep de vrouwelijke proefpersoon met een euthanizing agent na de sluiting van de testperiode, anesthetize (b.v. dit lab maakt gebruik van een intraperitoneale injectie van 0,2 mL fenytoïne en pentobarbital oplossing) .
2. Transcardially perfuse het dier met 25 mM PBS, pH 7,6, verwijderen van alle circulerende bloed, gevolgd door een 20 min fixatie met 4% paraformaldehyde-PBS.
3. Verwijderen de hersenen en postfix in ~ 30 mL van de oplossing van de 4% paraformaldehyde in een 50 mL conische buis 's nachts.
   1. Winkel de hersenen in een 10% sucrose-PBS oplossing totdat u naar seriële sectie.
      Opmerking: Hersenen kunnen worden opgeslagen op tot 2-weken, met per sacharose oplossing wijzigingen aan om de potentiële groei van contaminanten.
4. Seriële sectie de hersenen in 40 µm segmenten door de geïmplanteerde regio met ofwel een bevriezing microtoom of cryostaat zoals eerder beschreven ¹⁹.
5. Mount segmenten serieel op verkrijgbare lijm beklede dia's (of Zie ²⁰ te maken). Laten drogen, op zijn minst overnachting.
6. Vlek van de dia's met cresyl violet kleurstof, duidelijk, en dekglaasje aan zoals eerder beschreven ²⁰.
7. Beeld van de dia's met behulp van lichte veld microscopie te bevestigen de anatomische plaatsing van de sensor.

4. Gedrags codering

1. weergave en aantekeningen van de video's met behulp van gratis commercieel downloadbare software (Zie Tabel van materialen) in slowmotion om juist code gedrag tijd vergrendeld op het signaal amperometrische.
   Opmerking: Gebruik de MATLAB-code in de analyse (zie hieronder ), aantekeningen toevoegen aan het begin en einde van elk van de vrouwelijke ' s en mannelijke ' s gedrag.
   1. Aantekening startLordosis in het frame wanneer het vrouwtje een dorsoflexion van haar terug initieert en gebreken van haar staart naar boven. EndLordosis van aantekeningen voorzien wanneer het vrouwtje deze houding, die vaak optreedt beëindigt wanneer het vrouwtje naar een andere locatie in de test kamer formaat.
   2. StartAI van aantekeningen voorzien wanneer het vrouwtje in de lordose houding en de man zijn snuit naar het vrouwtje beweegt ' s anogenital regio, waar snuiven, likken of nuzzling van haar perineale regio kan optreden. EndAI van aantekeningen voorzien wanneer het mannetje zijn snuit uit dicht bij het vrouwtje verwijdert ' s anogenital regio.
   3. StartMount van aantekeningen voorzien wanneer het mannetje nadert en zijn forepaws op het vrouwtje in een montage houding, ongeacht de richting van de poging van de berg (b.v., side, achterwerk plaatst).
   4. StartIntromission van aantekeningen voorzien als succesvolle stak de gemonteerde mannelijke penile toegang tot het vrouwtje krijgt ' s vagina.
      Opmerking: Een intromission is behavioristisch te onderscheiden is van de gemonteerde stak dat vóór intromission, optreedt zoals het mannetje zichtbaar zijn bovenste ledematen naar zijn lichaam trekt, zijn bekken naar voren opdringt, en zijn staart omhoog krullen, met vermelding van penetratie (Zie < sterke class = "xfig" > figuur 4 C).
      1. ITE, annoteren ejaculatie.
         Opmerking: Aan het einde van een paring bout en in combinatie met een succesvolle intromission, zal het mannetje ejaculeren. Hoewel een niet in staat om te visualiseren van de werkelijke uitstoot is, mannelijke hamsters hebben een karakteristiek beweging met hun achterste voet betreden tijdens een intromission ²¹, dus de ejaculatie op het vóórkomen van de beweging van de voet van aantekeningen voorzien.
   5. EndIntromission en endMount tegelijkertijd in het kader van aantekeningen voorzien wanneer het mannetje zijn voorste twee poten heeft verwijderd en dus geen contact met het vrouwtje heeft. Als gevolg van het frequente onvermogen om te visualiseren code zijn terugtrekking, gelijktijdig deze twee gedragingen te zorgen voor consistentie en betrouwbaarheid over paring bouts.
      Opmerking: Een paring bout een succesvolle ejaculatie volgt ofwel dat wanneer het vrouwtje breekt de houding van de lordose na ten minste één mount.

