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Articolo metodologico

Valutazione delle proprietà anticoagulanti e anti-infiammatori delle cellule endoteliali mediante coltura cellulare 3D e Non intero anticoagulato

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DOI:

10.3791/56227

⸱

5 settembre 2017

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1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un modello in vitro che permette lo studio e l'analisi di coagulazione in intero, anticoagulato. L'anticoagulazione nel sistema dipende l'effetto anticoagulante naturale delle cellule endoteliali sane e attivazione endoteliale delle cellule si tradurrà nella coagulazione.

Abstract

In vivo, le cellule endoteliali sono cruciali per l'anticoagulazione naturale del sangue circolante. Di conseguenza, l'attivazione delle cellule endoteliali conduce alla coagulazione del sangue. Questo fenomeno si osserva in molte situazioni cliniche, come il trapianto di organi in presenza di anticorpi anti-donatori pre-formati, tra cui lo xenotrapianto, come pure in ischemia e riperfusione. Al fine di ridurre la sperimentazione animale secondo i 3R standard (riduzione, sostituzione e raffinatezza), in vitro modelli per studiare l'effetto della cellula endoteliale attivazione sulla coagulazione del sangue sarebbe altamente auspicabile. Tuttavia, comune a base piatta sistemi della coltura delle cellule endoteliali forniscono un rapporto superficie-volume 1-5cm2 dell'endotelio per mL di sangue, che non è sufficiente per l'anticoagulazione naturale, endoteliale mediata. Coltura delle cellule endoteliali su microcarrier perline può aumentare il rapporto superficie-volume a cm 40-1602/ml. Questo aumento del rapporto è sufficiente a garantire l'anticoagulazione "naturale" di sangue intero, in modo che può essere evitato l'uso di anticoagulanti. Qui un in vitro basati su microcarrier sistema è descritto per studiare gli effetti di modificazione genetica di cellule endoteliali porcine sulla coagulazione del sangue umano totale, non anticoagulato. Nell'analisi della descritta, cellule endoteliali aortiche porcine primarie, o wild type (WT) o transgenici per umano CD46 e trombomodulina, erano coltivate su microcarrier perline e poi esposti a sangue umano appena prelevato non-anticoagulato. Questo modello permette per la misurazione e quantificazione del rilascio di citochine così come attivazione indicatori di complemento e della coagulazione nel plasma sanguigno. Inoltre, imaging di cellule endoteliali attivate e deposito delle immunoglobuline, proteine di coagulazione e complemento - sui branelli endotelizzati sono state eseguite mediante microscopia confocale. Questo test è utilizzabile anche per testare farmaci che sono supposti per impedire la coagulazione e, quindi, l'attivazione delle cellule endoteliali. Sulla cima del suo potenziale per ridurre il numero degli animali utilizzati per tali indagini, il dosaggio descritto è facile da eseguire e riproducibile in modo coerente.

Introduzione

L'endotelio vascolare è costituito da un monostrato di cellule endoteliali (EC) che costeggiano il lume dei vasi sanguigni. In uno stato fisiologico, quiescente CE sono responsabili per il mantenimento di un ambiente di anti-infiammatori e anticoagulante. 1 questo è mediato dall'espressione di anticoagulante e anti-infiammatori proteine sulla superficie del CE. Ad esempio, l'attivazione di CE causato da ischemia/riperfusione lesioni o rigetto vascolare di (xeno-) trapiantati risultati di organi in un cambiamento della superficie endoteliale da un anticoagulante e anti-infiammatorio stato pro-coagulante e pro-infiammatorie stato. 1

