Summary
Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.
Abstract
Protokol kitosan tabanlı hydrogels dinamik imin kimya kullanarak hazırlamak için facile, verimli ve çok yönlü bir yöntem sunuyor. Hidrojel çözümleri glikol kitosan, sentezlenmiş benzaldehyde sonlandırıldı polimer gelator ile karıştırılarak hazırlanır ve hydrogels verimli bir şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika içinde elde edilir. Glikol kitosan, polimer gelator ve su içeriği arasında değişen oranlarda tarafından farklı jelleşme kez ve sertliği ile çok yönlü hydrogels elde edilir. Zarar görmüş, hidrojel onun Görünüşe ve modülü, dinamik imin Tahvil reversibility crosslinkages olarak nedeniyle kurtarabilirsiniz. Kendi kendine healable bu özellik hidrojel enjeksiyon işleminden sonra sıkılmış parçaları bir ayrılmaz toplu hidrojel kendi kendine iyileşmiş olabilir bu yana enjekte edilebilir olmasını sağlar. Hidrojel da çok farklı denge durumları dinamik imin Tahvil nedeniyle birçok biyo-aktif uyaranlara cevap veriyor. Bu hidrojel biyo uyumlu doğrulandı ve L929 fare fibroblast hücreleri katıştırılmış aşağıdaki Standart prosedürler ve Hücre proliferasyonu kolayca 3D cep ekimi işlemi tarafından değerlendirildi. Hidrojel farklı araştırma nerede bir 3D çevre hücreler için fizyolojik bir taklit kazançlı için ayarlanabilir bir platform sunar. Çok duyarlı, kendi kendine healable ve enjekte edilebilir özellikleri ile birlikte, hydrogels potansiyel olarak uyuşturucu ve gelecekteki bio-tıbbi uygulamalar hücrelerde birden çok taşıyıcıları olarak uygulanabilir.
Introduction
Hydrogels çapraz polimer malzemeler büyük miktarda su ve yumuşak mekanik özellikleri ile ve birçok bio-tıbbi uygulamalar1,2' kullanılmıştır. Hydrogels hücreleri içinde vivoiçin fizyolojik çevre çok benzer bir yumuşak ve ıslak ortam sunmaktadır. Bu nedenle, hydrogels 3D hücre kültür3,4için en popüler iskele biri haline gelmiştir. 2D Petri kabına hücre kültürü için karşılaştırıldığında, 3D hücre kültürü, microenvironment başvurun ve yayılmasını önleme ve ayırt etme amacıyla5için bir araya hücreler için bir hücre dışı Matriks (ECM) taklit sunmak için hızla ilerlemiştir. Ayrıca, doğal polimerler içeren hydrogels biyo uyumlu ve teşvik ortamları çoğalırlar ve3ayırt etmek için hücreleri için önerebiliriz. Sentetik polimerler elde Hydrogels hayvan kökenli proteinler veya virüs gibi karmaşık etkileri dışlamak onların basit ve net bileşenleri için tercih edilir. Tüm hidrojel adaylar arasında 3D hücre kültürü için kolayca hazırlanır ve tutarlı bir özellik olan hydrogels her zaman tercih edilir. Farklı araştırma gereksinimleri uyacak hidrojel'ın özelliklerini ayarlamak için tesisin iyi6önemlidir.
Burada bir çok yönlü hidrojel platform 3D hücre kültür7için olur dinamik imin kimya kullanarak bir glikol kitosan tabanlı hidrojel facile hazırlanması tanıtmak. Bu yöntemde, iyi bilinen biyo uyumlu glikol kitosan çerçeveler hidrojel'ın ağlar kurmak için kullanılır. Onun amino grupları ile sona benzaldehyde polietilen glikol dinamik imin Tahvil hydrogels8crosslinkages oluşturmak için polimer gelator olarak tepki. Dinamik imin Tahvil formu ve çevresi, hydrogels mekanik olarak ayarlanabilir çapraz ağlar9,10,11ile endowing için geri döndürülebilir ve responsively ayrıştırmak. Yüksek su içeriği, biyo uyumlu malzemeler ve ayarlanabilir mekanik güçlü nedeniyle hidrojel başarıyla 3D hücre kültürü12,13L929 hücreler için bir iskele olarak uygulanır. İletişim kuralı burada polimer gelator sentezi, hidrojel hazırlama, hücre katıştırma ve 3D hücre kültürü çalışmalarının da dahil olmak üzere yordamlar, ayrıntıları.