5. In het volgende voorbeeld Data-analyse

Opmerking: het gebruik van vaste-potentieel van koolstofvezel en enzymatische opnames voor dopamine eenND glutamaat, respectievelijk, voorziet in de mogelijkheid om zowel tonic en phasic patronen van elektrochemische release te meten. Deze afwerkcentrale gebruikt een vrije, commerciële acquisitie-systeem en software om te registreren en omzetten geregistreerd signalen van analoog naar digitaal (vertekening 0.600 V, sampling-frequentie = 1 Hz).

1. Beschrijving van Gegevensprotocol analyse voorbeeld
   1. Hoewel andere programma's kunnen worden gebruikt, kwantificeren de tonic en phasic (voorbijgaande) wijzigingen in het opgenomen elektrochemische signaal gebruik van MATLAB.
      1. Voor de gepresenteerde gegevens, berekenen het signaal van de tonic met behulp van een 50-punt bewegende gemiddelde filter. Een alleen-voorbijgaande genormaliseerde vertegenwoordiging van het signaal werd berekend door aftrekken van het signaal van de tonic van de ruwe gegevens. Bij het identificeren van phasic pieken, er zijn verschillende algoritmische opties (b.v. labeling pieken als wijzigingen in het signaal meer dan 1 SD boven het gemiddelde).
      2. Waarin de locaties en deze pieken, dat wil zeggen, lokale maxima, van de genormaliseerde signaal met behulp van de functie van MATLAB peakfinder met de minimale maximale amplitude ingesteld op het kwadratische gemiddelde van het signaal. De locatie van de pieken van de genormaliseerde signaal gevonden werd gebruikt om de amplitude uittreksel uit elke piek. De mogelijkheid om te detecteren pieken maakt de identificatie van een tijd-locked gedragingen die kunnen worden samenvalt met, of rijden de relatieve piek in de neurochemical onderzochte.
   2. Segment de verwerkte gegevens overeenkomstig de gedrags aantekeningen (zie stap 3), een Student ' s t-test werd gebruikt voor het evalueren van de verschillen in het niveau van de neurotransmitter tonic, het voorkomen van transiënten, en de amplitude van transiënten tijdens de pre paring bout lordose versus lordose tijdens de paring bouts. Voor het meten van veranderingen in tonic patronen van elektrochemische release, werden de gegevenspunten die zich voordoen tijdens de lordose positie direct vóór een paring bout (d.w.z., vooraf paring bout lordose) vergeleken met de gegevenspunten tijdens een paring bout sessie met een t-test
2. Voorbereiding van raw-gegevens voor de analyse van beschreven Gegevensprotocol
   Opmerking: zoals gezegd, hoewel andere programma's of analyses mogelijk even haalbare opties, hierboven beschreven, MATLAB code wilt gebruiken de ruwe gegevens moet bereid zijn de volgende manier:
   1. de annotatie en spanning bestanden exporteren. Om dit te doen, onder de ' bestand ' tab, selecteer het ' Export ' functioneren en selecteer de ' aantekeningen ' tabblad naar de aantekeningen opslaan. Onder de ' bestand ' tab, selecteer het ' Export ' functioneren en kies het " TSV ' tabblad om op te slaan van de metingen van spanning als een TSV-extensiebestand.
   2. Elk bestand met een spreadsheetprogramma openen en opslaan als ' xls/xlsx ' de bestanden om compatibel te maken met MATLAB.
      Opmerking: Voor de ' aantekening ' bestand, zijn er aanvullende aantekeningen die handmatig moeten toegevoegd na export in een spreadsheet-programma te dicteren de start en het einde van beide de vooraf paring bout lordose (geannoteerde als PreMBlordorsis ) en de paring bout zodat deze tijdstippen kunnen rechtstreeks worden vergeleken, zoals vermeld in stap 5.1.2.
   3. Aantekeningen toevoegen aan het begin van de vooraf paring bout lordose (startPreMBlordosis) op hetzelfde moment als een lordose gedrag (startLordosis) dat ook begint omvat een mount gedrag, en ook aan het begin van een nieuwe paring bout als het vrouwtje blijft in de houding van de lordose.
   4. Aantekeningen toevoegen aan het einde van de vooraf paring bout lordose (endPreMBlordosis) wanneer de eerste mount begint.
   5. Aantekeningen toevoegen aan het begin van een paring bout (startMB) op hetzelfde moment van de endPreMBlordosis, aangezien dit de start van een paring bout betekent.
   6. Aantekeningen toevoegen aan het einde van een paring bout (endMB) aan de weerszijden van een mount waarin een ejaculatie (zie stap 4.1.4.1), of naar aanleiding van het vrouwtje ' s beëindiging van de houding van de lordose (endLordosis).