Per studiare l'affascinante e complessa interazione tra i fattori di coagulazione e dell'endotelio, modelli in vitro che imitare come fedelmente possibile la situazione in vivo sono altamente desiderabili. Una limitazione comune che caratterizza le analisi convenzionali in vitro della coagulazione è l'uso di sangue anticoagulato che rende ardua l'analisi degli effetti di coagulazione-mediata e non può riprodurre anche ricalcificazione del sangue intero citrato risultati ottenibili con fresco non-anticoagulato. 2 inoltre, in sistemi di coltura tradizionale piatto-letto cellulare è impossibile sfruttare le proprietà dell'anticoagulante dell'endotelio come una sufficiente superficie endoteliale delle cellule per volume di sangue non può essere raggiunto. Il modello presentato qui supera queste limitazioni coltivando CE sulla superficie delle perle sferiche microcarrier, affinché un rapporto di superficie-sangue CE di > 16 cm2/ml può essere raggiunto, che è simile alla situazione in piccole arteriole o vene, e che è stata descritta per essere sufficienti per consentire l'anticoagulazione "naturale" del sangue dalla superficie del CE. 3 , 4 il sangue intero può essere utilizzato senza anticoagulanti aggiunto in questa impostazione. I campioni di sangue possono essere raccolti durante l'esperimento e citochine, fattori di coagulazione e markers di attivazione del complemento solubili possono essere rilevati e quantificati. Inoltre, perline rivestite con CE microcarrier possono essere analizzati per deposizione di complemento e dell'immunoglobulina, nonché l'espressione di markers di attivazione CE mediante microscopia confocale. Un'altra interessante applicazione comprende la sperimentazione di farmaci che sono supposti per impedire la coagulazione e, quindi, l'attivazione delle cellule endoteliali. 5 anche se questo modello non può completamente sostituire la sperimentazione animale, offre un metodo per testare ipotesi specifiche funzionali ex vivo usando le cellule e ridurre così il numero di animali utilizzati nella ricerca di base su ischemia/riperfusione trapianto di lesioni o (xeno).

Il modello descritto è stato utilizzato per simulare un xenotrapianto impostazione in quali cellule endoteliali aortiche porcine (CEPA) sono coltivate sulle perle microcarrier e incubate con sangue umano totale, non anticoagulato. Diversi PAEC transgenici, portando diversi geni umani quali CD46 per la regolazione del sistema del complemento e/o thrombomodulin (hTBM) per la regolazione del sistema di coagulazione, sono stati analizzati per le loro proprietà dell'anticoagulante. Sistemi di attivazione, complemento e coagulazione delle cellule endoteliali sono strettamente controllati e collegati tra loro. 6 di conseguenza è importante capire come le diverse cellule transgeniche si comportano dopo l'esposizione al sangue umano per quanto riguarda l'espressione della molecola di adesione e rilascio di citochine, spargimento del glicocalice e la perdita delle proteine dell'anticoagulante. 7

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Protocollo

maiali Landrace tedesco (tipo selvaggio allevato in una fattoria locale e transgenico allevati presso l'Istituto di allevamento di animali molecolare e biotecnologie, Università Ludwig-Maximilian, Monaco di Baviera, Germania), da 30 kg a 40 kg, sono stati utilizzati Questo studio. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard con acqua e cibo ad libitum. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'atto di animali (procedure scientifiche) di Regno Unito e la Guida di NIH per la cura e uso di animali da laboratorio, così come la legge di protezione animale Svizzera. Tutti gli studi sugli animali rispettate le linee guida ARRIVE. Il Comitato di sperimentazione animale del servizio veterinario cantonale (Cantone di Berna, Svizzera) ha approvato tutte le procedure di animale, autorizzazione no. BE70/14. Protocolli sperimentali sono stato affinati secondo i principi di 3R e state-of-the-art anestesia e terapia del dolore sono stati utilizzati per ridurre al minimo il numero di animali e ridurre l'esposizione degli animali a stress e dolore durante gli esperimenti.

sangue è stato cavato da individui sani mediante venipuntura sistema chiuso conformemente alle linee direttive della giurisdizione e l'etica dell'ospedale dell'Università di Berna. La frase " non anticoagulato " significa che il sangue non è stato trattato con qualsiasi anticoagulante.

le seguenti operazioni vengono eseguite in condizioni sterili. È necessario avere familiarità con tecnica sterile della coltura cellulare base.

1. isolamento di CEPA

Nota: segmenti di aorta toracica di 6 a 10 cm sono stati ottenuti da eutanasizzati tedesco Landrace suini di 3-6 mesi di età (utilizzata per altri esperimenti in vivo) e immediatamente trasferito in una bottiglia di vetro da 500 mL contenente il mezzo di trasporto (DMEM + 1% di penicillina/streptomicina).