Hidrojel aynı zamanda birçok diğer özellikleri nedeniyle çok duyarlı çeşitli biyo-uyarıcılara (asit/pH, B6 vitamini türevi piridoksal, protein papain, vb) dahil olmak üzere, hidrojel olabileceğini gösteren onun dinamik imin crosslinkages gösterir fizyolojik şartlarda8altında çürümeye bağlı. Hidrojel hidrojel minimal invaziv enjeksiyon yöntemi ile idare ve uyuşturucu ve hücre teslimatlar14,15dakika sonra bir avantaj Yani kendi kendine healable ve enjekte edilebilir, da. Hidrojel işlevsel katkı maddeleri veya belirli önceden tasarlanmış polimer gelators ekleyerek, manyetik, sıcaklık, pH duyarlı, hangi yerine vb16,17, gibi belirli özellikleri kazanıyor için uyumlu bir araştırma gereksinimleri çok çeşitli. Bu özellikleri bir enjekte edilebilir olmak potansiyel kapasite hidrojel'ın uyuşturucu ve hücreler içinde in vitro ve in vivo bio-Medikal araştırma ve uygulamalar için birden fazla taşıyıcıları ortaya koyuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dikkat: ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen uygun güvenlik uygulamaları kimya deneyleri, bir duman hood ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, koruyucu eldiven, önlük, vb) kullanımı da dahil olmak üzere yerine getirirken kullanın. Standart hücre işleme teknikleri (sterilizasyon, hücre kurtarma, cep passaging, hücre dondurma, hücre boyama, vb) protokolü gerektirir.
1. hazırlık Hydrogels
- öncesi kuruma, PEG benzaldehyde sentezi di functionalized polietilen glikol (DF PEG) sona polimer
- tartmak 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol), bir yuvarlak alt şişesi (250 mL) aktarmak ve toluen (100 mL) ekleyin.
Not: Farklı molekül ağırlıkları ile diğer mandal hidrojel oluşumu için çalışabilir ancak farklı sertlik götürecek. - Isı tabancası (ya da sıcak bir tabak yaklaşık 40 ° C) hafif polimer çözülür yardımcı olmak için çözüm ısı. Tüm polimerler geçiyoruz sonra bir Buharlaştırıcı tüm çözücüler kaldırmak için kullanın. Bu erime ve kuru süreç kurutulmuş PEG polimerler yapmak için iki kez yineleyin.
Dikkat: Bu bir duman başlıklı aşırı özenle yapılmalıdır. Toluen yanıcı.
- tartmak 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol), bir yuvarlak alt şişesi (250 mL) aktarmak ve toluen (100 mL) ekleyin.
- Benzaldehyde fesih tepki PEG
- şişesi için manyetik karıştırıcı ve tetrahydrofuran (THF, 100 mL) ekleyip PEG bir karıştırıcı kullanarak geçiyoruz. 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) ve 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0.6 mmol) sırayla tüm katı tamamen erimesi için çözümler ekleyin.
- Ekle N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) çözümü ve susuz CaCl 2 şişeye doldurulur bir kurutma tüp ekleyin. Reaksiyon karıştırma altında oda sıcaklığında tutmak (~ 20 ° C) için yaklaşık 12 h.
- Sonrası tepki süreci
- reaksiyon tamamlandıktan sonra vakum tarafından çözümde oluşturulan beyaz katı filtre. Çözüm beyaz katı çökelti için karıştırma altında soğuk Dietil eter (500 mL) dökün. Beyaz katı göre filtrele toplamak ve katı bir duman başlıklı kuru.