Representative Results

Elektrochemische en gedrags methodologie hierboven beschreven codering gebruikt, is deze lab begonnen te karakteriseren van zowel tonic en phasic schommelingen in zowel glutamaat als dopamine tijdens in vivo opnames van seksueel gedrag. Als gevolg van de stoffelijk-nauwkeurige wijze van deze methode, kunnen wij nauwkeuriger karakteriseren transmissie tijdens seksueel gedrag; evenals specifieke veranderingen in de vrijlating toeschrijven aan overeenkomstige tonic veranderingen tijdens de paring bouts en bijbehorende voorbijgaande fluctuaties tijdens de vrouw ontvangst van individuele copulatory gedrag (b.v., intromission, ejaculatie) vanaf de montage man.

Specifiek, we gebruikten deze methode om zich te concentreren op het meten van de patronen van de release van dopamine en glutamaat in de nar van afzonderlijke dieren. De nar is een kritische regio die betrokken zijn bij de verwerking van²² beloning en is beschreven als een integraal regio in de beloning aspecten van seksueel gedrag²³.

We hebben vastgesteld dat tijdens seksueel gedrag, vrouwtjes blijk geven van een verhoging van de tonic in Dopaminerge niveaus in de kern van de NAc tijdens de paring bouts (Figuur 5). Terwijl deze tonic wijzigingen kunt weergegeven voor alle paring bouts, de hierboven beschreven methode meten tonic veranderingen tussen elke paring bout, en dus het verhogen van de temporele identificatie van algemene wijzigingen in tonic niveaus van neurotransmitter release in de gehele de hele sessie. Verder, deze beschreven methodologie kan lokaliseren phasic wijzigingen en stoffelijk kaart de gedragingen waarschijnlijk gekoppeld aan de schommelingen van deze phasic neurotransmitter. In het bijzonder suggereren deze voorlopige resultaten dat tijdens de paring bouts, Dopaminerge transiënten in de nar ontstaan tijdens het vaginale inbrengen (intromission) door het mannetje (Figuur 6). Bovendien is deze associatie met intromission specifieke, met te verwaarlozen Dopaminerge reacties op andere copulatory gedrag, zoals de AI.

Een soortgelijk patroon geconstateerd bij andere dieren ten aanzien van glutamaat release, met snelle transiënten die met afzonderlijke intromissions in de dorsale NAc kern tijdens een copulatory bout (Figuur 7 corresponderen). Dit patroon is regio specifieke, met geen waarneembaar signaal die zich voordoen in de NAc-shell of mediale Spiegelse van andere dieren.