  1. Pre-cappotto una piastra a 6 pozzetti con fibronectina 12,5 µ g/mL in PBS 1 x e posizionarlo in un incubatore a 37 ° C per 1 h.
  2. Pre-riscaldare PBS sterile 1 x cella cultura medium (DMEM).
  3. Estrarre l'aorta suina da mezzo di trasporto.
  4. Posto l'aorta su una lastra di polistirene.
  5. a filo caldo PBS delicatamente in anticipo.
  6. Tagliare longitudinalmente l'aorta e fissarlo con aghi.
  7. Aggiungere il mezzo di coltura cellulare caldo sulla superficie interna del vaso.
  8. Aspirare il terreno di coltura cellulare di fibronectina e aggiungere mezzo di coltura di cellule fresche (DMEM completati con 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 0,4% della cellula endoteliale crescita medio integratore Mix).
  9. Immergere un batuffolo di cotone nel medium di coltura delle cellule. Il bastoncino di cotone imbevuto sulla parte superiore della superficie interna del vaso del tampone delicatamente e lentamente nella stessa direzione.
  10. Rub le cellule in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti round round.
  11. Fare lo stesso per il resto dei pozzi.
  12. Controllare le cellule sotto il microscopio e posizionare la piastra a 6 pozzetti in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Modificare il mezzo il secondo giorno e modificarlo nuovamente ogni 2-3 giorni.
  14. Quando le cellule stanno per essere confluenti, tripsinizzano cellule e semi in un matraccio da T75 (PAEC P1).

2. Caratterizzazione di CEPA

  1. pre-cappotto un chamberslide di 8 pozzetti con fibronectina 12,5 µ g/mL in PBS 1 x e posizionarlo in un incubatore a 37 ° C per 1 h.
  2. Semi di 5 x 10 4 cellule/pozzetto e incubare per una notte nell'incubatore a 37 ° C.
  3. Lavare le cellule due volte con PBS + + (PBS completati con CaCl 2 e MgCl 2), 300 μL/pozzetto.
  4. Fissare le cellule con il 3,7% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente, 200 μL/pozzetto.
  5. Lavare le cellule 3 volte con PBS + +, 300 μL/pozzetto.
  6. Aggiungere 300 μL di PBS 1 x-3_% BSA (tampone bloccante) e lasciare 30 min a temperatura ambiente.
  7. Applicare gli anticorpi primari (anti-VE-caderina, anti-CD31, anti-vWF) diluiti in detergente 1x-1%BSA-0.05% di PBS, 160 μL/pozzetto e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  8. Lavare 3 volte con PBS + + (200 μL/pozzetto).
  9. Applicare anticorpi secondari e DAPI diluito in detergente 1x-1%BSA-0.05% di PBS, 160 μL/pozzetto e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  10. Lavare 3 volte con PBS + + (200 μL/pozzetto).
  11. Montare diapositive con mezzo di montaggio a base di glicerolo e verificare l'espressione di marcatori di endoteliale delle cellule con un microscopio a fluorescenza.
    Nota: Cellule endoteliali aortiche porcine di cultura in una boccetta di T175 (medio basso del glucosio DMEM + 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 0,4% della cellula endoteliale crescita medio integratore Mix) fino al 90% confluenza è raggiunto. (semina di cellule di densità 1 x 10 6, 90% confluenza corrispondono all'incirca a 5 x 10 6 cellule).

3. Rivestimento di perline Microcarrier

  1. Mix 7 mL di microcarrier perline con 42 mL di soluzione di collagene in un tubo da 50 mL (100 μg/mL, diluito in una soluzione di acido acetico 0,2%) e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  2. Lavare perle due volte con 25 mL di PBS pH 7.4 (aggiungere 25 mL di PBS, mescolare bene con la pipetta e attendere che le perle sono stabilì poi scartare il surnatante e ripetere) e una volta con 25 mL di terreno DMEM.
  3. Coprire le perline nel tubo da 50 mL con 10mL di medium 199 supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina, 1% L-Glutammina, 0,4% della cellula endoteliale crescita medio integratore Mix e 25 μL di eparina (5000 UI/mL) e consentire equilibrazione per 10 min prima di riutilizzare.