- Beyaz katı THF yeniden dağıtılması, çözünmez herhangi bir beyaz katılar filtre, çözüm taze soğuk Dietil beyaz katı çökelti eter dökün ve kuru. 2-3 kez bu adımları tekrarlayın ve sonra beyaz katı bir vakum kurutma fırın (20 ° C, 0.1 mbar) onları tamamen kurumasını yerleştirin. Nihai ürün olarak beyaz toz toplamak: benzaldehyde sona DF PEG.
- öncesi kuruma, PEG benzaldehyde sentezi di functionalized polietilen glikol (DF PEG) sona polimer
- Hydrogels hazırlanması
- tartmak DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol 0,22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) farklı miktarda bir tüp (10 mL), deiyonize su (5.0 mL) ekleyin ve bir girdap veya manyetik karıştırıcı yardımcı olması için kullanın Polimer çözülür.
- Glikol chitosan (0.495 g, x 10 -3 mmol 6,18) deiyonize su (15,0 mL) bir tüp (50 mL) dağıtılması ve kitosan çözüm (3 wt %) homojenize için birkaç dakika için bir girdap kullanın.
- Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) ve DF PEG Çözümleri (0.2 mL) sırayla bir tüp (2.0 mL) ekleyin. Bir girdap formu hydrogels homojen çözümlerinize birkaç dakika içinde karıştırmak için kullanın. Hydrogels farklı mekanik güçlü yapmak için Tablo 1 ' deki oranları izleyin.
Not: hidrojel zaten oluşmuş olup olmadığını belirlemek için tüp ters çevirme yöntemini kullanın.
- Reolojisi analizleri
- Reolojisi analizleri dönüş rheometer paralel bir çelik plaka üzerinde yürütmek (çapı: 20 mm). Jelleşme test için Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) daha düşük bir tabağa yayıldı. O zaman, DF PEG sulu çözümler (0.2 mL, 2 wt %) eşit olarak dropwise kitosan çözüm yüzeye ve hızlı bir şekilde bir pipet ile karıştırın. Düşük aşağı üst plaka ve test için başlar
- İçin hidrojel ' s sertlik testi, kesilmiş bir hidrojel bir çember içine (çapı: 20 mm) ve depolama modülü ölçmek (G ') değerleri frekans analizleri % 1 zorlanma, karşı. Tipik G ': 6,3 rad s değerleri − 1 Tablo 1 ' de listelenen.
Not: 0,5 h hidrojel Reolojisi analizleri hidrojel dinamik bağ istikrar sağlamak için hidrojel oluşumu sonra taşımak. - İçin hidrojel ' s kendi kendine healable özelliği testi, bir hidrojel paramparça ve duyulursa ayrılmaz bir parçası için parçaları bir araya toplamak. Bir daire yapmak hidrojel parça kesme (çapı: 20 mm) ve Reolojisi analizlerini incelemek rheometer üzerinde koydu.
2. Hydrogels 3D cep ekimi
- hidrojel jelleşme çözümleri hazırlanması
- tartmak DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) steril tüp (4.0 mL), hücre kültürü medya (RPMI-1640, 2.0 eklemek mL) ve bir girdap veya karıştırıcı polimer çözüm (20 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olması için kullanın. Çözüm bir şırınga (10.0 mL) içinde yük ve sonra mikrop bakteri kuvvetli filtreden (0,22 µm) geçirerek sterilize.
- Glikol chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) bir steril tüp (15,0 mL) tartmak, hücre kültürü medya (RPMI-1640, 4.0 mL) ve girdap glikol kitosan çözüm (4.0 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olmak için ekleyin. Bir şırınga (10.0 mL) çözümde yük ve 0,22 µm bakteri kuvvetli filtre ile filtre.