Figuur 1 : Technologie van de enzymatische Biosensor.
Standaard fabricage van verkrijgbare enzymatische biosensor sondes die neurotransmitters via enzym-gemedieerde verwerking (linker afbeelding) te detecteren. In het geval van glutamaterge sensoren, glutamaat oxidase is werkzaam in de enzymatische laag (rechterafbeelding) de nonelectroactive neurotransmitter omzetten in electroactive waterstof peroxide (H₂O₂) die worden aangetroffen door oxidatie bij de platina-iridium (Pt-Ir) elektrode. Ascorbinezuur (AA), een gemeenschappelijke interferent die op hetzelfde potentieel, wordt geoxideerd is uitgesloten via een toevoeging van AA oxidase op de enzymatische laag die de interferent omgezet in nonelectroactive water. Andere negatieve electroactive interferents in de hersenen aanwezig zijn uitgesloten via een passieve selectieve membraan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Onderdelen van een Hamster paring Bout.
In hamsters bestaat een paring bout uit een opeenvolging van copulatory gedrag, waarin het vrouwtje in de houding van de onbeweeglijke lordose blijft terwijl de mannelijke anogenitally onderzoekt (A), (B)wordt geactiveerd, en intromission bereikt (C). . Opmerking een intromission is behavioristisch te onderscheiden van montage zoals de man zijn bovenste ledematen naar zijn lichaam trekt, opdringt zijn bekken naar voren, en krullen zijn staart omhoog, met vermelding van de penetratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Skull Cap bouw.
Gids canules, botschroeven en tandheelkundige acryl zijn gebruikt in de bouw van een schedel GLB toe inbrengen van koolstofvezel of enzymatische sonde (Zie¹⁵ voor stapsgewijze informatie). Deze afbeelding ziet u een enkele canule implantaat over de juiste NAc voor een enzymatische sensor (geen geïmplanteerde referentie-elektrode) en plastic hoofd mount voor de stabiliteit van de sensor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Glutamaat Biosensor kalibratie.
De gevoeligheid van elke biosensor aan glutamaat is getest in vitro voor een experimentele opname door 10 µm toevoegingen van glutamaat (groen) bij 37 ° C (aangezien enzymatische activiteit wordt beïnvloed door de temperatuur). Elke sensor wordt bevestigd als niet-reagerende ascorbinezuur (AA; rood) of dopamine (DA; blauw). Deze kalibratie zorgt voor de omzetting van wijzigingen in het amperometrische signaal gezien tijdens de experimentele opname op veranderingen in de concentratie van glutamaat.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Tonic neemt toe in Dopamine tijdens een paring Bout.
A. gestileerd voorbeeld van bout lordose signaal vs. paring bout lordose signaal. premating Voor het meten van tonic dopamine release, werden de amperometrische reacties op dopamine niveaus tijdens lordose voordat een paring bout (MB) vergeleken met die tijdens een MB. Grijze vakjes geven aan lordose voordat een MB. BLUE vakken geven aan lordose tijdens een MB. B. representatieve kwantificering van het ene dier vergelijken de gemiddelde spanning tussen preMB lordose en MB lordose. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) en sterretje geeft significant verschil (p-waarde < 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Vertegenwoordiger Dopamine Trace.
Phasic release van dopamine is tijd vergrendeld aan intromissions van het mannetje in de dorsale NAc kern. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7 : Vertegenwoordiger glutamaat Trace.
Glutamaat transiënten komen overeen met de individuele intromissions van de man in de dorsale NAc kern tijdens een uitgebreide seksuele ervaring. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Hoewel betrekkelijk eenvoudig, sommige problemen zich kunnen voordoen wanneer deze techniek in dienst. Ten eerste, de stereotaxic plaatsing van de sondes moet precies: in tegenstelling tot microdialysis die een bredere straal van de extracellulaire omgeving rond de sonde monsters, deze techniek alleen maakt het mogelijk de meting van een neurotransmitter die rechtstreeks in aanraking komt met de sonde. Ten tweede, in het geval van de opname van koolstofvezel, als gevolg van de kleine breedte van vezel, breuk kan optreden, en de sonde met doelbewuste zorg moet worden ingevoegd. In het geval van glutamaterge biosensoren, kan enzymatische afbraak optreden als de sonde niet binnen het gegarandeerde tijdsbestek van 3 weken wordt gebruikt. Gelukkig, al deze kwesties adresseerbaar, en kunnen worden opgeheven met de juiste zorg en aandacht voor detail.