4. Raccolta di cellule

  1. rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalla beuta T175 contenente CEPA e aggiungere 5 mL di PBS pH 7.4.
  2. Rimuovere PBS dal pallone T175.
  3. Aggiungere 5 mL di EDTA Trypsin-0.05% e incubare per 3-4 min a 37 ° C.
  4. Raccogliere le cellule lavando il matraccio con 15 mL di mezzo di coltura cellulare e trasferire la sospensione in una provetta da 50 mL.
  5. Centrifugare le cellule a 1.200 x g per 8 min a temperatura ambiente, rimuovere l'eccesso di terreno e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura cellulare.

5. Semina di cellule nel pallone agitatore

  1. aggiungere 20 mL di terreno di coltura cellulare alla sospensione cellulare e risospendere.
  2. Aggiungere 20 mL medium di coltura cellulare (senza cellule) nel pallone agitatore magnetico 500 mL.
  3. Aggiungere le celle per le perle di microcarrier lavato dal punto 3.3 e mescolare accuratamente con una pipetta sierologica di 25 mL.
  4. Trasferire la miscela di perline/cella nel pallone magnetico spinner.
  5. Sciacquare il tubo da 50 mL con 10 mL di terreno di coltura cellulare per raccogliere le cellule restanti.
  6. Aggiungere un ulteriore 85 mL di mezzo di coltura cellulare nel pallone spinner e inserirlo nell'incubatore durante la notte a 37 ° C in un agitatore (x 100 g, intervallo di miscelazione: 3 min ogni 45 min).
  7. Aggiungere 50 mL di mezzo di coltura cellulare (volume totale 200 mL) e continuare a mescolare per altre 24 h a 37 ° C in un agitatore (x 100 g, intervallo di miscelazione: 3 min ogni 45 min).
  8. Aggiungi incolore medium RPMI (supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina, 1% L-Glutammina, 0,4% della cellula endoteliale crescita medio integratore Mix e 25 μL di eparina) fino a raggiungere 320 mL di volume totale.
  9. Sostituire il mezzo ogni 48 h: rimuovere 100 mL di mezzo vecchio e aggiungere 100 mL di RPMI incolore completati freschi.
  10. Della coltura le cellule per 5-7 giorni. Il tempo dipende dallo stato di confluenza delle perline rivestite con cella.
< classe p = "jove_title "> 6. Verifica di confluenza

  1. raccogliere 200 μL di perline rivestite con cella utilizzando una pipetta e trasferirli in una provetta di polipropilene.
  2. Lavare le perle 3 volte con 600 µ l di PBS 1 x (aggiungere PBS, inclinare il tubo e mescolare delicatamente per evitare il distacco delle cellule, attendere le perline per stabilirsi, scartare il PBS e ripetere).
  3. i talloni per 10 minuti aggiungendo 200 μL di acido parapicric.
  4. Lavare 3 volte con 600 µ l di PBS 1 x.
  5. Aggiungere DAPI diluito in PBS 1 x e incubare per 10 min.
  6. Trasferire le perline su un vetrino e applicare un vetrino coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio di glicerolo basata.
  7. Visualizzare le perle sotto un microscopio confocale.

7. Procedura sperimentale

  1. rimuovere le perline rivestite con cella dalla beuta agitatore magnetico (le procedure non hanno da fare in condizioni sterili) con una pipetta sierologica di 10 mL e trasferirli nei tubi in polipropilene del turno-fondo 12ml.
  2. Let i branelli stabilirsi (circa 1-2 min) e rimuovere l'eccesso di terreno.
  3. Aggiungere più perline ai tubi fino a quando ogni tubo contiene esattamente 2 mL di perline.
  4. Aggiungere 5 mL RPMI chiaro ad ogni provetta e mescolare bene usando una pipetta sierologica di 10 mL.
  5. Let i branelli stabilirsi e rimuovere l'eccesso di terreno.
  6. Ripetere il lavaggio ancora una volta con RPMI e rimuovere ogni eccesso di terreno.