- Hydrogels hücre ekimi
dikkat: gerçekleştirmek tüm doku kültürü başlıklı ilgili yordamları cep. Steril tekniği konusunda temel bilgi bekleniyor.- Hücre süspansiyon
- RPMI-1640 hücrelerde kültür L929 hazırlanması orta % 10 ile desteklenmiş FBS, %5 penisilin (10 mL) bir Petri çanak (çapı 10 cm) ve 37 ° C, % 5 CO 2 kuluçkaya. Orta kullanmadan önce her gün değiştirin.
- Hasat L929 hücreleri tripsin (0.025 w/v %) ve EDTA içeren PBS ile (% 0,01 w/v), (70 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi ve RPMI-1640 orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Kan sayım kurulu standart operasyon kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Hücre toplama ayarlamak için hücreleri yeniden askıya ~ 3.75 × 10 6 hücre/mL.
- Hydrogels hücre katma
- L929 hücre süspansiyonlar (0.4 mL, 3,75 x 10 6 hücre mL -1) glikol kitosan çözüm (0.4 mL) girdap tarafından bir tüp (4.0 mL) ile karıştırın. L929/glikol kitosan çözüm (0.8 mL) confocal Petri kabına ortasına pipette (çapı 2,0 cm). DF PEG Çözümleri (0.2 mL) aynı çanak içine pipette ve yavaşça çözüm mix ve hidrojel oluşumu teşvik pipet.
Not: hidrojel oluşumu petri kabına eğerek değerlendirmek. - Doğrudan hücre kültürü için ek RPMI-1640 kültür medya (1.0 mL) hidrojel üstüne miktarda ekleyebilirsiniz. Gömülü hücre hydrogels (1.0 mL, 1,5 wt % glikol kitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1.5 × 10 6 hücre mL -1) (37 ° C, % 5 CO 2) bir kuluçka makinesine koy ve orta her gün değiştirin. Gün 1, 3, 5 ve 7'den sonra hücre kapsülleme hücre görüntüleme için hazır olun.
- L929 hücre süspansiyonlar (0.4 mL, 3,75 x 10 6 hücre mL -1) glikol kitosan çözüm (0.4 mL) girdap tarafından bir tüp (4.0 mL) ile karıştırın. L929/glikol kitosan çözüm (0.8 mL) confocal Petri kabına ortasına pipette (çapı 2,0 cm). DF PEG Çözümleri (0.2 mL) aynı çanak içine pipette ve yavaşça çözüm mix ve hidrojel oluşumu teşvik pipet.
- 3D cep sonrası kültür için hydrogels enjeksiyon sonra yüklü hücre hidrojel hazırlamak (1.0 mL, bkz: adım 2.2.2) bir şırınga (10.0 mL, 48 G iğne) içinde. Sonra hidrojel formları hidrojel yavaş yavaş bir petri confocal görüntüleme için içine enjekte. Üstünde tepe-in hidrojel (1.0 mL) kültür ortamının ek bir miktar ekleyin ve her gün değiştirin. Petri kabına (37 ° C, % 5 CO 2) bir kuluçka makinesine koy ve daha sonra görüntüleme için hazır olun.
Dikkat: Lütfen kontrol edin ve bir şırınga Emanet işlem protokolü izleyin.
- Hücre süspansiyon
- Hücre canlılığı analizi
- Confocal gözlem
- PBS (1.0 mL) ile hydrogels için iki kez yıkayın. Floresein diacetate (FDA, 0.5 mL, 0,05 mg/mL) ve propidium iyodür (PI, 0.5 mL, 0,08 mg/mL) çözümleri için 15 dk ile hydrogels leke. Boyama sonra tüm maddeleri kaldırın.
- Gözlemlemek confocal mikroskop altında uyarma dalgaboyu 488, kullanarak hydrogels nm ve 543 canlı görselleştirmek için nm ve ölü hücreleri, anılan sıraya göre. Z-yığınlar hücreler eşit dağılımı doğrulamak için hydrogels her 2 µm derinliğe üzerinden alın.
Not: PI ölü hücreleri lekeleri ise FDA canlı hücreleri lekeleri.