Een potentieel problematisch caveat ontstaat in de specificiteit van vaste-potentieel koolstofvezel opnames. Omdat de toegepaste potentieel voor dopamine met andere monoamines, zoals noradrenaline, samenvalt als de opnames zijn gemaakt in gebieden die beide neurotransmitters, vrijgeven dan dit gebrek aan chemische specificiteit mogen beperken de interpretatie van de resultaten. In de nar vormt dit niet een groot probleem, met dopamine wordt de primaire catecholamine zender²⁴. Omdat ongeveer 98% van de cellen in NAc middellange Maxomys neuronen die inspelen op de Dopaminerge transmissie²⁴, het signaal is gericht op het opsporen van dopamine en vergemakkelijkt het gebruik van deze meer kant en klare aanpak.

Een ander voordeel van deze enzymatische biosensor en de vaste-potentieel koolstofvezel opname-systeem is dat dual-sonde opnames kunnen worden uitgevoerd, zodat zowel de electroactive als de nonelectroactive neurotransmitters zoals dopamine en glutamaat kunnen worden gemeten in hetzelfde dier gelijktijdig. Hoewel de hier gepresenteerde gegevens afkomstig zijn uit opnamen in afzonderlijke dieren, kunnen deze technieken worden toegepast gelijktijdig zodanig dat een convergentie van de transmissie in meerdere hersengebieden of in dezelfde regio bilateraal kunt evalueren. Combinatie van opnamen binnen hetzelfde dier of vergelijking van opnames over dieren zoals hier is afgebeeld, zijn beide krachtige hulpmiddelen in het ophelderen van de mechanismen achter netwerkverbindingen en signalering.

Kortom toont deze paper de krachtige technieken van enzymatische biosensing en vaste-potentieel opname voor het meten van meerdere electroactive en nonelectroactive neurotransmitters met behulp van een enkele experimentele opzet. Hoewel de gegevens gepresenteerd hier vandaan individuele neurotransmitter opnames over meerdere dieren, dit systeem biedt de mogelijkheid voor het opnemen van maximaal 4 sensoren in één dier gelijktijdig¹⁵. De resultaten van de steekproef gepresenteerd collectief inzicht geven in snelle transmissie in de vrouwelijke hamster die voortvloeien uit specifieke patronen van copulatory stimulatie van de man. Verder, deze experimenten laten zien tijd vergrendeld reacties van Dopaminerge en glutamaterge transiënten in het NAc-kern van het vrouwtje intromission van het mannetje, suggereren dat deze release mogelijk verantwoordelijk is voor het coderen van afzonderlijke lonende eigenschappen van seksueel gedrag. Ons doel is om door te gaan met behulp van de paring patroon in vrouwelijke Syrische hamsters te ontwikkelen van een meer gedetailleerd beeld van de relatie tussen in vivo dopamine en glutamaat release en de onderliggende circuits om afzonderlijke onderdelen van copulatory stimuli van de man. Wij zijn van mening dat de mogelijkheid om het karakteriseren van de patronen van deze neurotransmitters niet alleen gunstig van een basiswetenschap perspectief^{23 is}, maar ook in het ophelderen van potentiële therapeutische benaderingen voor pathologische vormen van beloning gedrag, dergelijke als drug verslaving²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.