8. Incubazione con Non-anticoagulato

  1. lentamente e con cautela (utilizzando jet né consegnate) prelievo di sangue da un volontario sano e raccoglierlo in provette di polipropilene neutro 9 mL (senza anticoagulante).
  2. Trasferire lentamente 8 mL di sangue con una pipetta sierologica di 10 mL in ciascuna delle provette in polipropilene contenenti 2 mL di perline rivestite con cella (il volume totale sarà 10 mL). Sempre evitare bruschi di sangue o perline per evitare l'attivazione prematura di CE. La procedura richiede 1-2 min.
  3. Inclinare delicatamente la miscela di sangue/tallone per garantire parità di miscelazione e sigillare il tappo con la pellicola di paraffina.
  4. Disporre le provette su una tabella di inclinazione orizzontale (con dolce inclinazione impostazioni solo) all'interno di un incubatore a 37 ° C e registrare tempi di coagulazione.
    1. a intervalli di tempo impostato, ad esempio dopo 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, rimuovere almeno 1,5-2 mL di miscela di sangue-microsfere per l'analisi del siero o plasma.
      Nota: per i 6 punti di tempo suggeriamo di avere più di 3 replicati all'interno di un gruppo di celle, come sarà fatto il prelievo di sangue in provette diverse.
    2. Per raccolta di siero, lasciare il sangue a coagulare. Per raccogliere il plasma, aggiungere EDTA o citrato per provette 2 mL prima di aggiungere i campioni di sangue.
    3. Conservare i capillari sul ghiaccio, centrifugare a 2.500 x g per 10 min a 4 ° C e conservare il siero/plasma a 80 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: Dettagli sui materiali sono forniti in Tabella materiali

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Risultati

Dopo 7-10 giorni di cultura nella beuta di spinner (Figura 1) le cellule erano confluenti, che copre tutta la superficie delle perle microcarrier (Figura 2). Verifica dello stato confluenza è un passo importante perché un monostrato non-confluenti della CE sulle microsfere porterà ad una profonda diminuzione nel tempo di coagulazione, dato il microcarrier superficie dei branelli è fortemente pro-coagulante (tempo di coagulazione:...

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Discussione

Il modello qui presentato è adatto per coagulazione correlate a studi che consente l'analisi dei diversi aspetti della coagulazione e della sua interazione con la CE. 8 nella ricerca di xenotrapianto, è un sistema utile per testare le proprietà dell'anticoagulante di ECs porcina geneticamente differenti dopo incubazione con sangue umano 9.

Le fasi più critiche del protocollo sono quelli garantendo la cellula completa copertura (confluency) delle ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal fondo nazionale svizzero (FNS, Grant No. 320030_156193). Gli autori ringraziano il Dr. Benoît Werlen per fornire le perline di microcarrier di Biosilon. Ringraziamo anche la Prof. ssa Hans Peter Kohler e Prof. ssa André Haeberli per aiuto con la creazione del modello del branello di microcarrier.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PAECIsolato dall'aorta di maiale nel nostro laboratorio
Microcarrier beads (Biosilon)Thermo Fisher Scientific160-250
Collagene I, BovinoGibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
Medio 199SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
Tubi neutriSarstedt02.1726.001
Tubi in polipropileneSimportT406-2A
AgitatoriTecnomara
Agitatore biologicoBrouwerMCS-104S
Rat anti CD31R& D SystemsMAB33871Diluizione 1:100
Capra anti-ratto IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003Diluizione 1:500
Capra anti VE-caderinaSanta Cruzsc-6458Diluizione 1:100
Coniglio anti vWFDAKOA0082Diluizione 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488Sonde molecolariA11055Diluizione 1:500
Capra anti coniglio - FITCSouthern Biotech4050-02Diluizione 1:500
DAPISigma32670-25MG-FDiluizione 1 &; g/mL
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054
FBSGibco10270-106Concentrazione: 10% in terreno di coltura cellulare
AdattatoreSarstedt14.1205
Microscopio confocaleCarl ZeissLSM 710
Software di analisi delle immaginiImage JDisponibile gratuitamente all'indirizzo: https://imagej.net
Integratore di terreno di crescita delle cellule endotelialiMixPromoCellC-392162 mL in 500 mL di DMEM
Penicillina StreptomicinaGibco15140-122Concentrazione: 1% nel terreno di coltura cellulare
L-GlutamminaGibco25030-024Concentrazione: 1% nel terreno di coltura cellulare
Heparinun natricumDrossa Pharm AGConcentrazione di stock: 5000 U.I./ mL
ChamberslidesBioswisstec AG30108
CaCl2 x 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 x6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA7030
Mezzo di montaggio in glicegelDakoC0563

Riferimenti

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
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  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
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  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

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