- Hidrojel (1.0 mL) Asetik asit (HAc, 3 v %, 1.0 mL) 5 min ve pipet ile bir tüpe (4.0 mL) bozulmasına yol açar. Hücreleri tarafından santrifüj (70 x g, 5 min) toplamak ve RPMI-1640 hücre kültür orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Bir kan sayım kurulu kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.
- Confocal gözlem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol hidrojel hazırlık ve 3D hücre kültürü olarak kullanılmasını şematik bir sunumunu şekil 1' de sunulmaktadır. Bilgi hidrojel'ın içindekiler ve farklı mekanik güçlü ile hazırlanan oranları Tablo 1' de özetlenmiştir. Hidrojel kendi kendine healable ve depolama modülü Frekans testi Şekil 2' deki karşı tarafından hidrojel'ın sertlik Reolojisi özelliği sunar. Hücre confocal görüntüleri ve gün ile hücre sayısı hydrogels kültüründe hücre canlılık ve Hücre proliferasyonu ile 3D hücre kültürü teyit şekil 3' te sunulmaktadır. Şekil 4 mikroskobu, confocal resim ve Hücre proliferasyonu oranları enjeksiyon ve sonrası kültür acı hydrogels içinde gömülü hücreler için analizini sunar. Yüksek hücre canlılık ve Hücre proliferasyonu hidrojel içinde gömülü hücreleri yıkıcı zarar uğradığı ve hidrojel'ın injectability gösteren sonrası kültür tarafından geri olabilir gösterir.
Resim 1 : Hidrojel ve 3D hücre kültürü olarak kullanılmasını hazırlanması. (A)hidrojel hazırlık; (B) hücre süspansiyon hazırlama; (C) 3D hücre kültüründe hydrogels veya iğne olmadan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Hidrojel sertlik. Depolama modülü G' karşı sıklığı özgün(a)ve (B) kendi kendine iyileşmiş hydrogels. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : 3D hücre kültüründe hidrojel. L929 hücreleri(a)3D confocal görüntülerini katıştırılmış sert güç hidrojel (yeşil: Canlı hücreler; Kırmızı: ölü hücreleri); (B) hücre sayım sonuçları L929 hücrelerinin hücre kapsülleme izotopu zaman sonra hidrojel içinde gömülü. Ölçek çubuğu 300 µm. sunulan ortalama ± SD veri = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : 3D hücre hidrojel sonra enjeksiyon sonrası kültüründe. Enjeksiyon ve hücre yüklü hidrojel sonrası kültür (A) A şematik görüntüsü. Ekle: Hydrogels (solda) enjeksiyon öncesi ve sonrası hücre kültürü (orta ve sağ) 7 gün sonra hücrelerinin mikroskopisi görüntüleri gömülü. Ölçek çubuğu 100 µm; = (B) Confocal görüntüleri L929 hücrelerinin bir sert güç hidrojel gömülü ve sonra enjeksiyon sonrası kültürlü (yeşil: Canlı hücreler; Kırmızı: ölü hücreleri), ölçek çubuğu 300 µm; = (C) A nükleer silahların yayılmasına karşı oranı hydrogels ile ya da ezelî sonra kapsülleme enjeksiyon kültürlü hücre karşılaştırılması. Ortalama ± SD (uyarlama başvuru12; olarak sunulan veri Copyright © 2017 Elsevier). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hidrojel sertlik | Yumuşak | Orta | Sert |
| Glikol chitosan (mg) | 6,6 | 6,6 | 6,6 |
| DF PEG (mg) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Polimer gelator içeriği (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| Deiyonize su (mL) | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Gelaion süresi (dk) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * test altında frekans 6.3 rad s-1, zorlanma paralel bir tabak kullanarak % 1 (çapı 20 mm) dönme rheometer üzerinde. |
Tablo 1: Bilgi farklı mekanik güçlü ile hazırlanan hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu Protokolü (şekil 1) sunulan hidrojel iki ana bileşenden oluşur: doğal polimer glikol chitosan ve sentetik bir benzaldehyde sona polimer gelator DF PEG, hangi her iki Biyouyumlu malzemelerdir. DF PEG sentezi bir tek adımlı değişiklik tepki kullanılarak sunulur. Moleküler ağırlık 4.000 PEG bu protokol çözünürlük, değişiklik verimliliği gibi hidrojel sertlik endişelerini için seçildi. Hydrogels ile farklı mekanik güçlü bir dizi hazırlanan kullanarak farklı katı içeriği ve oranları glikol chitosan ve DF PEG. Jelleşme hız da seyreltik çözümleri tarafından yavaşlayabilir miyiz rağmen homojen hydrogels hızlı bir şekilde dakikada jelleşme çözümleri altında oda sıcaklığında, karıştırılarak oluşmuştur. Reolojisi test farklı hydrogels mekanik gücü değerlendirmek için istihdam edildi. Depolama dönmeler (G') bu hydrogels yaklaşık 900 farklı bulunmuştur Pa (yumuşak), 2.100 Pa (orta) 4.700 için Pa (sert) (Tablo 1 ve şekil 2A). Bu yüksek crosslinking yoğunluk daha yüksek depolama modülü (daha fazla sertlik) kaynaklanan hidrojel ağ daha fazla polimer gelators ekleyerek katkıda. Kendi kendine healable özelliği de hidrojel 's modülü (şekil 2B) kurtarma tarafından onaylanır. ECM sertlik için çeşitli dokularda farklıdır, bu nedenle hidrojel ayarlanabilir mekanik yardımlar teklif ve farklı araştırma gereksinimlerini karşılamak bu glikol chitosan ve DF PEG polimer gelators18arasında çeşitli oranları tarafından bilinmektedir.
L929 hücreleri, normal fare fibroblast hücre kültürünü vivo içinde çevre doku sertliği ile ~ 5.600 pa19, hidrojel içinde gömülü olabilir için bir hücre modeli olarak kullanıldı. Hydrogels hücre katma sonra bunu kolayca hydrogels hücrelerde son derece yüksek canlılık gösterdi görülebilmektedir (> % 99) kültür süreci boyunca kitosan tabanlı hidrojel mükemmel Biyouyumluluk teyit. Hidrojel hücre yoğunluğu dikkate değer bir artış bu hidrojel L929 hücrelerin büyüme faktörleri (şekil 3A) ekstra ekledi olmadan da çoğalması destek olabilir ima etti. Kültür hidrojel içinde 7 gün sonra cep numarası (şekil 3B) % 300 arttı. Bu hücreler içinde iskele kültürlü hangi daha fazla araştırma bu 3D hidrojel kültür yöntemi kullanarak ima mekanik yardımlar20,21, takip ayırt bildirilmektedir.
Enjekte edilebilir hydrogels hücrelerle Reproduction büyük teslimat verimlilik ve implante hücreleri14canlılık geliştirmek için eşsiz avantajlar kazanmıştır. Dinamik imin çapraz ağ içinde hidrojel duyulursa enjeksiyon sonra olabilir. Kendi kendine healable özelliği enjekte edilebilir, olmak hidrojel hydrogels olarak enjekte edilebilir için potansiyel uygulamalar birden çok taşıyıcıları ima sağlar. Daha fazla bu hidrojel bir enjekte edilebilir hücre taşıyıcı olarak değerlendirmek için bir enjeksiyon taklit eden ve sonrası kodlamayla deneme gerçekleştirildi. Gömülü hücre hidrojel bir şırıngada yüklendi ve 48 G iğne ile bir petri 7 işlem sonrası ile hücre canlılığı ve yayılma hızı okudu kültür günde ardından, içine kalan.
Şekil 4Agörüldüğü gibi ezilmiş hidrojel adet tümleşik bir hidrojel yaklaşık 1 h hücre dağıtımında yardımcı olur enjeksiyon sonra reform duyulursa olabilir. Hidrojel hücrelerde için kapsülleme (4A rakam, sol Ekle), önemli ölçüde 7 gün sonra (4A rakam, orta Ekle) artmış hücre yoğunluğu hemen sonra görüntü ile karşılaştırıldığında aldı. Genişlemiş imgelemde, daha ayrıntılı bir hücre fissional süreç içinde bazı hücreler ikiye bölünmesine olanak bulunur (şekil 4A, doğru Ekle), doğrudan hidrojel 3D hücre çoğalması tarafından onaylandı. Şekil 4B enjeksiyon ve sonrası kültür deneme sonra canlı ölü hücre deneyleri confocal görüntüleri gösterir. Enjekte hücre yoğunluğu arttı tabii ki yüksek hücre canlılığı ile (> % 99), enjeksiyon sonra 3D hidrojel içinde başarılı hücre çoğalması gösteren. Enjeksiyon hücre proliferasyon oranı etkilenen olsun, nicel istatistik analizi için hydrogels veya iğne olmadan Hücre proliferasyonu fiyatlarına karşılaştırması yapıldı öğrenmek için (şekil 4 c) yapılır. Hücre proliferasyon hızı enjeksiyon sonra biraz azalmış olsa da, üst düzey (~ %75) ve hücre sayısı artan %145 nispeten 7 gün içinde kesme Kuvvetleri enjeksiyon sırasında bir observable sahip gösteren hidrojel kültüründe kaldı sonra hücre çoğalması negatif etkisi sınırlı.
Biz bu hidrojel uygulamasının tipik bir prosedür açıklanan ancak araştırmacılar protokolünü belirli araştırma gereksinimlere uygun biçimde değiştirebilirsiniz. Polimer gelators hidrojel üzerinde önemli etkiler ve kolayca değiştirilebilir. Örneğin, bu hidrojel sertliği kolayca glikol chitosan ve DF PEG gelator farklı oranları tarafından manipüle. Bu arada, kullanım DF PEG diğer moleküler ağırlıkları da bu hedef yerine getirmek. Bu protokol için 4 K PEG kullandık ama PEG 2K 10K de işe yarayabilir. Diğer mandal kullanırken, sertlik ve jelleşme zamanı özellikle izlemek önemlidir. Araştırmacılar belirli fonksiyonel benzaldehyde sonlandırılmış polimerler17hazırlamak için sentez becerileri varsa diğer fonksiyonel polimer gelators de işe yarayabilir.
Bu iletişim kuralının bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, dinamik yapısı nedeniyle, bu hidrojel sertliği bir kovalent bağ çapraz hidrojel ile karşılaştırıldığında sınırlı. Bir hydrogels ile hazırlamak için hataları karşılaşabilirsiniz bir modülü tasarım çok yüksek. İkinci olarak, bu hidrojel biyo-böylece uzun vadeli hücre kültürü içinde hidrojel sınırlama parçalanabilir,. Üçüncü olarak, hidrojel Difüzyon endişeli bir 3D çapraz yetiştirme ortamı sunar. Bugüne kadar çoğu biyo analizler, 2D kültür üzerinde temel alır. 3D yapısı daha fazla hücre vivo çalışmalarda ilgili engel.
Bu iletişim kuralı kullanıldığında, izlenmesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, polimer gelator DF PEG sentezi sırasında dehidratasyon çok önemlidir. İkinci olarak, hücre ile ilgili yordamları gerçekleştirirken, steril kritik bir işlemdir. Üçüncü olarak, boyama zaman iyi hydrogels güzel confocal görüntüler elde etmek için kontrol edilmelidir.
Özet olarak, 3D hücre kültürü için bir platform olarak uygulanır ve ayarlanabilir mekanik yardımlar çeşitli araştırmalar için teklif verebilir, kitosan-esaslı enjekte edilebilir hydrogels facile hazırlanması protokol tanıttı. İlaç dağıtım, hücre tedavisi ve sadece performansını bir kanıtıdır, ama aynı zamanda Biyomedikal ap için potansiyel artar tümör kemoterapi ile ilgili alanlarda zaten uygulanmışaçık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Çin tarafından (21474057 ve 21604076) destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S.
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
